基于HOF-PyTTA荧光材料检测三价铁离子与谷胱甘肽的方法与流程

基于hof
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pytta荧光材料检测三价铁离子与谷胱甘肽的方法
1.技术领域
2.本发明涉及三价铁离子与谷胱甘肽的检测，具体是一种基于hof
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pytta荧光材料检测三价铁离子与谷胱甘肽的方法。


背景技术：

3.铁是人体细胞的必需成分，对于人体的生长发育有着举足轻重的作用，它具有造血，参与血红蛋白生成以及细胞色素和各种酶合成的功能，促进人体发育生长。如果人体缺铁就会发生缺铁性的贫血，造成免疫性疾病，新陈代谢紊乱，从而危及生命。如果人体体内铁含量过多，同样会对人体产生危害，会造成心脏、肝脏等器官的功能紊乱，从而影响我们的起居生活。因此，铁的精准检测显得尤为关键，对于环境科学和生命医学领域具有重要意义。
4.谷胱甘肽是人体红细胞内含量最多的非蛋白质硫醇，是为数不多能抵抗细胞内自由基的三肽化合物，是人体内尤为重要的抗氧化物质。谷胱甘肽含量的异常与心脏病、阿尔茨海默病（俗称老年痴呆），甚至是不少癌症及其他疾病都密切相关。为了有效降低此类疾病的发病率，对其进行选择性检测是非常必要的。因此，开发一种灵敏、快捷的谷胱甘肽检测手段具有重要意义。
5.氢键有机骨架材料（hydrogen
‑
bonded organic frameworks, hofs）是通过分子间的氢键相互连接而形成的框架材料，是一种具有灵活氢键的新型材料，它具有温和的合成条件、高度的结晶性、溶剂加工性、容易修复和再生等特点，又因为其制备过程消耗资源较低，所以被视作一个低能耗的再生过程，又由于其具有良好的荧光响应，因此在检测三价铁离子与谷胱甘肽领域具有良好的应用前景。
6.时至今日，在三价铁与谷胱甘肽的定量分析检测上已经应用了不少经典的分析技术，如比色法、质谱法、电化学法、毛细管电泳法、高效液相色谱法和荧光分析法等。但这些技术仍然存在不少的缺点和限制，例如，毛细管电泳和高效液相色谱具有较广的线性范围和良好的选择性，但存在灵敏度低和仪器昂贵等问题。电化学分析法具有快速性和灵敏度的优点，但其选择性较差，电极的修饰工作复杂且耗时。比色法虽然操作简单，但灵敏度低。相互比较之下，荧光分析法具有灵敏度高、操作简便、可靠性高的优点。因此，设计一种免标记的、简单的、响应速度快的分析检测三价铁离子和谷胱甘肽荧光传感器具有重要意义。
7.在已经公开的检测谷胱甘肽的相关专利中，cn111269715a一种比率荧光探针及其在可视化检测谷胱甘肽中的应用，其利用比率探针的蓝色荧光信号充当内标保持稳定，猝灭的橙色荧光被谷胱甘肽恢复，通过测定橙色与蓝色荧光强度比与谷胱甘肽浓度之间的线性关系，实现对谷胱甘肽的定量监测，然而该方法材料合成较为繁琐，检测方法较为复杂。
8.cn112649406a一种利用荧光增强法检测谷胱甘肽的方法，其利用纳米材料在近红外光激发下能发射出可见光的特性，且在含有表面活性剂、阳离子和阴离子的体系可增强
纳米材料的荧光来检测谷胱甘肽，同样该方法材料合成较为繁琐，检测方法较为复杂。
9.cn112342272a一种基于dna纳米机器检测谷胱甘肽的生物传感器，其基于目标物的特异性识别，实现引发链的释放，引发杂交链式反应，实现荧光强度的放大，从而构建了检测谷胱甘肽荧光生物传感器，然而该发明需要在无菌环境下进行，对检测环境要求较高。
10.cn110514632a一种基于荧光共振能量转移的共轭聚合物纳米粒子荧光探针及在检测谷胱甘肽中的应用，该发明利用共轭聚合物纳米粒子荧光探针对谷胱甘肽具有很高的选择性和敏感性来实现对谷胱甘肽的检测，然而该发明的响应速度较慢，且检测项目较单一。
11.cn110006858a一种采用双功能荧光传感器检测铁离子和谷胱甘肽的方法，该发明利用客体分子负载在水滑石主体上，从而制备双功能荧光传感器，实现对三价铁离子与谷胱甘肽的检测，然而该方法材料合成较为复杂。


技术实现要素：

12.本发明针对现有技术的不足，提供一种基于hof
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pytta荧光材料检测三价铁离子与谷胱甘肽的方法。hof
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pytta荧光材料具有良好的乙醇分散性和荧光稳定性，不仅可以检测三价铁离子的含量，而且还能检测谷胱甘肽的含量，从而实现“双功能”检测。
13.实现本发明目的的技术方案是：一种基于hof
‑
pytta荧光材料检测三价铁离子与谷胱甘肽的方法，包括如下步骤：（1）合成hof
‑
pytta荧光材料：（1.1）称取1,3,6,8
‑
四
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(对胺基苯基)
‑
芘（pytta）单体溶解在二甲基甲酰胺（dmf）中， 搅拌，混合均匀得到pytta
‑
dmf混合溶液；（1.2）在pytta
‑
dmf混合溶液中加入乙醇溶液，搅拌均匀，离心，用乙醇和去离子水洗涤；（1.3）将洗涤后的沉淀物置于烘箱，恒温干燥，即合成hof
‑
pytta荧光材料；（2）检测三价铁离子：（2.1）称取fecl3固体溶解在去离子水中，得到fecl3标准溶液，其摩尔浓度为0~ 100mmol/l ；（2.2）将步骤（2.1）配制的fecl3标准溶液，再稀释成不同浓度的fecl3标准溶液；（2.3）将hof
‑
pytta均匀地分散在乙醇中，得到hof
‑
pytta分散液，封存待用；（2.4）检测三价铁离子，离心管中依次添加hof
‑
pytta分散液，不同浓度的fecl3标准溶液，混合均匀，混匀后静置；静置后，在激发波长下扫描其荧光发射光谱，得到荧光变化值；在室温条件下，fecl3的浓度在0
‑
0.08 mmol/l范围内，fecl3浓度和荧光强度成反比关系，通过荧光强度值的变化与fe
3
含量的线性关系实现对三价铁离子的检测；（3）检测谷胱甘肽：（3.1）称取谷胱甘肽溶解在去离子水中，得到谷胱甘肽标准溶液；（3.2）将步骤（3.1）配制的谷胱甘肽标准溶液，再稀释成不同浓度的谷胱甘肽标准溶液；（3.3）检测谷胱甘肽，离心管中依次添加步骤（2.3）制备的hof
‑
pytta分散液和步
骤（2.3）配制fecl3标准溶液，二者混合形成hof
‑
pytta/ fe
3
混合体系，再向混合体系中加入步骤（3.2）配制的不同浓度的谷胱甘肽标准溶液，混合均匀，混匀后静置；若测定谷胱甘肽实际样，则在hof
‑
pytta/ fe
3
混合体系中加入待测谷胱甘肽的实际样品，混合均匀，混匀后静置；静置后，在激发波长下扫描其荧光发射光谱，在室温条件下，加入的谷胱甘肽溶液的浓度会随着hof
‑
pytta/ fe
3
混合体系的荧光强度的升高而逐渐升高；谷胱甘肽的浓度在0~0.50 mmol/l范围内，谷胱甘肽的浓度与hof
‑
pytta的荧光恢复强度值成正比，利用荧光恢复强度值与谷胱甘肽含量的线性关系实现对谷胱甘肽的检测。
14.上述检测方法，步骤（1.1）中，pytta单体与dmf的质量比为1:（1 ~ 1000）；步骤（1.2）中，pytta
ꢀ‑
dmf溶液与乙醇溶液体积比为1:（1 ~1000）。
15.上述检测方法，步骤（2.1）中，fecl3标准溶液的摩尔浓度为（0~ 100）mmol/l ；步骤（2.3）中，hof
‑
pytta与乙醇质量比为1:（10 ~ 1000000）；步骤（2.4）中，hof
‑
pytta分散液与不同浓度的fecl3标准溶液的体积比为1:（0.01~10）。上述检测方法，步骤（3.1）中，谷胱甘肽标准溶液的摩尔浓度为（0
‑
200）mmol/l；步骤（3.3）中，hof
‑
pytta分散液、不同浓度的fecl3标准溶液和不同浓度的谷胱甘肽标准溶液的体积比为1:（0.01~10）:（0.01~10）。
16.本发明检测方法是一种无需标记且操作简便的方法。采用溶剂挥发法制备了具有良好的乙醇分散性和荧光稳定性的氢键有机骨架材料—hof
‑
pytta荧光材料，利用hof
‑
pytta的荧光可被fe
3
猝灭，通过荧光变化值与fe
3
含量的线性关系实现fe
3
的检测。随后，将谷胱甘肽加入到hof
‑
pytta/ fe
3
混合体系中，添加谷胱甘肽后，混合体系荧光强度有明显恢复，加入到混合体系中的谷胱甘肽越多，被释放出来的fe
3
越多。在室温条件下，加入体系中谷胱甘肽的浓度会随着hof
‑
pytta/ fe
3
混合体系的荧光强度的升高而逐渐升高。在一定的浓度范围内，谷胱甘肽的浓度与hof
‑
pytta的荧光恢复强度值成正比，因此可以利用荧光恢复强度值与谷胱甘肽含量的线性关系实现对谷胱甘肽的检测。无需专业人员操作，无需经过专业培训即可完成分析检测任务。
17.本发明检测方法不仅操作便捷，而且具有较快的响应速度。与此同时，本发明hof
‑
pytta荧光材料的合成过程简单,易于推广使用。本发明基于hof
‑
pytta荧光材料，不仅仅可以检测fe
3
的含量，而且还能检测谷胱甘肽的含量，从而实现“双功能”检测，可以为环境及医学领域的检验三价铁和谷胱甘肽需求提供新思路。
附图说明
18.图1为本发明检测方法的流程图；图2为实施例合成的hof
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pytta荧光材料的激发光谱和发射光谱图；图3为实施例中hof
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pytta/fe
3
混合体系的荧光猝灭时间和荧光恢复时间图；其中，a为荧光猝灭时间图，b为荧光恢复时间图；图4为实施例中猝灭剂fecl3的浓度和荧光强度的线性关系图；图5为实施例中hof
‑
pytta/fe
3
混合体系检测谷胱甘肽的线性拟合曲线图；
图6为实施例中不同的金属阳离子对hof
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pytta荧光强度的影响图；图7为实施例中fe
3
对hof
‑
pytta荧光强度的影响图；图8为实施例中不同种类的氨基酸物质和无机盐对hof
‑
pytta/fe
3
混合体系荧光的影响程度图。
具体实施方式
19.下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。
实施例
20.参照图1，基于hof
‑
pytta荧光材料检测三价铁离子与谷胱甘肽的方法，包括如下步骤：（1）合成hof
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pytta荧光材料；将50 mg pytta单体置于玻璃瓶中，溶解在7.5 ml dmf中，搅拌，混合均匀得到pytta
‑
dmf混合溶液；烧杯中加超纯水，将pytta
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dmf混合溶液倒入烧杯中搅拌，加入40ml乙醇溶液，搅拌均匀，混匀后离心，并用乙醇和去离子水依次洗涤；将洗涤后的沉淀物置于烘箱，恒温干燥，即合成hof
‑
pytta荧光材料，其其荧光激发光谱和发射光谱图如图2所示，其最大激发波长为390 nm，最大发射波长为480 nm。特征峰位明显，易于激发。
21.（2）检测三价铁离子：配置摩尔浓度为16 mmol/l的fecl3标准溶液，再将其稀释成不同浓度的标准溶液，储存备用；将1 mg的hof
‑
pytta均匀地分散在1000 ml无水乙醇中，得到浓度为1mg/l 的hof
‑
pytta分散液，待用；向0.5 ml离心管中依次添加 450
ꢀµ
l的hof
‑
pytta分散液，25
ꢀµ
l的fecl3标准溶液（其浓度为1.6 mmol/l），然后将其混合均匀，混匀后静置；静置后，在激发波长下扫描其荧光发射光谱，得到荧光变化值。通过数据分析发现，在0
‑
0.08mmol/l的浓度范围内fecl3浓度和荧光强度成反比关系，且荧光强度与fecl3浓度能拟合出线性方程（r
2 = 0.9835），该线性方程为i =
ꢀ‑ꢀ
4304.55c 821.63（c表示fecl3的浓度，单位为mmol/l；i是hof
‑
pytta / fe
3
混合体系在加入不同浓度fecl3后的荧光强度值），因此可以通过荧光强度值的变化，直接分析出fe
3
含量的多少，从而实现fe
3
的检测。
22.（3）检测谷胱甘肽：配制摩尔浓度为80mmol/l的谷胱甘肽，将其稀释成不同浓度的标准溶液，储存待用；采用步骤（2）制备的hof
‑
pytta分散液，以及稀释后的不同浓度的fecl3标准溶液；向0.5 ml离心管中依次添加450
ꢀµ
l的hof
‑
pytta分散液，25
ꢀµ
l的fecl3溶液（其浓度为1.6 mmol/l）和25
ꢀµ
l不同浓度的谷胱甘肽标准溶液；通过数据分析发现，谷胱甘肽的浓度在0
ꢀ‑ꢀ
0.50 mmol/l范围内时，荧光强度与谷胱甘肽浓度能拟合出线性方程（r2=0.9822），该线性方程为i = 347.773c 495.935（c表
示谷胱甘肽的浓度，单位为mmol/l；i是hof
‑
pytta/fe
3
混合体系在加入不同浓度谷胱甘肽后的荧光强度值）。因此，可以直接通过荧光强度值的变化，快速分析出谷胱甘肽含量的多少，利用荧光恢复强度值与谷胱甘肽含量的线性关系实现对谷胱甘肽的检测，最终达到基于hof
‑
pytta荧光材料同时检测三价铁离子与谷胱甘肽的目的。
23.参照图3，实施例中hof
‑
pytta/fe
3
混合体系的荧光猝灭时间和荧光恢复时间图，其中， a为荧光猝灭时间图，b为荧光恢复时间图；由图3a 与图3b可以得出fe
3
与谷胱甘肽混合体系荧光猝灭及恢复时间极短，因此可以实现快速检测fe
3
与谷胱甘肽的目的。
24.参照图4，实施例中猝灭剂fecl3的浓度和荧光强度的线性关系图，随着fecl3浓度增加，荧光强度逐渐降低，并且fecl3浓度和荧光强度呈线性关系，为提高传感器的灵敏性，选择0.08mmol/l作为猝灭剂fecl3的浓度来有效猝灭hof
‑
pytta的荧光。
25.参照图5，实施例中hof
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pytta/fe
3
混合体系检测谷胱甘肽的线性拟合曲线图；从图5得知，谷胱甘肽的浓度在0~0.50 mmol/l范围内时，荧光强度与谷胱甘肽浓度呈线性关系。根据公式可以实现对谷胱甘肽的准确检测。
26.参照图6，实施例中不同的金属阳离子对hof
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pytta荧光强度的影响图；从图6得出不同金属阳离子对hof
‑
pytta溶液体系的荧光影响不同，加入fecl3体系的荧光强度明显比其他金属盐溶液的荧光强度低很多。适量fecl3可以营造一个较低的荧光背景。
27.参照图7，实施例中fe
3
对hof
‑
pytta的荧光猝灭效果(a)和随后向该猝灭系统中添加还原型谷胱甘肽(b)后其hof
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pytta的荧光响应情况。实验时，向hof
‑
pytta/fe
3
混合体系中添加还原型谷胱甘肽，结果hof
‑
pytta/fe
3
混合体系的荧光强度有明显恢复。因此，hof
‑
pytta体系可以实现精准、快速检测fe
3
含量的目的。
28.实验还探究了机体含有的不同种类的氨基酸物质和某些无机盐对hof
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pytta/fe
3
混合体系荧光的影响程度，以验证hof
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pytta对谷胱甘肽的特异性识别。由图8可知，终浓度为0.5 mmol/l 谷胱甘肽体系的
횫
i最大。不少氨基酸对该荧光传感器有响应，但在实际应用中，还原型谷胱甘肽的终浓度会高于0.5 mmol/l，荧光响应也会比实验中高，所以其他氨基酸干扰到还原型谷胱甘肽特异性检测的可能性很小。而葡萄糖、抗坏血酸、镁盐、钾盐、钙盐和钠盐等物质在如此高浓度下对该混合体系的荧光影响很小，在实际应用中可以忽略不计。