新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒及其检测方法与流程

1.本发明涉及免疫分析检测技术领域，具体为一种新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.新冠肺炎(covid
‑
19)是由新型冠状病毒(sars
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cov
‑
2)感染导致的一种传染性疾病。该疾病具有传染力强，病毒传播及变异速度快等特征。截止到2021年7月16日，全球新冠肺炎感染累积病例已达1.89亿，因感染导致死亡人数已达408万。新冠肺炎已成为一种严重威胁人类健康的重大传染性疾病。
3.目前对于新冠肺炎的临床治疗尚无有效的病毒特异性化学药物出现。大量的临床及真实世界研究结果表明疫苗是人类对抗新冠肺炎重症发生及死亡最有效的武器，另外新冠肺炎康复者血清对治疗新冠肺炎重症感染也具有一定的疗效。中和抗体是具有阻断病毒感染宿主细胞功能的一类抗体。新冠病毒特异性中和抗体主要通过与病毒刺突蛋白s1亚基(简称s1蛋白)内的受体结合区(receptor binding domain,简称rbd)上的某些位点结合而抑制rbd与宿主细胞表面的新冠病毒受体人血管紧张素转化酶2蛋白(ace2)结合，从而抑制新冠病毒感染病毒宿主细胞。新冠病毒特异性中和抗体是目前唯一明确的保护相关性免疫反应，被认为在疫苗诱导的免疫保护和康复病人血浆过继治疗中发挥着重要的作用。而且病毒特异性中和抗体水平已经成为评价新冠疫苗免疫效果的重要指标。
4.目前，检测新冠病毒血清中和抗体的标准方法为新冠活病毒或假病毒感染病毒受体表达细胞滴定法，这两种方法检测灵敏度高、准确，但分别需要生物安全iii和ii级实验室进行实验，且检测时间要长达2
‑
3天，同时检测价格高。因此这两种检测方法无法应用于新冠疫苗对大规模人群接种后各地方疾控中心或医院对当地疫苗接种者体内血清病毒特异性中和抗体的滴度变化进行快速跟踪评价或对新冠感染康复者血清内的中和抗体进行大规模平行比较鉴定。
5.近期通过新冠肺炎感染者感染期血清样品进行研究的数据表明功能酶联免疫方法(功能elisa)可以快速检测新冠肺炎感染者血清内新冠病毒特异性中和性抗体。该方法把新冠病毒受体蛋白ace2固相于96孔板内，通过评价新冠肺炎感染者血清抑制游离rbd蛋白与固相ace2蛋白结合的活性而检测血清样品中新冠病毒中和抗体的滴度。该方法可在几小时内完成新冠病毒中和抗体滴定，而且对于新冠肺炎感染康复血清样品及疫苗免疫后血清样品无需生物安全ii级实验室及以上级别生物安全实验室操作。因此该方法相对于活病毒细胞病变检测法或假病毒报告基因检测法具有检测快速、方便的优势。以该技术为基础，金斯瑞公司生产出“sars
‑
cov
‑
2surrogate virus neutralization test kit”新冠病毒中和抗体检测试剂盒。但是最新研究结果表明该试剂盒对于中和抗体滴度较低的新冠病毒感染早期的血清样品检测灵敏性方面仍有不足。在后续的研究中以新冠病毒受体/配体结合阻断策略为基础发展出多种新冠病毒中和抗体检测技术。如以稳定表达ace2的细胞系、荧光标记s1蛋白及流式细胞分析仪为检测系统的中和抗体检测方法；以固相有s蛋白三聚体
的luminex微球、荧光标记ace2蛋白及荧光读板机为检测系统的中和抗体检测方法等。然而这些新的中和抗体检测方法与功能elisa方法相比检测灵敏性并无显著的提高或没有数据表明可以提高检测灵敏性。因此发展一种高灵敏新冠病毒中和抗体检测方法及检测试剂盒具有重要检测价值和市场需求。除此之外，目前的功能elisa检测方法的重组蛋白需求量大，导致检测成本较高，从而不具有性价比优势。


技术实现要素：

6.针对目前检测新冠病毒血清中和抗体方法灵敏性不足以及目前功能elisa检测方法对重组蛋白需求量大，导致检测成本较高，从而不具有性价比优势等问题，本发明提供了一种新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒及其检测方法。
7.为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
8.本发明新型冠状病毒中和抗体检测的基本原理：
9.以新冠病毒受体/配体结合阻断策略为基础，以固相有ace2蛋白的磁珠和rbd
‑
mfc为检测体系，利用新冠病毒中和抗体会阻断rbd
‑
mfc与ace2磁珠结合的原理，再通过荧光物质标记动物抗鼠的igg抗体与rbd
‑
mfc结合，从而可对与rbd
‑
mfc发生结合的ace2磁珠进行荧光标记，最后通过流式细胞仪对磁珠荧光染色水平进行分析，根据待测样品中新冠病毒中和抗体活性与磁珠荧光染色水平负相关这一原理来确定待测样品中新冠病毒中和抗体的活性。
10.但是与目前其他以新冠病毒受体/配体结合阻断策略为基础所发展出的各类新冠病毒中和抗体检测技术不同，本专利发明人通过深入实验研究首次发现对于以固相的新冠病毒受体(ace2)结合游离的配体(新冠病毒s1蛋白或是rbd蛋白)为体系的新冠病毒中和抗体检测技术(如功能elisa中和抗体检测试剂盒)，其检测灵敏性与游离的配体浓度成负相关。并且发明人把该规律应用于新冠病毒中和抗体检测技术和试剂盒研发的设计中来，在本发明中通过以下两种策略的应用使中和抗体检测试验中的游离配体(rbd
‑
mfc)的终浓度极低，从而使本发明具有高水平的新冠病毒中和抗体检测敏感性。(1)在检测中使用少量的ace2磁珠可使rbd
‑
mfc最优使用浓度降低，检测结果以流式细胞仪进行分析可保证对少量的ace2磁珠进行有效定量分析；(2)在对磁珠荧光染色水平进行分析的时候使用磁珠荧光百分率分析方法代替磁珠平均荧光密度分析方法可进一步降低中和抗体检测中rbd
‑
mfc的最优使用浓度。如果以磁珠平均荧光密度分析法对中和抗体活性进行分析时，应以rbd
‑
mfc与绝大多数ace2磁珠发生饱和结合的临界浓度为中和抗体检测中的rbd
‑
mfc终浓度；如果以磁珠荧光百分率分析方法对中和抗体活性进行分析时，应以rbd
‑
mfc可与绝大多数ace2磁珠发生结合(>90％结合率)的临界浓度为中和抗体检测中的rbd
‑
mfc终浓度。因为rbd
‑
mfc可与绝大多数ace2磁珠发生结合(>90％结合率)的临界浓度要远远小于rbd
‑
mfc与绝大多数ace2磁珠发生饱和结合的临界浓度，所以本发明以磁珠荧光百分率分析方法对中和抗体活性进行分析可有效降低rbd
‑
mfc在中和抗体检测中的使用终浓度。
11.本发明提供一种新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒，包括：ace2蛋白磁珠、新型冠状病毒s1蛋白rbd结构域
‑
鼠igg fc片段融合蛋白、荧光物质标记的动物抗鼠igg抗体、新型冠状病毒中和抗体阳性标准品、新型冠状病毒中和抗体阴性标准品、鼠igg同型对照抗体、10x浓缩洗液和样品稀释液。
12.进一步，所述ace2蛋白磁珠通过以下方法制备得到：将12.5μg固相有链霉亲和素的磁珠(sa磁珠)与375ng预生物素化的重组人ace2蛋白在25μl0.01m ph值为7.2
‑
7.4的磷酸盐缓冲液中室温下共孵育40min，在共孵育20min后吹吸重悬一次，共孵育后把固相有ace2蛋白的链霉亲和素的磁珠转入一个新的容器中，置于2
‑
8℃，当磁珠完全沉降于底部后，吸弃上清，以100μl含质量体积百分比0.02％叠氮化钠的样品稀释液重悬磁珠沉淀，制备成ace2蛋白磁珠。
13.进一步，所述新型冠状病毒s1蛋白rbd结构域
‑
鼠igg fc片段融合蛋白(即rbd
‑
mfc蛋白)为新型冠状病毒刺突蛋白rbd结构域的c端与鼠igg1 fc片段进行融合表达的重组蛋白，生产于哺乳动物细胞，保存于蛋白/抗体储存液中，保存终浓度为10
‑
50μg/ml，使用终浓度为1.5
‑
6ng/ml；所述鼠igg同型对照抗体的使用终浓度为1.5
‑
6ng/ml。
14.进一步，所述蛋白/抗体储存液为用含质量体积百分比为0.02
‑
0.05％叠氮化钠的ph值为7.4的0.01m磷酸盐缓冲液制备的质量体积比为1％的牛血清白蛋白(bsa)液。
15.进一步，所述荧光物质标记的动物抗鼠igg抗体保存于蛋白/抗体储存液，保存终浓度为50
‑
500μg/ml；所述荧光物质标记动物抗鼠igg抗体中的荧光物质包括荧光染料、荧光蛋白、荧光染料/荧光蛋白合成物及量子点；所述荧光物质标记动物抗鼠igg抗体中的动物包括山羊、绵羊、牛、驴、兔、大鼠及羊驼。
16.进一步，所述新型冠状病毒中和抗体阳性标准品为人源或兔源抗新型冠状病毒igg单克隆中和抗体；所述新型冠状病毒中和抗体阴性标准品为人igg或兔igg同型对照抗体。
17.进一步，所述样品稀释液为含质量体积百分比为0.1
‑
0.5％牛血清白蛋白的0.01m磷酸盐缓冲液，ph值为7.2
‑
7.4；所述10x浓缩洗液为含有质量体积百分比为1％的牛血清白蛋白、体积百分比为0.25％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液，ph值为7.4。
18.进一步，所述固相有链霉亲和素的磁珠直径为1
‑
3μm；所述预生物素化的重组人ace2蛋白为人ace2的gln18
‑
ser740部分在其c端与avi标签进行融合表达的重组蛋白，该蛋白在生物素连接酶的作用下被生物素标记，生产于哺乳动物细胞。
19.本发明还提供一种新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测方法，包括以下步骤：
20.步骤1，用样品稀释液分别稀释新型冠状病毒s1蛋白rbd结构域
‑
鼠igg fc片段融合蛋白、鼠igg同型对照抗体、待测样品、新型冠状病毒中和抗体阳性标准品或新型冠状病毒中和抗体阴性标准品；
21.步骤2，向圆底96孔板板孔中加入50μl步骤1稀释后的新型冠状病毒s1蛋白rbd结构域
‑
鼠igg fc片段融合蛋白和50μl步骤1稀释后的待测样品、新型冠状病毒中和抗体阳性标准品或新型冠状病毒中和抗体阴性标准品；另取一孔加入100μl终浓度与新型冠状病毒s1蛋白rbd结构域
‑
鼠igg fc片段融合蛋白终浓度相同的鼠igg同型对照抗体，用封板膜或锡箔纸把96孔板封好后放于37℃保温箱孵育30min；
22.步骤3，以1μl磁珠液/反应孔计算出所需ace2蛋白磁珠总体积，根据计算结果取出ace2蛋白磁珠放入96孔板，用样品稀释液清洗磁珠两次，磁极吸附磁珠，吸弃上清液，加入样品稀释液重悬磁珠，以5μlace2蛋白磁珠液/反应孔加入步骤2中的各处理孔中，轻轻吹匀，把96孔板放置于室温共孵育30mim；
23.步骤4，把96孔板放在磁力架上吸附3min，吸弃上清液，保留磁珠，用200μl 1x浓缩
洗液清洗磁珠；
24.步骤5，重复步骤4清洗磁珠2遍后，向孔中加入100μl用样品稀释液稀释的终浓度为0.4
‑
1μg/ml的荧光物质标记动物抗鼠igg抗体，室温避光孵育20min；
25.步骤6，按照步骤4清洗磁珠2遍后，用200μl 1x浓缩洗液重悬磁珠，用流式细胞分析仪对磁珠进行检测并根据检测数据对磁珠荧光染色百分率进行分析。
26.进一步，在用流式细胞分析仪对磁珠进行检测时，首先通过调节电压在fsc和ssc门中找到并圈定磁珠群，再从磁珠群收集2000个或以上磁珠，并对所收集磁珠在荧光物质标记动物抗鼠igg抗体相对应的荧光通路对磁珠阳性染色百分率进行分析；
27.对流式检测数据进行分析时，以鼠igg同型对照抗体处理磁珠样品为阴性对照，在其荧光染色组方图的右端画门，在此门以右部分确认为荧光阳性染色部分，此门以左为荧光阴性染色部分；以该门为参考对其它各样品的磁珠阳性染色百分率进行分析，要求检测结果同时满足新型冠状病毒中和抗体阴性标准品处理磁珠样品的磁珠阳性染色百分率>90％，新型冠状病毒中和抗体阳性标准品处理磁珠样品的磁珠阳性染色百分率<10％；
28.待测样品对rbd
‑
mfc与ace2磁珠结合的阻断活性(磁珠荧光染色百分率)计算公式为：(新型冠状病毒中和抗体阴性标准品处理磁珠样品的磁珠阳性百分率
‑
待测样品处理磁珠样品的磁珠阳性百分率)/新型冠状病毒中和抗体阴性标准品处理磁珠样品的磁珠阳性百分率x 100。
29.与现有技术相比本发明具有以下优点：
30.1、本发明提供了一种高灵敏性、特异性和准确性的检测新冠病毒中和抗体的试剂盒和方法。通过与目前灵敏度较高的功能elisa检测试剂盒相比，本发明ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒对疫苗免疫后血清和新冠患者康复后血清检测灵敏性分别提高了4倍和3.3倍；通过疫苗免疫者血清和健康对照者血清检测结果，表明本发明试剂盒和方法对新冠病毒中和抗体的检测特异性为100％；通过与假病毒中和抗体检测法对相同血清样品的检测结果作相关性分析，相关系数(r)为0.799，p＝0.0004，表明本发明试剂盒和方法具有很好的检测准确性。因此本发明可填补目前新冠病毒中和抗体快速检测试剂盒市场上高灵敏性产品的缺口。
31.2、本发明试剂盒rbd
‑
mfc与ace2磁珠发生优化结合的终浓度为2ng/ml，而目前市售新冠病毒中和抗体功能elisa检测试剂盒的rbd重组蛋白(hrp标记)检测时的终浓度为60ng/ml。本发明试剂盒rbd
‑
mfc与ace2磁珠发生优化结合的终浓度相对于rbd重组蛋白与板孔内固相的重组ace2蛋白发生优化结合的终浓度要低30倍。表明本发明试剂盒内每个检测反应只需使用极低数量的ace2磁珠和重组新冠病毒刺突蛋白，降低了检测成本，结合灵敏度实验结果，说明本发明试剂盒和检测方法具有更好的性价比优势。
32.3、本发明在研究不同浓度rbd
‑
mfc对本发明试剂盒检测新冠病毒中和抗体灵敏性的影响时，意外发现本发明试剂盒检测灵敏性与游离新冠病毒配体蛋白(rbd
‑
mfc)的浓度成反比这一规律；表明低浓度rbd
‑
fc蛋白不仅能使检测的成本进一步降低，而且可以极大地提高新冠病毒中和抗体的检测灵敏性，取得了意想不到的技术效果。
附图说明
33.图1为不同浓度rbd
‑
mfc与ace2磁珠结合百分率图。其中左图为流式检测数据组方
图分析结果；右图为组方图数据经数据分析软件处理后制备的曲线图。
34.图2为rbd
‑
mfc浓度对本发明试剂盒检测新冠病毒中和抗体灵敏性的影响。
35.图3为ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒对系列稀释的6号和8号疫苗血清样品、新冠病毒中和抗体阳性标品和阴性标品阻断rbd
‑
mfc与ace2磁珠结合活性进行检测的结果图。为了方便对数据进行展示在图中只展示了每个样品单孔检测的数据。
36.图4为功能elisa试剂盒对系列稀释的6号和8号疫苗血清样品、新冠病毒中和抗体阳性标品和阴性标品阻断rbd
‑
mfc与ace2结合活性进行检测的结果图。左图为检测结果用相机直接拍照后照片，右图为检测结果用酶标仪读板后各孔的od值。
37.图5为ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒与功能elisa试剂盒检测7个疫苗免疫血清和4个新冠感染康复后血清样品的结合阻断曲线。图中a
‑
g：根据两个试剂盒对7个疫苗免疫血清的检测数据所绘制的rbd
‑
mfc/ace2磁珠结合阻断曲线及根据各自曲线所算出的两个ic50值；h
‑
k：根据两个试剂盒对4个新冠感染康复后血清的检测数据所绘制的rbd
‑
mfc/ace2磁珠结合阻断曲线。
38.图6为ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒与功能elisa试剂盒检测血清样品的ic50比较图。图中a为两个试剂盒对7个疫苗免疫血清检测的ic50比较图；b为两个试剂盒对4个新冠感染康复后血清检测的ic50比较图；c为ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒与功能elisa试剂盒检测相同血清样品所测ic50数值的比值图。
39.图7为实施例4所测试剂盒检测特异性分析结果图。
40.图8为实施例5所测试剂盒检测准确性分析结果图。
41.图9为实施例6所测不同浓度s1
‑
mfc与ace2磁珠结合百分率图。其中左图为流式检测数据组方图分析结果；右图为组方图数据经数据分析软件处理后制备的曲线图。
42.图10为实施例7所测s1
‑
mfc浓度对ace2磁珠/s1
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mfc新冠病毒中和抗体试剂盒检测灵敏性影响的结果图。
43.图11为实施例8所测不同浓度人源化新冠病毒单克隆中和抗体对s1
‑
mfc与ace2磁珠结合的阻断活性曲线图。
44.图12实施例9所测ace2磁珠/rbd
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mfc试剂盒与ace2磁珠/s1
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mfc试剂盒检测血清样品的ic50值比较图。图中a为两个试剂盒对12个疫苗免疫血清检测的ic50值比较图；b为两个试剂盒对11个新冠感染康复后血清检测的ic50值比较图；c为ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒与ace2磁珠/s1
‑
mfc试剂盒检测血清样品的ic50比值图。
具体实施方式
45.本发明提供的检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒(以下简称ace2磁珠/rbd
‑
mfc中和抗体检测试剂盒)包括：ace2蛋白磁珠、新型冠状病毒s1蛋白rbd结构域
‑
鼠igg fc片段融合蛋白(rbd
‑
mfc)、荧光物质标记的动物抗鼠igg抗体、新型冠状病毒中和抗体阳性标准品、新型冠状病毒中和抗体阴性标准品、鼠igg同型对照抗体、10x浓缩洗液和样品稀释液。
46.在具体实施方式所有相关试验中，若未特殊指明，本发明提供的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒中各组分具体如下：
47.1、ace2蛋白磁珠：由12.5μg固相有链霉亲和素的磁珠(sa磁珠)与375ng预生物素化的重组人ace2蛋白在25μl 0.01m磷酸盐缓冲液(ph值为7.2
‑
7.4)中室温下共孵育40min，
在共孵育20min后吹吸重悬一次；共孵育后把固相有ace2蛋白的sa磁珠转入一个新的微量离心管中，2
‑
8℃冷藏保存；当磁珠完全沉降于微量离心管底部后，吸弃上清，以100μl含0.02％叠氮化钠的样品稀释液重悬磁珠沉淀，制备成ace2蛋白磁珠。其中sa磁珠为invitrogen公司产品dynabeads
tm
myone
tm
streptavidin t1(货号为65601)，该磁珠的直径为1μm；其中预生物素化人ace2蛋白购于kactus biosystem公司(货号为ace
‑
hm401)。
48.2、rbd
‑
mfc购于北京义翘神州公司(货号：40592
‑
v05h)，rbd
‑
mfc蛋白保存于蛋白/抗体储存液，保存浓度为20μg/ml。
49.3、荧光物质标记的动物抗鼠igg抗体为af488标记的山羊抗鼠igg抗体，购于thermofisher公司(货号：a32723)。抗体保存于蛋白/抗体储存液，浓度为100μg/ml。
50.4、新型冠状病毒中和抗体阳性标准品为一株具有新冠病毒中和抗体活性的兔igg单克隆抗体(克隆号：001)，购自北京义翘神州公司(货号：40592
‑
r001)。抗体稀释并保存于蛋白/抗体储存液，浓度为50μg/ml。
51.5、新型冠状病毒中和抗体阴性标准品为一株兔igg单克隆同型对照抗体(克隆号：da1e)，购自cell signaling公司(货号：3900s)。抗体稀释并保存于蛋白/抗体储存液，浓度为50μg/ml。
52.6、上述鼠igg同型对照抗体为一株鼠igg1单克隆同型对照抗体(克隆号：mopc
‑
21)，购自biolegend公司(货号：400101)。抗体稀释并保存于蛋白/抗体储存液，浓度为100μg/ml。
53.7、10x浓缩洗液为含有1％牛血清白蛋白(w/v)、0.25％吐温20(v/v)的0.1m磷酸盐缓冲液，ph值为7.4，浓缩洗液用去离子水稀释10倍成1x洗液后使用。
54.8、样品稀释液为含0.1％bsa(w/v)的0.01m磷酸盐缓冲液(pbs)，ph值为7.4。
55.下面结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行具体、详细的说明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除所用血清样品外原料均为市售产品。新冠灭活疫苗接种者两次免疫后第14天血清样品为发明人在xx大学采集并保存，血清样品编号为ym
‑
n(yimao
‑
序号)。新冠病毒感染者康复后血清由xx医院提供，血清样品编号为kf
‑
n(kangfu
‑
序号)。健康对照血清为无新冠病毒感染记录的健康者血清。
56.在用流式细胞分析仪检测时首先通过调节电压在fsc和ssc门中找到并圈定磁珠群，再从磁珠群收集2000个或以上磁珠，并对所收集磁珠在荧光物质标记动物抗鼠igg抗体相对应的荧光通路对磁珠荧光阳性染色百分率进行分析。
57.对流式检测数据进行分析时，以鼠igg同型对照抗体处理磁珠样品为阴性对照，在其荧光染色组方图的右端画门。在此门以右部分确认为荧光阳性染色部分，此门以左为荧光阴性染色部分。以该门为参考对其它各样品的磁珠阳性染色百分率进行分析。要求检测结果同时满足新型冠状病毒中和抗体阴性标准品处理磁珠样品的磁珠阳性染色百分率>90％,新型冠状病毒中和抗体阳性标准品处理磁珠样品的磁珠阳性染色百分率<10％。
58.待测样品对rbd
‑
mfc与ace2磁珠结合的阻断活性(百分率)计算公式为：(新型冠状病毒中和抗体阴性标准品处理磁珠样品的磁珠阳性染色百分率
‑
待测样品处理磁珠样品的磁珠阳性染色百分率)/新型冠状病毒中和抗体阴性标准品处理磁珠样品的磁珠阳性染色百分率x 100
59.实施例1
60.rbd
‑
mfc蛋白与绝大部分ace2蛋白磁珠发生高台水平结合的临界浓度具体操作步骤如下：
61.(1)用样品稀释液将rbd
‑
mfc重组蛋白稀释成一系列浓度梯度，浓度分别为2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、12ng/ml和16ng/ml。用样品稀释液将鼠igg1同型对照抗体稀释成浓度为16ng/ml。
62.(2)把在步骤(1)中稀释的各浓度rbd
‑
mfc及鼠igg同型对照抗体以50μl/孔加入到圆底96孔板，每个浓度样品以复孔进行实验。
63.(3)重悬ace2磁珠，以1μl/反应吸取ace2磁珠液，用200μl样品稀释液在圆底96孔板内对ace2磁珠进行清洗，清洗两遍。在吸弃上清洗液时通过磁极板吸附把磁珠留存于孔内。
64.(4)把96孔板从磁极上取下，用样品稀释液重悬清洗后的ace2蛋白磁珠，以5μl磁珠重悬液/孔把磁珠加入到各浓度rbd
‑
mfc稀释液或鼠igg同型对照抗体稀释液中。轻吹混匀后，室温下孵育30分钟。
65.(5)把96孔板放在磁力架上吸附3min，吸弃上清液，保留磁珠。取下96孔板，以200μl 1x浓缩洗液/孔清洗磁珠2遍。
66.(6)吸弃各孔上清液后，向各孔中加入100μl以样品稀释液稀释的终浓度为0.5μg/ml的af488标记的山羊抗鼠igg抗体。室温避光孵育20min。
67.(7)重复步骤(5)，吸弃各孔上清液后，用200μl 1x浓缩洗液重悬磁珠，用流式细胞分析仪对磁珠进行检测并根据检测数据用flowjo x软件对磁珠荧光染色百分率进行分析。
68.由图1可以观察到在rbd
‑
mfc蛋白终浓度为1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、6ng/ml、8ng/ml时，rbd
‑
mfc与ace2磁珠平均结合率分别为44.3％、94.5％、96.3％、97.6％和97.6％。这些数据表明rbd
‑
mfc与绝大多数ace2磁珠发生高台水平结合的临界浓度为2ng/ml。
69.实施例2
70.不同浓度rbd
‑
mfc对本发明试剂盒检测新冠病毒中和抗体灵敏性的影响
71.本实施例方案操作步骤如下：
72.(1)用样品稀释液分别把新冠病毒中和抗体阳性标准品和阴性标准品稀释成浓度依次为5ng/ml、15ng/ml、45ng/ml、135ng/ml、400ng/ml、1200ng/ml和3600ng/ml的抗体稀释液，把各浓度新冠病毒中和抗体阳性标品稀释液和阴性标品稀释液以50μl/孔加入圆底96孔板，每个抗体浓度加复孔；
73.(2)用样品稀释液分别稀释rbd
‑
mfc及鼠igg同型对照抗体至浓度依次为4ng/ml、100ng/ml、200ng/ml及2000ng/ml，把每个浓度的rbd
‑
mfc及鼠igg同型对照抗体稀释液以50μl/孔分别加入到步骤(1)中准备的系列浓度的中和抗体阳性标品和阴性标品稀释液中，轻轻吹匀，把孔板用锡箔纸包好后放置于细胞培养箱37℃共孵育30分钟。rbd
‑
mfc及鼠igg同型对照抗体经与新冠病毒中和抗体阳性标品或阴性标品等体积混合后终浓度变为2ng/ml、50ng/ml、100ng/ml或1000ng/ml；同时新冠病毒中和抗体阳性标品或阴性标品的终浓度变为2.5ng/ml、7.5ng/ml、22.5ng/ml、67ng/ml、200ng/ml、600ng/ml和1800ng/ml；
74.(3)在新冠病毒中和抗体标准品与rbd
‑
mfc或鼠igg同型对照抗体共孵育的过程中，用样品稀释液对ace2蛋白磁珠进行清洗，重悬ace2蛋白磁珠成磁珠悬液，以1μl/反应吸
取一定体积的ace2蛋白磁珠液至圆底96孔板内，用200μl样品稀释液对ace2蛋白磁珠进行清洗，清洗两遍。在吸弃上清洗液时通过磁极板吸附把磁珠留存于孔内；
75.(4)用样品稀释液重悬ace2蛋白磁珠成悬液，以5μl磁珠悬液/反应把ace2蛋白磁珠加入步骤(2)制备的新冠病毒中和抗体阳性标品或阴性标品与不同浓度的rbd
‑
mfc或鼠igg同型对照抗体共孵育混合物中。另外把磁珠悬液加入100μl浓度分别为2ng/ml、50ng/ml、100ng/ml及1000ng/ml的rbd
‑
mfc或鼠igg同型对照抗体稀释液中。轻轻吹匀，室温下共孵育30分钟。
76.(5)把96孔板放在磁力架上吸附3min，吸弃上清液，保留磁珠。取下96孔板，以200μl 1x浓缩洗液/孔清洗磁珠2遍。
77.(6)吸弃各孔上清液后，向各孔中加入100μl用样品稀释液稀释的终浓度为0.5μg/ml的af488标记的山羊抗鼠igg抗体，室温避光孵育20min。
78.(7)重复步骤(5)，吸弃各孔上清液后，用200μl 1x浓缩洗液重悬磁珠，用流式细胞分析仪对磁珠进行检测并根据检测数据用flowjo x软件对磁珠阳性染色百分率进行分析。
79.待测样品对rbd
‑
mfc与ace2磁珠结合的阻断活性(百分率)计算公式为：(新型冠状病毒中和抗体阴性标品处理磁珠样品的磁珠阳性染色百分率
‑
新冠病毒中和抗体阳性标品处理磁珠样品的磁珠阳性染色百分率)/新型冠状病毒中和抗体阴性标准品处理磁珠样品的磁珠阳性染色百分率x 100。
80.(8)使用graphpad prism 7.00软件根据不同浓度条件下新冠病毒中和抗体阳性标品阻断rbd
‑
mfc与ace2磁珠结合率数据绘制四参数阻断率拟合曲线。对rbd
‑
mfc终浓度为2ng/ml、50ng/ml、100ng/ml及1000ng/ml时，分别绘制新冠病毒中和抗体阳性标品的结合阻断率四参数拟合曲线，并根据所得四参数拟合曲线计算出当rbd
‑
mfc终浓度为2ng/ml、50ng/ml、100ng/ml及1000ng/ml时新冠病毒中和抗体阳性标品的ic50值(50％阻断率)。四参数拟合曲线方程公式为：y＝bottom (top
‑
bottom)/(1 10^((logic50
‑
x)*hillslope))
81.由图2可得，当rbd
‑
mfc浓度为2ng/ml、50ng/ml、100ng/ml及1000ng/ml时，新冠病毒中和抗体阳性标品的ic50值分别为5.97ng/ml、86.59ng/ml、314.7ng/ml及3390ng/ml。表明ace2磁珠/rbd
‑
mfc中和抗体检测试剂盒对新冠病毒中和抗体的检测灵敏性随着检测试验中rbd
‑
mfc终浓度的减少而提高。
82.实施例3
83.ace2磁珠/rbd
‑
mfc新冠病毒中和抗体检测试剂盒检测灵敏性评价
84.在本实施例中以一个市售的新冠病毒中和抗体功能elisa检测试剂盒(金斯瑞公司产品sars
‑
cov
‑
2surrogate virus neutralization test kit货号：l00847
‑
a，由金斯瑞生物科技公司生产，货号：l00847a)为参考，评价本发明所建立的ace2磁珠/rbd
‑
mfc新冠病毒中和抗体检测试剂盒的检测灵敏性。在本实施例中以一株具有新冠病毒中和活性的人源化单克隆抗体(acrobiosystems公司，货号cat:sad
‑
s35)和一株人igg1同型对照抗体“human igg 1,k isotype control”(biolegend公司，货号cat403502)作为ace2磁珠/rbd
‑
mfc中和抗体检测试剂盒中的ace2磁珠/rbd
‑
mfc中和抗体检测试剂盒中的新冠病毒中和抗体阳性标准品和新冠病毒中和抗体阴性标准品。为了方便起见，ace2磁珠/rbd
‑
mfc中和抗体检测试剂盒和新型冠状病毒中和抗体功能elisa检测试剂盒简称为ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒和功能elisa试剂盒。
85.本实施例通过本发明ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒和功能elisa试剂盒对相同一组新冠疫苗接种者血清样品和一组新冠感染者康复后血清样品进行中和抗体活性检测，通过两种试剂盒对同一血清样品所测的ic50数值进行比较以评价ace2磁珠/rbd
‑
mfc中和抗体检测试剂盒的检测敏感性。
86.具体实施步骤如下：
87.(一)ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒检测血清样品中和抗体活性的步骤：
88.1、以样品稀释液稀释疫苗接种者血清样品2.5倍、7.5倍、22.5倍、67.5倍、202.5倍及607.5倍。以样品稀释液稀释新冠感染者康复后血清样品15倍、45倍、135倍、405倍、1215倍及3645倍。以样品稀释液稀释新冠病毒中和抗体阳性标准品和阴性标准品分别至60ng/ml。以50μl/孔把稀释后血清、新冠病毒中和抗体阳性标品及新冠病毒病毒中和抗体阴性标品分别加入圆底96孔板孔内。每个样品加复孔。
89.2、以样品稀释液把rbd
‑
mfc稀释至4ng/ml，以50μl/孔把rbd
‑
mfc稀释液加入步骤(1)中制备的血清稀释液及中和抗体阳性标品和中和抗体阴性标品稀释液中，吹匀混匀，此时rbd
‑
mfc终浓度为2ng/ml。把96孔板用锡箔纸包好后放入37℃共孵育30分钟。
90.步骤3
‑
7同实施例2的步骤3
‑
7。
91.8、使用graphpad prism 7.00软件根据某血清样品在不同稀释倍数条件下阻断rbd
‑
mfc与ace2磁珠结合率数据绘制四参数阻断率拟合曲线。同时根据所得四参数拟合曲线计算出该血清样品的ic50值(50％阻断率)。四参数拟合曲线方程公式为：y＝bottom (top
‑
bottom)/(1 10^((logic50
‑
x)*hillslope))。
92.(二)对于功能elisa试剂盒实施步骤参考该试剂盒说明书，简述如下：
93.1、以样品稀释液稀释疫苗接种者血清样品2.5倍、7.5倍、22.5倍、67.5倍、202.5倍及607.5倍。以样品稀释液稀释新冠感染者康复后血清样品15倍、45倍、135倍、405倍、1215倍及3645倍。
94.2、将阳性对照、阴性对照、血清稀释样品与稀释好的hrp
‑
rbd(体积比1：1)混合在试管中，37℃孵育30min。
95.3、将阳性对照混合物、阴性对照混合物、样品混合物各100μl加入预包被有ace2重组蛋白的96孔板孔中，37℃孵育30min。
96.4、每孔用260μl的1
×
洗涤液清洗4次。
97.5、每孔加入100μl的tmb溶液，室温避光孵育15min。
98.6、每孔加入50μl的停止液，停止反应。
99.7、酶联免疫检测仪，在5min内快速读板。
100.8、待测血清样品对rbd
‑
hrp与ace2结合的阻断活性(百分率)计算公式为：
101.rbd
‑
hrp与ace2结合阻断率＝(1
‑
(样品od值/阴性对照od值))
×
100％
102.9、使用graphpad prism 7.00软件根据某血清样品在不同稀释倍数条件下阻断rbd
‑
mfc与ace2结合率数据绘制四参数阻断率拟合曲线。同时根据所得四参数拟合曲线计算出该血清样品的ic50值(50％阻断率)。四参数拟合曲线方程公式为：y＝bottom (top
‑
bottom)/(1 10^((logic50
‑
x)*hillslope))。
103.表1 ace2磁珠\rbd
‑
mfc试剂盒检测6号、8号疫苗免疫血清中和抗体活性时各样品磁珠荧光阳性染色百分率(％)
[0104][0105]
表2功能elisa试剂盒检测6号、8号疫苗免疫血清中和抗体活性时各样品对rbd
‑
hrp与ace2结合的阻断活性(％)
[0106][0107]
结合表1及图3结果表明血清对rbd
‑
mfc与ace2磁珠结合的阻断活性与磁珠荧光阳性染色百分率呈负相关。结合表2及图4结果表明各孔的od值数据与该孔内rbd
‑
hrp与ace2结合活性成正相关，与该孔内血清或新冠病毒中和抗体阳性标品对rbd
‑
hrp与ace2结合的阻断活性成负相关。
[0108]
对ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒和功能elisa试剂盒对同一血清样品所测得的中和抗体活性(ic50数值)比值进行进一步分析，发现ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒相对于功能elisa试剂盒所测疫苗免疫后血清和新冠患者康复后血清的ic50比值分别为4.0
±
1.3(平均值
±
标准错，下同)和3.3
±
1.0(图6c)。结合图5和图6数据表明ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒与功能elisa试剂盒相比，对新冠疫苗接种者血清样品和新冠感染康复者血清样品中和抗体检测灵敏性都有显著的提高，而且平均提高倍数分别为4倍和3.3倍。
[0109]
实施例4
[0110]
ace2磁珠\rbd
‑
mfc新冠病毒中和抗体检测试剂盒检测特异性分析
[0111]
为评价ace2磁珠\rbd
‑
mfc新冠病毒中和抗体检测试剂盒的检测特异性，在本实施例中，以15份疫苗免疫者血清为对照，用ace2磁珠\rbd
‑
mfc试剂盒检测23份健康对照者血清在1:5的稀释度条件下阻断rbd
‑
mfc与ace2磁珠结合的活性，从而对ace2磁珠\rbd
‑
mfc试剂盒的新冠病毒中和抗体检测特异性进行评价。
[0112]
具体实施步骤如下：
[0113]
(1)以样品稀释液稀释疫苗接种者血清样品和健康对照者血清样品2.5倍。以样品稀释液稀释ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒内的新冠病毒中和抗体阳性标准品和阴性标准品分别至60ng/ml。以50μl/孔把稀释后血清、新冠病毒中和抗体阳性标品及新冠病毒中和抗体阴性标品加入圆底96孔板孔内；每个样品加复孔。
[0114]
(2)
‑
(7)与实施例3实施步骤(一)中(2)
‑
(7)步骤相同。
[0115]
如图7所示在血清稀释度为1:5的条件下，15个疫苗免疫者血清对rbd
‑
mfc与ace2磁珠的阻断率为98.0％
±
2.2％(平均值
±
标准错，下同)，23个健康对照者血清对rbd
‑
mfc与ace2磁珠的阻断率为2.9％
±
0.9％。这个数据表明即使在很低的血清稀释条件下，ace2磁珠\rbd
‑
mfc试剂盒也几乎检测不到健康对照者血清对rbd
‑
mfc与ace2磁珠的结合阻断活性。因此ace2磁珠\rbd
‑
mfc新冠病毒中和抗体检测试剂盒的检测特异性为100％。
[0116]
实施例5
[0117]
ace2磁珠\rbd
‑
mfc新冠病毒中和抗体检测试剂盒检测准确性分析
[0118]
为评价ace2磁珠\rbd
‑
mfc新冠病毒中和抗体检测试剂盒的检测准确性，在本实施例中，对16个新冠患者康复后血清样品分别以ace2磁珠\rbd
‑
mfc试剂盒和假病毒新冠病毒中和抗体检测法进行血清新冠病毒中和抗体活性分析，并对两种方法检测的血清中和活性结果(ic50值)进行相关性分析。
[0119]
具体实施方法及步骤如下：
[0120]
(一)ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒检测血清样品病毒中和活性步骤：
[0121]
与实施例3的实施步骤(一)中(1)
‑
(8)步骤相同。
[0122]
(二)新冠假病毒的构建(vsv体系，s基因来源genbank:mn908947，与rbd
‑
mfc具有相同的rbd蛋白序列)、滴定及新冠病毒假病毒中和抗体检测法参考下面文章所述：“quantification of sars
‑
cov
‑
2neutralizing antibody by a pseudotyped virus
‑
based assay.nature protocols.2020nov；15(11):3699
‑
3715.”，血清样品的中和活性检测由中科国邦(北京)检测检验有限公司根据上述文章相关方法进行检测。操作步骤简述如下：
[0123]
(1)待测血清样品用dmem完全培养基稀释15倍，然后以15倍稀释的血清样品为起始血清稀释浓度用dmem完全培养基继续进行3倍系列浓度稀释，把系列稀释的血清液以50ml/孔转移到96孔板，每个稀释度做复孔。
[0124]
(2)用dmem完全培养基稀释新冠病毒假病毒储存液至浓度为1.3x104tcid
50
/ml，把稀释后的病毒液以50μl/孔加入到步骤(1)中准备的血清系列稀释液中，轻轻吹匀。这时血清液终浓度分别为1:30、1:90、1:270、1:810、1:2430和1:7290；血清液中假病毒的量为650tcid
50
/孔，将上述96孔板置于细胞培养箱中(37℃、5％co2)孵育1小时。
[0125]
(3)当孵育时间至半小时，取出培养箱中事先准备好的vero细胞(汇合率达80％～90％)，胰酶消化，细胞计数，用dmem完全培养基将细胞稀释至2x105个/ml。以100μl/孔细胞液把vero细胞加入的步骤(2)准备的血清系列稀释液中，轻轻前后晃动混匀细胞。将96孔板放入细胞培养箱中，37℃、5％co2培养24小时。
[0126]
(4)从细胞培养箱中取出96孔板，用多道移液器从每个上样孔中吸弃150μl上清，然后加入100μl荧光素酶检测试剂，室温避光反应2min。
[0127]
(5)反应结束后，用多道移液器将反应孔中的液体反复吹吸6～8次，使细胞充分裂解，从每孔中吸出150μl液体，加于对应96孔化学发光检测板中，于酶标仪中读取发光值。
[0128]
(6)计算中和抑制率:抑制率＝[1
‑
(样品组的发光强度均值
‑
空白对照cc均值)/(阴性组的发光强度vc均值
‑
空白对照值cc均值)]x100％。根据中和抑制率结果，计算ic50。
[0129]
(三)ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒检测血清中和活性结果与新冠病毒假病毒中和抗
体检测法检测血清中和活性结果相关性分析
[0130]
用graphpad7.0软件对两种检测方法检测相同一组血清样品的中和抗体活性(ic50值)以双尾非参spearman方法进行相关性分析，p<0.05认为两种检测结果具有显著的相关性。
[0131]
如图8所示，ace2磁珠/rbd
‑
mfc中和抗体检测法与假病毒中和抗体检测法对相同一组康复血清样品中和抗体活性(ic50值)检测结果的相关系数(r)为0.799，p＝0.0004。说明ace2磁珠/rbd
‑
mfc中和抗体检测方法与在知名专业期刊上发表的假病毒中和抗体检测法对新冠病毒中和抗体的检测结果呈强相关。这些数据也表明ace2磁珠/rbd
‑
mfc新冠病毒中和抗体检测试剂盒具有很好的检测准确性。
[0132]
实施例6
[0133]
确定s1
‑
mfc与ace2蛋白磁珠发生高台水平结合的临界浓度
[0134]
由于新冠病毒细胞受体ace2通过病毒刺突蛋白s1亚基的rbd结构域结合而介导后续的病毒感染宿主细胞过程，因此ace2既可以直接和rbd蛋白结合也可以间接通过rdb结构域与s1蛋白结合。因此理论上ace2蛋白磁珠既可以与rbd
‑
mfc蛋白组合也可与s1
‑
mfc蛋白组合成为ace2磁珠/rbd
‑
mfc新冠病毒中和抗体检测试剂盒或ace2磁珠/s1
‑
mfc新冠病毒中和抗体检测试剂盒。在实施例6
‑
9，发明人对ace2磁珠/s1
‑
mfc新冠病毒中和抗体检测试剂盒的建立进行条件优化，证明其进行新冠病毒中和抗体检测的有效性，并对该试剂盒进行新冠病毒中和抗体的检测灵敏性与ace2磁珠/rbd
‑
mfc中和抗体检测试剂盒进行比较。通过本实施例首先确定s1
‑
mfc与ace2蛋白磁珠发生高台水平结合的临界浓度。
[0135]
本实施例操作步骤如下：
[0136]
1、用样品稀释液将s1
‑
mfc重组蛋白稀释成一系列浓度梯度，浓度分别为20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、120ng/ml和160ng/ml。用样品稀释液将鼠igg同型对照抗体稀释成浓度为160ng/ml。
[0137]
2、把在步骤1中稀释的各浓度rbd
‑
mfc及鼠igg同型对照抗体以50μl/孔加入到圆底96孔板，每个浓度样品以复孔进行实验。
[0138]3‑
7同实施例1操作步骤的3
‑
7。
[0139]
由图9a和b观察到在s1
‑
mfc蛋白浓度为10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml和80ng/ml时，s1
‑
mfc与ace2磁珠结合百分率分别为19.8％、86.0％、95.9％、91.5％、90.9％；这些数据表明s1
‑
mfc与ace2蛋白磁珠发生高台水平结合的临界浓度为40ng/ml，而本发明rbd
‑
mfc与绝大多数ace2磁珠发生高台水平结合的临界浓度为2ng/ml。
[0140]
实施例7
[0141]
s1
‑
mfc浓度对ace2磁珠/s1
‑
mfc中和抗体试剂盒检测灵敏性的影响
[0142]
为了评估ace2磁珠/s1
‑
mfc新冠病毒中和抗体检测试剂盒在检测新冠病毒中和抗体时s1
‑
mfc终浓度对检测灵敏性的影响，在本实施例中检测s1
‑
mfc终浓度分别为40ng/ml、120ng/ml和360ng/ml时，ace2磁珠/s1
‑
mfc试剂盒检测试剂盒内新冠病毒中和抗体阳性标准品的ic50值。ace2磁珠/s1
‑
mfc新冠病毒中和抗体检测试剂盒中除了s1
‑
mfc代替原试剂盒内的rbd
‑
mfc,其余各组分与ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒各组分相同。s1
‑
mfc蛋白购自义翘神洲公司，货号为40591
‑
v05h1。
[0143]
本实施例操作步骤
[0144]
1、用样品稀释液把新冠病毒中和抗体阳性标准品和阴性标准品稀释成浓度分别为1.6ng/ml、4.8ng/ml、14ng/ml、44ng/ml、132ng/ml、400ng/ml和1200ng/ml的抗体稀释液，把各浓度新冠病毒中和抗体阳性标品稀释液和阴性标品稀释液以50μl/孔加入圆底96孔板，每个抗体浓度加复孔；
[0145]
2、用样品稀释液稀释s1
‑
mfc及鼠igg同型对照抗体至浓度分别为80ng/ml、240ng/ml及720ng/ml，把每个浓度的s1
‑
mfc及鼠igg同型对照抗体稀释液以50μl/孔分别加入到步骤1中准备的系列浓度的中和抗体阳性标品和阴性标品稀释液中，轻轻吹匀，把孔板用锡箔纸包好后放置于细胞培养箱37℃共孵育30分钟。s1
‑
mfc及鼠igg同型对照抗体经与新冠病毒中和抗体阳性标品或阴性标品等体积混合后终浓度变为40ng/ml、120ng/ml或360ng/ml；同时新冠病毒中和抗体阳性标品或阴性标品的终浓度变为0.8ng/ml、2.4ng/ml、7ng/ml、22ng/ml、66ng/ml、200ng/ml和600ng/ml。
[0146]
3、在新冠病毒中和抗体标准品与s1
‑
mfc或鼠igg同型对照抗体共孵育的过程中，对ace2蛋白磁珠进行清洗，方法与实施例2操作步骤3相同
[0147]
4、用样品稀释液重悬ace2磁珠成悬液，以5μl磁珠悬液/反应把ace2磁珠加入步骤2制备的新冠病毒中和抗体阳性标品或阴性标品与不同浓度的s1
‑
mfc或鼠igg同型对照抗体共孵育混合物中。另外把磁珠悬液加入100μl浓度分别为30ng/ml、120ng/ml及360ng/ml的rbd
‑
mfc或鼠igg同型对照抗体稀释液中，轻轻吹匀，室温下共孵育30分钟。
[0148]5‑
7与实施例2操作步骤5
‑
7步骤相同。
[0149]
8、使用graphpad prism 7.00软件根据不同浓度条件下新冠病毒中和抗体阳性标品对s1
‑
mfc与ace2磁珠结合率数据绘制四参数阻断率拟合曲线。对s1
‑
mfc终浓度为40ng/ml、120ng/ml及360ng/ml时，分别绘制新冠病毒中和抗体阳性标品的结合阻断率四参数拟合曲线，并根据所得四参数拟合曲线计算出当s1
‑
mfc终浓度为40ng/ml、120ng/ml及360ng/ml时新冠病毒中和抗体阳性标品的ic50值(50％阻断率)。四参数拟合曲线方程公式为：y＝bottom (top
‑
bottom)/(1 10^((logic50
‑
x)*hillslope))。
[0150]
由图10可知，当s1
‑
mfc浓度为40ng/ml、120ng/ml及360ng/ml时，新冠病毒中和抗体阳性标品的ic50值分别为7.13ng/ml、23.57ng/ml及82.18ng/ml。这一数据表明ace2磁珠/s1
‑
mfc中和抗体检测试剂盒对新冠病毒中和抗体的检测灵敏性随着检测试验中s1
‑
mfc终浓度的减少而提高。通过本实施例再次验证了对于以新冠病毒受体/配体结合阻断策略为基础所建立的新冠病毒中和抗体检测方法所测中和抗体的检测灵敏性与游离新冠病毒配体蛋白(本实施例中是s1
‑
mfc)的浓度成反比这一规律。
[0151]
实施例8
[0152]
ace2磁珠/s1
‑
mfc中和抗体检测试剂盒对一株人源化新冠病毒单克隆中和抗体的活性检测
[0153]
为评价ace2磁珠/s1
‑
mfc中和抗体检测试剂盒是否也可对人源化新冠病毒中和抗体进行中和活性分析。在本实施例中应用ace2磁珠/s1
‑
mfc中和抗体检测试剂盒对一株市售人源化新冠病毒单克隆igg中和抗体(acrobiosystems公司，货号:sad
‑
s35)；人igg1同型对照抗体(biolegend,货号：403502)活性进行检测。
[0154]
本实施例操作步骤如下：
[0155]
1、用样品稀释液把人源化抗新型冠状病毒igg单克隆中和抗体和人igg1同型对照
抗体稀释成浓度分别为5ng/ml、15ng/ml、45ng/ml、133ng/ml、400ng/ml、1200ng/ml和3600ng/ml的抗体稀释液，把各浓度人源化新冠病毒中和抗体稀释液和人igg1同型对照抗体稀释液以50μl/孔加入圆底96孔板，每个抗体浓度加复孔；
[0156]
2、用样品稀释液稀释s1
‑
mfc及鼠igg同型对照抗体至浓度分别为80ng/ml，把稀释后的s1
‑
mfc及鼠igg同型对照抗体稀释液以50μl/孔分别加入到步骤1中准备的系列浓度的人源化新冠病毒单克隆igg中和抗体和人igg1同型对照稀释液中，轻轻吹匀。此时人源化新冠病毒单克隆中和抗体或人igg同型对照抗体终浓度变为2.5ng/ml、7.5ng/ml、22.5ng/ml、67ng/ml、200ng/ml、600ng/ml和1800ng/ml；s1
‑
mfc及鼠igg同型对照抗体终浓度为40ng/ml。把孔板用锡箔纸包好后放置于细胞培养箱37℃共孵育30分钟。
[0157]
3、根据实施例2操作步骤3方法操作
[0158]
4、用样品稀释液重悬ace2磁珠成悬液，以5μl磁珠悬液/反应把ace2磁珠加入步骤2制备的人源化新冠病毒中和抗体或人igg1同型对照抗体与s1
‑
mfc或鼠igg同型对照抗体共孵育混合物中。另外把磁珠悬液加入100μl浓度分别为40ng/ml的s1
‑
mfc或鼠igg同型对照抗体稀释液中。轻轻吹匀，室温下共孵育30分钟。
[0159]5‑
7步骤同实施例2操作步骤5
‑
7.
[0160]
待测人源化新冠病毒单克隆中和抗体对s1
‑
mfc与ace2磁珠结合的阻断活性(％)计算公式为：(与待测人源化新冠病毒单克隆中和抗体相同浓度的人igg1同型对照抗体处理磁珠样品的磁珠阳性染色百分率
‑
待测人源化新冠病毒单克隆中和抗体处理磁珠样品的磁珠阳性染色百分率)/与待测人源化新冠病毒单克隆中和抗体相同浓度的人igg1同型对照抗体处理磁珠样品的磁珠阳性染色百分率x 100。
[0161]
8、使用graphpad prism 7.00软件根据不同浓度条件下人源化新冠病毒单克隆中和抗体阻断s1
‑
mfc与ace2磁珠结合率数据绘制四参数阻断率拟合曲线。并根据所得四参数拟合曲线计算出所测人源化新冠病毒单克隆中和抗体的ic50值(50％阻断率)。四参数拟合曲线方程公式为：y＝bottom (top
‑
bottom)/(1 10^((logic50
‑
x)*hillslope))。
[0162]
根据图11曲线计算出该新冠病毒中和抗体中和活性(ic50值)为86.05ng/ml。该数据表明ace2磁珠/s1
‑
mfc新冠病毒中和抗体检测试剂盒可以有效检测人源化新冠病毒中和抗体活性。
[0163]
实施例9
[0164]
ace2磁珠/s1
‑
mfc新冠病毒中和抗体检测试剂盒与ace2磁珠/rbd
‑
mfc中和抗体检测试剂盒检测灵敏性比较
[0165]
以ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒和ace2磁珠/s1
‑
mfc试剂盒对相同一组新冠疫苗接种者血清样品和一组新冠感染者康复后血清样品进行中和抗体活性检测，通过两种试剂盒对同一血清样品所测的ic50数值进行比较以评价ace2磁珠/s1
‑
mfc中和抗体检测试剂盒的检测敏感性
[0166]
本实施例方法及步骤：
[0167]
1、以样品稀释液稀释疫苗接种者血清样品2.5、7.5、22.5、67.5、202.5及607.5倍。以样品稀释液稀释新冠感染者康复后血清样品15倍、45倍、135倍、405倍、1215倍及3645倍。以样品稀释液稀释ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒内的新冠病毒中和抗体阳性标准品和阴性标准品分别至60ng/ml。以50μl/孔把稀释后血清、新冠病毒中和抗体阳性标品及新冠病毒病
毒中和抗体阴性标品加入圆底96孔板孔内。每个样品加复孔。
[0168]
2、以样品稀释液把rbd
‑
mfc和s1
‑
mfc分别稀释至4ng/ml和80ng/ml，以50μl/孔把rbd
‑
mfc稀释液或s1
‑
mfc稀释液加入步骤1中制备的血清稀释液及中和抗体阳性标品和中和抗体阴性标品稀释液中，吹匀混匀，此时rbd
‑
mfc终浓度为2ng/ml，s1
‑
mfc终浓度为40ng/ml。把96孔板用锡箔纸包好后放入37℃共孵育30分钟。
[0169]
3、在步骤2进行共孵育的同时对ace2蛋白磁珠进行清洗。重悬ace2磁珠成磁珠悬液，以1μl/反应吸取一定体积的ace2磁珠液至一个新圆底96孔板内，用200μl样品稀释液对ace2磁珠进行清洗，清洗两遍。在吸弃上清洗液时通过磁极板吸附把磁珠留存于孔内。
[0170]
4、用样品稀释液重悬ace2磁珠成悬液，以5μl磁珠悬液/反应把ace2磁珠加入步骤2制备的rbd
‑
mfc或是s1
‑
mfc与血清稀释液、新冠病毒中和抗体阳性标品或中和抗体阴性标品共孵育样品的孔中。用样品稀释液把鼠igg同型对照抗体稀释至2ng/ml，以100μl/孔加入到圆底96孔板中，加复孔。以5μl磁珠悬液/反应把ace2磁珠加入到鼠igg同型对照抗体稀释中，作为磁珠同型对照染色样品。轻吹混匀各孔液体，室温共孵育30分钟。
[0171]5‑
7同实施例3操作步骤(一)5
‑
7。
[0172]
待测血清样品对rbd
‑
mfc或s1
‑
mfc与ace2磁珠结合的阻断活性(百分率)计算公式为：(新型冠状病毒中和抗体阴性标品处理磁珠样品的磁珠阳性百分率
‑
待测血清样品处理磁珠样品的磁珠阳性百分率)/新型冠状病毒中和抗体阴性标准品处理磁珠样品的磁珠阳性百分率x 100。
[0173]
8、使用graphpad prism 7.00软件根据某血清样品在不同稀释倍数条件下阻断rbd
‑
mfc或s1
‑
mfc与ace2磁珠结合率数据绘制四参数阻断率拟合曲线。同时根据所得四参数拟合曲线计算出该血清样品的ic50值(50％阻断率)。四参数拟合曲线方程公式为：y＝bottom (top
‑
bottom)/(1 10^((logic50
‑
x)*hillslope))。
[0174]
通过ace2磁珠/s1
‑
mfc试剂盒与ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒分别对12个疫苗免疫后血清和11个新冠患者康复后血清进行中和抗体活性检测，并计算出血清半数阻断rbd
‑
mfc或s1
‑
mfc与ace2磁珠结合的稀释倍数(ic50值)。对同一样品经两种试剂盒测得ic50值用graphpad prism(7.0)软件进行样品成对t
‑
检验比较分析。当结果p<0.05时认为两者有显著差异。对疫苗免疫后血清和新冠患者康复后血清的比较结果分别如图12.a和b所示。另外，为了对两种试剂盒的中和抗体检测灵敏性进行定量比较，我们对ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒和ace2磁珠/s1
‑
mfc试剂盒对同一血清样品所测得的中和抗体活性(ic50数值)比值进行进一步分析，发现ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒相对于ace2磁珠/s1
‑
mfc试剂盒所测疫苗免疫后血清和新冠患者康复后血清的ic50比值分别为1.7
±
0.6(平均值
±
标准错，下同)和2.2
±
1.5(图12.c)。这些数据表明ace2磁珠/rbd
‑
mfc试剂盒与ace2磁珠/s1
‑
mfc试剂盒相比，对新冠疫苗接种者血清样品和新冠感染康复者血清样品中和抗体检测灵敏性都有显著的提高，而且平均提高倍数分别为1.7倍和2.2倍。即ace2磁珠/rbd
‑
mfc新冠病毒中和抗体检测试剂盒对新冠病毒中和抗体检测活性的灵敏度较ace2磁珠/s1
‑
mfc试剂盒高。因此本发明确定ace2磁珠/rbd
‑
mfc新冠病毒中和抗体检测试剂盒为权利要求。