新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒及其检测方法与流程

技术特征：
1.新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：ace2蛋白磁珠、新型冠状病毒s1蛋白rbd结构域
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鼠igg fc片段融合蛋白、荧光物质标记的动物抗鼠igg抗体、新型冠状病毒中和抗体阳性标准品、新型冠状病毒中和抗体阴性标准品、鼠igg同型对照抗体、10x浓缩洗液和样品稀释液。2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒，其特征在于，所述ace2蛋白磁珠通过以下方法制备得到：将12.5μg固相有链霉亲和素的磁珠与375ng预生物素化的重组人ace2蛋白在25μl 0.01m ph值为7.2
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7.4的磷酸盐缓冲液中室温下共孵育40min，在共孵育20min后吹吸重悬一次，共孵育后把固相有ace2蛋白的链霉亲和素的磁珠转入一个新的容器中，置于2
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8℃，当磁珠完全沉降于底部后，吸弃上清，以100μl含质量体积百分比0.02％叠氮化钠的样品稀释液重悬磁珠沉淀，制备成ace2蛋白磁珠。3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒，其特征在于：所述新型冠状病毒s1蛋白rbd结构域
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鼠igg fc片段融合蛋白为新型冠状病毒刺突蛋白rbd结构域的c端与鼠igg1 fc片段进行融合表达的重组蛋白，生产于哺乳动物细胞，保存于蛋白/抗体储存液中，保存终浓度为10
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50μg/ml，使用终浓度为1.5
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6ng/ml；所述鼠igg同型对照抗体的使用终浓度为1.5
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6ng/ml。4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒，其特征在于：所述荧光物质标记的动物抗鼠igg抗体保存于蛋白/抗体储存液中，保存终浓度为50
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500μg/ml；所述荧光物质标记动物抗鼠igg抗体中的荧光物质包括荧光染料、荧光蛋白、荧光染料/荧光蛋白合成物及量子点；所述荧光物质标记动物抗鼠igg抗体中的动物包括山羊、绵羊、牛、驴、兔、大鼠及羊驼。5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒，其特征在于：所述新型冠状病毒中和抗体阳性标准品为人源或兔源抗新型冠状病毒igg单克隆中和抗体；所述新型冠状病毒中和抗体阴性标准品为人igg或兔igg同型对照抗体。6.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液为含质量体积百分比为0.1
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0.5％牛血清白蛋白的0.01m磷酸盐缓冲液，ph值为7.2
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7.4；所述10x浓缩洗液为含有质量体积百分比为1％的牛血清白蛋白、体积百分比为0.25％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液，ph值为7.4。7.根据权利要求2所述的新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒，其特征在于：所述固相有链霉亲和素的磁珠直径为1
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3μm；所述预生物素化的重组人ace2蛋白为人ace2的gln18
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ser740部分在其c端与avi标签进行融合表达的重组蛋白，该蛋白在生物素连接酶的作用下被生物素标记，生产于哺乳动物细胞。8.根据权利要求3或4所述的新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒，其特征在于：所述蛋白/抗体储存液为用含质量体积比为0.02
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0.05％叠氮化钠的ph值为7.4的0.01m磷酸盐缓冲液制备的质量体积比为1％的牛血清白蛋白液。9.新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，用样品稀释液分别稀释新型冠状病毒s1蛋白rbd结构域
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鼠igg fc片段融合蛋白、鼠igg同型对照抗体、待测样品、新型冠状病毒中和抗体阳性标准品或新型冠状病毒中和抗体阴性标准品；步骤2，向圆底96孔板板孔中先后加入50μl步骤1稀释后的新型冠状病毒s1蛋白rbd结
构域
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鼠igg fc片段融合蛋白和50μl步骤1稀释后的待测样品、新型冠状病毒中和抗体阳性标准品或新型冠状病毒中和抗体阴性标准品；另取一孔加入100μl终浓度与新型冠状病毒s1蛋白rbd结构域
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鼠igg fc片段融合蛋白终浓度相同的鼠igg同型对照抗体，轻轻吹吸混匀各孔样品，用封板膜或锡箔纸把96孔板封好后放于37℃保温箱孵育30min；步骤3，以1μl磁珠液/反应孔计算出所需ace2蛋白磁珠总体积，根据计算结果取出ace2蛋白磁珠放入96孔板，用样品稀释液清洗磁珠两次，磁极吸附磁珠，吸弃上清液，加入样品稀释液重悬磁珠，以5μlace2蛋白磁珠液/反应孔加入步骤2中的各处理孔中，轻轻吹匀，把96孔板放置于室温共孵育30mim；步骤4，把96孔板放在磁力架上吸附3min，吸弃上清液，保留磁珠，用200μl 1x浓缩洗液清洗磁珠；步骤5，重复步骤3清洗磁珠2遍后，向孔中加入100μl用样品稀释液稀释的终浓度为0.4
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1μg/ml的荧光物质标记动物抗鼠igg抗体，室温避光孵育20min；步骤6，按照步骤3清洗磁珠2遍后，用200μl 1x浓缩洗液重悬磁珠，用流式细胞分析仪对磁珠进行检测并根据检测数据对磁珠荧光染色百分率进行分析。10.根据权利要求9所述的新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测方法，其特征在于：在用流式细胞分析仪对磁珠进行检测时，首先通过调节电压在fsc和ssc门中找到并圈定磁珠群，再从磁珠群收集2000个或以上磁珠，并对所收集磁珠在荧光物质标记动物抗鼠igg抗体相对应的荧光通路对磁珠荧光染色百分率进行分析；对流式检测数据进行分析时，以鼠igg同型对照抗体处理磁珠样品为阴性对照，在其荧光染色组方图的右端画门，在此门以右部分确认为荧光阳性染色部分，此门以左为荧光阴性染色部分；以该门为参考对其它各样品的磁珠阳性染色百分率进行分析，要求检测结果同时满足新型冠状病毒中和抗体阴性标准品处理磁珠样品的磁珠阳性百分率>90％，新型冠状病毒中和抗体阳性标准品处理磁珠样品的磁珠阳性百分率<10％；磁珠荧光染色百分率计算公式即待测样品对rbd
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mfc与ace2磁珠结合的阻断活性计算公式为：(新型冠状病毒中和抗体阴性标准品处理磁珠样品的磁珠阳性百分率
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待测样品处理磁珠样品的磁珠阳性百分率)/新型冠状病毒中和抗体阴性标准品处理磁珠样品的磁珠阳性百分率x 100。

技术总结
本发明涉及免疫分析检测技术领域，公开了一种新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括：ACE2蛋白磁珠、新型冠状病毒S1蛋白RBD结构域


技术研发人员：孟庆来 要翔宇 吴长新 傅羽佳
受保护的技术使用者：山西大学
技术研发日：2021.09.01
技术公布日：2021/12/13