荧光PCR-人脂联素基因定量表达检测试剂盒的制作方法

荧光pcr
‑
人脂联素基因定量表达检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及医学免疫体外诊断技术领域，尤其涉及一种荧光pcr
‑
人脂联素基因定量表达检测试剂盒。


背景技术：

2.目前对人脂联素的检测主要有以下几种方法。纳米胶乳增强免疫比浊法(latex
‑
enhanced turbidimetric immunoassay)是一种体液蛋白均相透射免疫比浊检测方法，其优势具体体现在：
①
省时省力：在均相反应体系中进行抗原、抗体反应，利用全自动生化分析仪直接测定反应液的吸光度值，几分钟就能获得结果，省却了elisa法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤。
②
稳定准确：操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测人类血清中脂联素的含量。
③
应用广泛：免疫比浊法的灵敏度虽然比elisa法差一些，但足以检测到人类血清中脂联素的下限值，可完全满足临床检测要求。涉及医学免疫学人脂联素单克隆抗体工程，并涉及人脂联素elisa试剂盒的制备，以及试剂盒在检测人脂联素含量中的应用，而目前用于检查脂联素抗体的elisa方法的缺点是血清中所含的高浓度的非特异性抗体可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面，从而导致本底较高或者可能出现假阳性的结果，不能帮助医生对患者进行综合评判。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种荧光pcr
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人脂联素基因定量表达检测试剂盒，。
4.为实现上述目的，本发明提供了一种荧光pcr
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人脂联素基因定量表达检测试剂盒，所述荧光pcr
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人脂联素基因定量表达检测试剂盒通过引物设计及提取待测样本脂肪垫中的总rna，反转录为cdna，对cdna中的保守基因adipoq的mrna反转录cdna也在其中，通过荧光定量pcr反应对其进行定量检测，以健康人的cdna为模板稀释成6个倍数，得到ct值与浓度的相关的标准曲线，再对待测样本脂肪垫中的总rna，反转录为cdna进行扩增，得到ct值；
5.将ct值代入标准曲线中得到浓度值，并与正常人1倍稀释的浓度进行对比，判断是否上调或者下调，如果待检测人通过标准曲线得到的浓度除以正常人通过标准得到的浓度大于1，则上调，反之则下调。
6.其中，所述引物设计为通过引物设计软件primer5对人脂联素adipoq基因的mrna序列进行部分片段进行引物设计。
7.其中，通过购买takara的mix对引物进行筛选，采用溶解曲线法，筛选出单一峰的引物进行送样测序验证，模板采用总的cdna。
8.其中，分别将模板稀释1、10、100、1000、10000、100000倍的6个浓度进行染料法扩增，建立标准曲线。
9.本发明的一种荧光pcr
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人脂联素基因定量表达检测试剂盒，通过引物设计及提取
待测样本脂肪垫中的总rna，反转录为cdna，对cdna中的保守基因adipoq的mrna反转录cdna也在其中，通过荧光定量pcr反应对其进行定量检测，以健康人的cdna为模板稀释成6个倍数，得到ct值与浓度的相关的标准曲线，再对待测样本脂肪垫中的总rna，反转录为cdna进行扩增，得到ct值；再代入标准曲线中得到浓度值，并与正常人1倍稀释的浓度进行对比，判断是否上调或者下调，如果待检测人通过标准曲线得到的浓度除以正常人通过标准得到的浓度大于1，则上调，反之则下调，以此来检测患者的adipoq基因表达量，从而反推人脂联素的表达，从而检测患者的表达量，为临床医生提供参考。
附图说明
10.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
11.图1是本发明提供的引物1的溶解峰结果。
12.图2是本发明提供的引物2的溶解峰结果。
13.图3是本发明提供的引物3的溶解峰结果。
14.图4是本发明提供的引物4的溶解峰结果。
15.图5是本发明提供的引物5的溶解峰结果。
16.图6是本发明提供的引物1的测序结果比对结果。
17.图7是本发明提供的标准品的扩增曲线。
18.图8是本发明提供的标准品的熔解曲线。
19.图9是本发明提供的标准品的标准曲线。
20.图10是本发明提供的待测物的扩增曲线。
具体实施方式
21.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
22.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
23.本发明提供一种荧光pcr
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人脂联素基因定量表达检测试剂盒，通过引物设计及提取人脂肪垫中的总rna，反转录为cdna,对其保守基因adipoq的mrna反转录cdna也在其中，通过荧光定量pcr反应对其进行定量检测，以健康人的cdna为模板稀释成6个倍数，得到ct值与浓度的相关的标准曲线，再对待测样本脂肪垫中的总rna，反转录为cdna进行扩增，得到ct值，再代入标准曲线中得到浓度值，并与正常人1倍稀释的浓度进行对比，看是否上调或者下调，如果待检测人通过标曲得到的浓度除以正常人通过标曲得到的浓度大于1，则上
ttctctatca
68.2461 atatataaat ttaaaaaact atctttttgc ttacagtttt aaattctgaa caattctctc
69.2521 ttatatgtgt attgctaatc attaaggtat tattttttcc acatataaag ctttgtcttt
70.2581 ttgttgttgt tgttgttttt aagatggagt ttccctctgt tgccaggcta gagtgcagtg
71.2641 gcatgatctc ggcttactgc aacctttgcc tcccaggttc aagcgattct tctgcctcag
72.2701 cctcccgagt agctgggacc acaggtgcct accaccatgc caggctaatt tttgtatttt
73.2761 tagtaaagac agggtttcac catattggcc aggctggtct cgaactcctg accttgtgat
74.2821 ctgcccgcct ccatttttgt tgttattttt tgagaaagat agatatgagg tttagagagg
75.2881 gatgaagagg tgagagtaag ccttgtgtta gtcagaactc tgtgttgtga atgtcattca
76.2941 caacagaaaa cccaaaatat tatgcaaact actgtaagca agaaaaataa aggaaaaatg
77.3001 gaaacattta ttcctttgca taatagaaat taccagagtt gttctgtctt tagataaggt
78.3061 ttgaaccaaa gctcaaaaca atcaagaccc ttttctgtat gtccttctgt tctgccttcc
79.3121 gcagtgtagg ctttaccctc aggtgctaca cagtatagtt ctagggtttc cctcccgata
80.3181 tcaaaaagac tgtggcctgc ccagctctcg tatccccaag ccacaccatc tggctaaatg
81.3241 gacatcatgt tttctggtga tgcccaaaga ggagagagga agctctcttt cccagatgcc
82.3301 ccagcaagtg taaccttgca tctcattgct ctggctgagt tgtgtgcctg tttctgacca
83.3361 atcactgagt caggaggatg aaatattcat attgacttaa ttgcagctta agttaggggt
84.3421 atgtagaggt attttcccta aagcaaaatt gggacactgt tatcagaaat aggagagtgg
85.3481 atgatagatg caaaataata cctgtccaca acaaactctt aatgctgtgt ttgagctttc
86.3541 atgagtttcc cagagagaca tagctggaaa attcctattg attttctcta aaatttcaac
87.3601 aagtagctaa agtctggcta tgctcacagt ctcacatctg gttggggtgg gctccttaca
88.3661 gaacacgctt tcacagttac cctaaactct ctggggcagg gttattcctt tgtggaacca
89.3721 gaggcacaga gagagtcaac tgaggccaaa agaggcctga gagaaactga ggtcaagatt
90.3781 tcaggattaa tggtcctgtg atgctttgaa gtacaattgt ggatttgtcc aattctcttt
91.3841 agttctgtca gcttttgctt catatatttt agcgctctat tattagatat atacatgttt
92.3901 agtattatgt cttattggtg catttactct cttatcatta tgtaatgtcc ttctttatct
93.3961 gtgataattt tctgtgttct gaagtctact ttgtctaaaa ataacatacg cactcaactt
94.4021 ccttttcttt cttccttcct ttctttcttc cttcctttct ttctctctct ctctctttcc
95.4081 ttccttcctt cctccttttc tttctctctc tctctctctc tctttttttg acagactctc
96.4141 gttctgtggc cctggctgga gttcagtggt gtgatcttgg ctcactgcta cctctaccat
97.4201 gagcaattct cctgcctcag cctcccaagt agctggaact acaggctcat gccactgcgc
98.4261 ccagctaatt tttgtatttt tcgtagagac ggggtttcac cacattcgtc aggttggttt
99.4321 caaactcctg actttgtgat ccacccgcct cggcctccca aagtgctggg attacaggca
100.4381 tgagccatca cacctggtca actttctttt gattagtgtt tttgtggtat atctttttcc
101.4441 atcatgttac tttaaatata tctatattat tgtatttaaa atgtgtttct tacagactgc
102.4501 atgtagttgg gtataatttt tatccagtct aaaaatatct gtcttttaat tggtgtttag
103.4561 acaatttata tttaataaaa ttgttgaatt taa
104.人脂联素adipoq的引物如下：
105.1f:gttctgtggccctggctgga
106.1r:acttgggaggctgaggcagg
107.2f:gttcagtggtgtgatcttgg
108.2r:aaaccaacctgacgaatgtg
109.3f:cttccttcctttctttcttc
110.3r:gctaatttttgtatttttcgt
111.4f:tctttcttccttcctttctttct
112.4r:gagcctgtagttccagctacttg
113.5f:ctttcttccttcctttctttcttc
114.5r:cttgggaggctgaggcaggagaa
115.引物筛选：
116.通过购买takara的mix对5对引物进行筛选，采用溶解曲线法，筛选出单一峰的引物进行送样测序验证，模板采用总的cdna，反应体系请见体系1，反应程序请见体系2，引物1的溶解峰结果请见图1，引物2的溶解峰请见图2，以此类推，引物5的溶解峰结果请见图5：
[0117][0118]
pcr程序1：
[0119][0120]
从图中可以得出引物1的熔解峰最单一，逐将产物送至生工进行sanger测序法双端测序，拼接后用dnaman进行比对，结果为测序正确，为目标序列，请见图6。
[0121]
标准曲线的制作：
[0122]
引物筛选成功后，就可以通过对正常人脂肪垫中的总rna，反转录为cdna为模板标准曲线的形成，具体步骤如下：分别将该cdna模板稀释1、10、100、1000、10000、100000倍的6个浓度进行染料法扩增，建立标准曲线，体系和程序按照体系1和程序1中进行，通过度待测物的检测，结合标准曲线的ct位置，即可判定患者的表情达情况，待测样本10个，分别标号1.2.3.4.5.6.7.8.9.10。
[0123]
实验结果：
[0124]
标准品的扩增曲线及标准曲线均合格，请见图7
‑
9，得到的标准曲线方程为y＝
‑
0.4x 15,10个样本的扩增曲线请见图10，图10中荧光曲线均正常，编号及ct值请见表1，结合图7中的标曲方程即可得到对应编号的浓度。
[0125]
表1待测样本编号与ct值统计表
[0126]
编号12345678910ct值36.335.536.236.734.93436.836.635.537.5
[0127]
以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。