一种利用TTN基因提高肉牛产肉性能的方法与流程

一种利用ttn基因提高肉牛产肉性能的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种利用ttn基因 g.18060564c>t位点提高肉牛产肉性能的方法。


背景技术：

秦川牛因位于陕西关中“八百里秦川”而得名，系中国黄牛的代表性品种，位居我国“五大黄牛”之首，具有躯干强壮、耐粗饲、抗逆性强、大理石花纹适宜等特点。秦川牛养殖已成为陕西及甘肃、宁夏等省区许多地方农民增收的支柱产业。但与国外优质肉牛品种相比，秦川牛存在生长速度慢、产肉量低和脂肪沉积欠佳等问题。西门塔尔牛原产于瑞士，1990年山东省畜牧局牛羊养殖基地引进该品种。西门塔尔牛并不是纯种肉用牛，但由于西门塔尔牛产乳量高，产肉性能也并不比专门化肉牛品种差，役用性能也很好，是乳、肉、役兼用的大型品种，被畜牧界称为全能牛。西门塔尔牛在引进我国后，对我国各地的黄牛改良效果非常明显，杂交一代的生产性能一般都能提高30％以上，因此很受欢迎。中国西门塔尔牛品种于2006年在内蒙古和山东省梁山县同时育成。中国西门塔尔牛由于培育地点的生态环境不同，分为平原、草原、山区三个类群，种群规模达100 万头。该品种被毛颜色为黄白花或红白花。三个类群牛的体高分别为130.8、 128.3和127.5厘米；体长分别为165.7.147.6和143.l厘米。各类群核心群种牛的遗传基础已达到遗传同质化水平。犊牛初生重平均41.6千克，6月龄体重 199.4千克，12月龄重324千克，18月龄434千克，24月龄592千克。产奶量平均4300千克，乳脂率4.0％。屠宰实验结果，屠宰率平均61.4％，净肉率50.0％，眼肌面积90.5平方厘米。早期生长快是该品种的主要特点之一。因此，中国西门塔尔牛将成为我国未来牛肉生产的重要利用品种。产肉性能是肉牛重要的经济性状，对于秦川牛和中国西门塔尔牛养殖产业的发展具有极其重要的意义，因此提高产肉性能是提升秦川牛和中国西门塔尔牛养殖业经济效益的重要方向。ttn(titin)即肌联蛋白基因。肉牛的ttn基因位于2号染色体上，全长为275574bp。整个ttn基因由335个外显子(第一个非编码外显子，后面是 334个编码外显子)组成。ttn基因首次在日本黑毛和牛大理石花纹肉等级的 qtl基因组区域中被发现。ttn基因参与肌肉收缩，肌纤维形成和维管系统的维护，且在心脏和骨骼肌中起关键的发育和调节作用。肌内脂肪的数量和分布决定了大理石花纹肉等级的形成，这是肉牛的一个重要经济特征。研究发现， ttn基因在低大理石花纹肉等级肉牛组和高大理石花纹肉等级肉牛组中具有表达差异，低大理石花纹肉等级肉牛组ttn基因的表达量高于高大理石花纹肉等级肉牛组，ttn表达的减少会促进脂肪谱系细胞的增殖、分化或成熟，从而导致高水平的大理石花纹肉等级，由此推测ttn基因的表达水平可能与产肉性能有关。单核苷酸多态性标记(single nucleotide polymorphism,snp)是指单个核苷酸发生改变而引起的dna序列多态性，引起具有数量多、密度大、遗传稳定性高等优点而被广泛应用。将这些遗传标记与生长性状相关联，从而实现在 dna水平上选择育种，有效的避免
人为影响并提高选择育种的准确性，并且可实现在早期鉴定出具有优良性状的个体，筛选出优良的后备亲本，缩短育种周期，大大加快选育进程。


技术实现要素：

本发明的目的是在于提供了一种利用ttn基因g.18060564c>t位点提高肉牛产肉性能方法。根据本发明具体实施方式的一种利用ttn基因g.18060564c>t位点提高肉牛产肉性能的方法，所述方法包括以下步骤：s1、检测待测肉牛基因组2号染色体上的18060564bp位点是否存在c
→
t 的突变：若2号染色体上的18060564bp位点核苷酸为t时，其纯合体的基因型为 tt；若2号染色体上的18060564bp位点核苷酸为c时，其纯合体的基因型为 cc；杂合体基因型为ct；s2、选取携带ttn基因g.18060564c>t位点基因型为ct或cc型的肉牛个体，进行人工输精和本交。根据本发明具体实施方式的一种利用ttn基因g.18060564c>t位点提高肉牛产肉性能的方法，步骤s1中，ttn基因g.18060564c>t snp位点的检测方法为：利用pcr方法扩增待测肉牛ttn基因genbank accession number为 nc_037329.1的18060374bp到18060600bp位核苷酸的片段，并将扩增产物进行酶切。利用hpych4iii限制性内切酶对pcr扩增产物进行酶切，使用hpych4iii 限制性内切酶1μl，10
×
fast digest green buffer 2μl，pcr产物2μl，用ddh2o补齐至20μl，37℃反应2h。然后用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统照相分析。根据本发明具体实施方式的一种利用ttn基因g.18060564c>t位点提高肉牛产肉性能的方法，步骤s1中，扩增产物酶切后的酶切片段长度为36bp和191 bp时，判断为cc基因型，酶切片段长度为227bp时，判断为tt基因型，酶切片段长度为36bp、191bp和227bp时，判断为ct基因型。根据利用pcr
‑
rflp技术对ttn基因g.18060564c>t位点基因分型的结果，计算ttn基因g.18060564c>t位点与产肉性能的相关性：ct基因型个体的体重、胸深和胸围显著高于cc基因型个体(p<0.05)；ct基因型个体背膘厚极显著高于cc基因型个体(p<0.01)。表明该位点可以作为秦川牛和中国西门塔尔牛产肉性能分子标记。根据本发明具体实施方式的一种利用ttn基因g.18060564c>t位点提高肉牛产肉性能的方法，步骤s1中，pcr方法所用的引物序列如下：seq id no.1：5
′‑
tcatctcctaactacttccca
‑3′
；seq id no.2：5
′‑
acaaaatctgaacctggctt
‑3′
。根据本发明具体实施方式的一种利用ttn基因g.18060564c>t位点提高肉牛产肉性能的方法，步骤s1中，pcr方法的扩增程序为：pcr反应条件为： 94℃5min；94℃30s 60℃30s，72℃30s，35个循环；最后72℃延伸 7min，保存4℃。根据本发明具体实施方式的一种利用ttn基因g.18060564c>t位点提高肉牛产肉性能的方法，步骤s1中，pcr方法的反应体系共25μl，其中，10pmol/ μl上下游引物各1.25μl，2
×
taqmastermix 12.5μl，50～100ng/μl基因组dna2μl，ddh2o 8μl。根据本发明具体实施方式的一种利用ttn基因g.18060564c>t位点提高肉牛产肉
性能的方法，所述产肉性能包括体重、胸深、胸围、背膘厚或日增重。优选的，本发明中所述肉牛为秦川牛或中国西门塔尔牛；对秦川牛进行育种事，选取携带ttn基因g.18060564c>t位点基因型为ct型的秦川牛个体，进行人工输精和本交，后代体重、胸深、胸围和背膘厚有提升；对中国西门塔尔牛进行育种时，选取携带ttn基因g.18060564c>t位点基因型为cc型的中国西门塔尔牛个体，进行人工输精和本交，后代的日增重性状提升。本发明利用上述分子标记作为秦川牛和中国西门塔尔牛产肉性能的可靠标记，提高了选择强度以及选育的准确性和效率，证实了ttn中的g.18060564c>tsnp位点对中国秦川牛和中国西门塔尔牛产肉性能的遗传效应。本发明的有益效果：本发明将ttn基因作为育种标记中的候选基因，采用pcr
‑
rflp技术，检测待测秦川牛和中国西门塔尔牛基因组2号染色体上的18060564bp位点是否存在一个c
→
t的突变，以确定秦川牛和中国西门塔尔牛个体在该位点的基因型。数据统计结果表明，秦川牛中ct基因型个体的体重、胸深和胸围显著高于cc基因型个体(p<0.05)；ct基因型个体背膘厚极显著高于cc基因型个体(p<0.01)，表明ttn基因g.18060564c>t位点能作为秦川牛产肉性能相关的分子标记，可以利用该分子标记筛选种用秦川牛。在中国西门塔尔牛中， cc基因型的日增重显著高于tt基因型。本发明利用ttn中的g.18060564c>t 巍峨点辅助提高秦川牛和中国西门塔尔牛产肉性能，为利用分子标记辅助育种技术提高秦川牛和中国西门塔尔牛产肉性能提供了一个准确简便的检测方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1显示ttn基因的nc_037329.1:g.18060564c>t位点的pcr产物图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。实施例1秦川牛和中国西门塔尔牛ttn基因snp检测片段的获得及多态性位点检测方法的建立1、秦川牛和中国西门塔尔牛基因组dna的提取本发明的试验牛为西北农林科技大学国家肉牛改良中心的350头秦川成年母牛(年龄18
‑
24月龄，至少三代没有亲缘关系)，赤峰圣泉生态牧业有限公司的260头中国西门塔尔牛(年龄14
‑
18月龄)。秦川牛和中国西门塔尔牛基因组dna采用北京天根生化科技有限公司生产的血液基因组dna提取试剂盒进行提取，具体步骤参照试剂盒说明书。评估提取
dna的质量和数量，并通过琼脂糖凝胶电泳评估，置于
‑
40℃下保存备用。2、秦川牛和中国西门塔尔牛ttn基因snp遗传标记检测片段的获得(1)pcr扩增根据genbank报道的秦川牛ttn基因的基因组序列(genbank id： nc_037329.1)，设计上下游引物m
‑
f和m
‑
r，引物如下：m
‑
f：5
′‑
tcatctcctaactacttccca
‑3′
；m
‑
r：5
′‑
acaaaatctgaacctggctt
‑3′
。利用上述引物在秦川牛和中国西门塔尔牛基因组dna中进行pcr扩增， pcr反应体系如表1所示，总体积为25μl；pcr反应条件如表2所示。表1 pcr反应体系表2 pcr反应条件pcr产物的核苷酸序列如seq id no.3所示：tcatctcctaactacttcccattagtaacagcaaactccagagattagtaaggcag ctttcatgtgcctgaaaaagaaccctatggatgatttaaacaaaacacttggctactca gtaaggatcagtgcatgtatatttgtaaatattaatgccagaaaaaaaaggaatctgaa aaaagaaatcattacactgtacaggctaagcttaagccaggttcagattttgt利用hpych4iii限制性内切酶对pcr扩增产物进行酶切，使用hpych4iii 限制性内切酶1μl，10
×
fast digest greenbuffer 2μl，pcr产物2μl，用 ddh2o补齐至20μl，37℃反应2h。然后用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统照相分析。如图1所示，根据酶切结果将所有个体分为cc、tt和ct等3种基因型，其酶切条带分别为2条(36bp和191bp)、1条(227bp)和3条(36bp、191bp、227bp)。实施例2检测分子标记在秦川牛、中国西门塔尔牛和其他地方肉牛品种群体中的多态性分布对7个黄牛群体检测ttn基因g.18060564c>t位点的遗传多样性进行分析，检测结果如表3所示。表3 ttn基因g.18060564c>t位点在黄牛群体中的基因型频率和等位基因频率
注：qc，秦川牛；lx，鲁西牛；mgc，蒙古牛群体(中国内蒙古自治区)；mgg，蒙古牛群体(蒙古国)；wl，巫陵牛；ll，隆林牛；cs，中国西门塔尔。由表3结果可知：ttn基因g.18060564c>t位点在7个黄牛群体中有三种基因型：tt、tc和cc；中国秦川牛ttn基因g.18060564c>t位点的基因型频率为：tt(0.017)、tc(0.249)、cc(0.734)，c等位基因频率(0.859)高于t等位基因频率(0.141)；中国鲁西黄牛、中国内蒙古蒙古牛、蒙古国蒙古牛、中国巫陵牛、中国隆林牛和中国西门塔尔牛c等位基因频率也均高于t等位基因频率。实施例3分子标记与秦川牛、中国西门塔尔牛产肉性能的关联分析及应用对秦川牛和中国西门塔尔牛ttn基因g.18060564c>t位点与产肉性能关联分析，使用了spss 19.0进行分析，构建一般线性模型如下：y
ijklm
＝μ g
i
a
j
f
k
s
l
s
m
e
ijklm
；
45.其中，yijklm为性状观察值，μ为性状的平均值，g
i
为基因型效应， a
j
为年龄造成的固定效应，f
k
为牧场环境效应，s
l
为性别效应，s
m
为家系效应， e
ijklm
为随机误差。在秦川牛中对ttn基因g.18060564c>t位点与产肉性能的关联性分析，tt基因型个体少于10头，不作统计，cc和ct基因型统计分析结果如表4和表5所示：表4秦川牛ttn基因g.18060564c>t位点与生长性状的关联分析表4秦川牛ttn基因g.18060564c>t位点与生长性状的关联分析注：同列不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)，同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，无字母表示差异不显著(p>0.05)。由表4可知，在秦川牛群体中ttn基因g.18060564c>t位点ct基因型个体的体重、胸深和胸围显著高于cc基因型个体(p<0.05)，体长、腰高、腰脚宽和尻长在两种基因型之间无显著关联性(p>0.05)。表5秦川牛ttn基因g.18060564c>t位点与胴体性状的关联分析注：同列不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)，同列不同小写字母表示差异显
著(p<0.05)，无字母表示差异不显著(p>0.05)。由表5可知，对秦川牛ttn基因g.18060564c>t位点与胴体性状进行关联性分析结果表明，具有ct基因型个体的背膘厚极显著高于cc基因型个体(p <0.01)，眼肌面积、眼肌深度和肌内脂肪含量在两种基因型个体间无显著关联性(p>0.05)。表6中国西门塔尔牛ttn基因g.18060564c>t位点与生长性状的关联分析表6中国西门塔尔牛ttn基因g.18060564c>t位点与生长性状的关联分析注：数值以平均值
±
标准差表示；同一列中不同上标的数值在p<0.05时有显著差异(a，b)，p<0.01 (a，b)。由表6可知，对中国西门塔尔牛ttn基因g.18060564c>t位点与生长性状进行关联性分析结果表明，cc基因型的日增重显著高于tt基因型(p<0.05) (p<0.05或p<0.01)。依照上述育种实验方案，对秦川牛进行育种事，选取携带ttn基因 g.18060564c>t位点基因型为ct型的秦川牛个体，进行人工输精和本交，后代体重、胸深、胸围和背膘厚有提升；对中国西门塔尔牛进行育种时，选取携带ttn基因g.18060564c>t位点基因型为cc型的中国西门塔尔牛个体，进行人工输精和本交，后代的日增重性状提升。具体方法如下：s1、检测待测肉牛基因组2号染色体上的18060564bp位点是否存在c
→
t 的突变：若2号染色体上的18060564bp位点核苷酸为t时，其纯合体的基因型为 tt；若2号染色体上的18060564bp位点核苷酸为c时，其纯合体的基因型为 cc；杂合体基因型为ct；s2、选取携带ttn基因g.18060564c>t位点基因型为ct型或cc型的肉牛个体，进行人工输精和本交。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。