一种缓释碳源固定化好氧反硝化复合菌剂及其制备方法和用途与流程

1.本发明涉及环境生物技术领域，具体地涉及一种缓释碳源固定化好氧反硝化复合菌剂及其制备方法和用途。


背景技术：

2.近年来，随着社会经济的发展，工农业废水不断排入水体，造成了严重的硝酸盐污染，是饮用水污染面临的一个重要问题。硝酸盐污染不仅会导致水体富营养化等水质严重恶化，严重影响饮用水质量。同时硝酸盐还会在人体中转化为亚硝酸盐，将血红蛋白直接氧化为高铁血红蛋白，最终导致人体组织严重缺氧，影响人类健康和两栖动物的生存。植物治理水体污染作为常规的水体治理技术，被广泛应用，
3.好氧反硝化技术可以同时去除碳和氮，在反硝化过程中以碳源作为电子供体，硝酸盐和氧作为电子受体，将硝酸盐还原为n2，与传统反硝化相比，好氧反硝化工艺具有不受氧的限制，脱氮效率明显，且该工艺更经济等优点。
4.相对于粉末菌剂游离的细菌菌体易被流水冲走，使得好氧反硝化菌浓度容易被稀释，导致菌体浓度的降低，从而脱氮效果不稳定的技术缺陷。固定化菌剂可以极大程度的保持菌体的存在，在一定程度上解决了好氧反硝化菌直接投放于工艺研究中存在的脱氮效率低，菌种易流失，脱氮稳定性差等问题。此外，目前仍需要一种微生物
‑
植物综合治理体系，尤其是能够解决联合应用中硝酸盐氮去除率不高的问题。


技术实现要素：

5.为解决现有技术中的技术问题，本发明通过前期筛选的好氧反硝化菌株复配，以丝瓜络为载体制备得到缓释碳源固定化好氧反硝化复合菌剂。本发明的复合菌剂能够解决现有技术中脱氮菌剂存在的易被流水冲走导致的脱氮效率低的技术缺陷。此外，将好氧反硝化技术和植物治理技术联用，构建微生物
‑
植物修复体系，不仅可以改善植物根际微生物群落，而且能够大大强化植物治理作用，实现对植物对氮污染去除的强化作用，达到对饮用水污染的深度处理。具体地，本发明包括以下内容。
6.本发明的第一方面，提供一种缓释碳源固定化好氧反硝化复合菌剂，其包括复合菌剂和用于固定所述复合菌剂的丝瓜络，并且所述复合菌剂具有不低于96％的硝酸盐氮去除率，例如97％、98％，甚至99％的硝酸盐氮去除率。
7.根据本发明所述的缓释碳源固定化好氧反硝化复合菌剂，优选地，所述复合菌剂包括好氧反硝化细菌pseudomonas mendocina lyx和acidovorax sp. strain yd725，pseudomonas mendocina lyx菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心cgmcc，保藏时间2015年3月11日。保藏编号为cgmccno.10611，acidovorax sp.strain yd725保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，保藏时间为2021年5月17号，保藏号为cctcc no：m 2021536。上述菌株的分离和鉴定方法可根据本领域已知方法进行。
8.根据本发明所述的缓释碳源固定化好氧反硝化复合菌剂，优选地，所述丝瓜络为氢氧化钠改性丝瓜络。还优选地，通过1％
‑
6％的氢氧化钠进行丝瓜络的改性处理。进一步优选地，通过2％
‑
5％的氢氧化钠进行丝瓜络的改性处理。
9.根据本发明所述的缓释碳源固定化好氧反硝化复合菌剂，优选地，以所述复合菌剂的重量计，包含1:1
‑
2的pseudomonas mendocina lyx和 acidovorax sp.strain yd725，还优选为1：1
‑
1.5，进一步优选为1：1
‑
1.2。
10.本发明的第二方面，提供一种缓释碳源固定化好氧反硝化复合菌剂的制备方法，其包括以下步骤：
11.(1)提供含有好氧反硝化复合菌剂的菌悬液；
12.(2)提供氢氧化钠改性丝瓜络；
13.(3)使有机溶液与所述菌悬液混合，在得到的混合液中加入所述改性丝瓜络，在适于固定化的条件下使所述混合液与所述改性丝瓜络进行固定化，得到所述缓释碳源固定化好氧反硝化复合菌剂。
14.根据本发明所述的缓释碳源固定化好氧反硝化复合菌剂的制备方法，优选地，所述有机溶液为含有结构式为[c2h4o]
n
的水溶液，其质量体积比浓度为0.05
‑
1.2g/ml，还优选为0.06
‑
1.1g/ml。
[0015]
根据本发明所述的缓释碳源固定化好氧反硝化复合菌剂的制备方法，优选地，所述适于固定化的条件是指在交联溶液存在下0
‑
8℃下交联12
‑
36h，所述交联溶液为1
‑
10％的氯化钙的饱和硼酸溶液，还优选为1
‑
6％的氯化钙的饱和硼酸溶液。
[0016]
根据本发明所述的缓释碳源固定化好氧反硝化复合菌剂的制备方法，优选地，所述有机溶液与所述菌悬液的体积比1
‑
8:1，还优选为2
‑
6:1。
[0017]
本发明的第三方面，提供一种微生物菌剂
‑
植物修复水体系统，所述系统包括曝气装置和反应区，其中所述反应区包括根据第一方面所述的复合菌剂和香根草，本文所用香根草也称为岩兰草，是指学名为vetiveria zizanioides (l.)nash的禾本科多年生草本植物。本领域技术人员可以理解，通过上述曝气装置和反应区与其他合适的水处理装置结合能够用于污染水体的治理。其中，所述曝气装置可采用本领域已知的曝气装置以提供水体溶解氧，反应区用于污染水体的硝酸盐氮去除，香根草可通过另外的植物固定装置进行固定。优选地，所述系统进一步包括进水口、出水口、取样口。
[0018]
根据本发明所述的微生物菌剂
‑
植物修复水体系统，优选地，曝气装置包括曝气泵、转子流量计和曝气头，所述曝气头位于植物固定装置下方。进水箱通过蠕动泵与所述进水口连接，所述进水箱用于提供模拟污染水体。取样口包括从上到下依次排列的上层取样口、中层取样口和下层取样口，用于处理水体的取样，以进行全方面的治理效果评估。所述下层取样口的下方为出水口，用于排除水体。
[0019]
根据本发明所述的微生物菌剂
‑
植物修复水体系统，优选地，所述系统具有不低于96％的硝酸盐氮去除率，例如97％、98％，甚至99％的硝酸盐氮去除率。
[0020]
本发明的第四方面，提供根据第三方面所述的微生物菌剂
‑
植物修复水体系统在饮用水源污染治理中的应用。
[0021]
本发明的复合菌剂具有协同提高硝酸盐氮去除效率的效果，解决微污染水源的修复治理以及现有技术中脱氮菌剂存在的易被流水冲走导致的脱氮效率低的技术缺陷。一方
面丝瓜络来源广泛，价格低廉，丝瓜络具有结构多孔，比表面积大，适合菌的生长与附着，而且有着易保存，性质稳定，使用寿命长，且可重复利用的特性，其机械强度高，稳定性好，丝瓜络表面多孔粗糙，适合作为固定化细菌的载体。另一方面，丝瓜络的降解也可以作为一种缓释碳源为好氧反硝化过程提供碳源，加强好氧脱氮作用，且在制作菌剂前将丝瓜络使用naoh改性，使丝瓜络上光滑的保护膜脱落，更易于好氧反硝化菌的附着。
[0022]
另外，将好氧反硝化技术和植物治理技术联用的修复系统能够改善植物根际微生物群落，强化植物治理作用，实现对植物对氮污染去除的强化作用，达到对饮用水污染的深度处理。
附图说明
[0023]
图1示例性的示出了根据本发明的微生物
‑
植物修复体系装置图。
[0024]
图2为对照组和强化组硝酸盐氮去除效率。
具体实施方式
[0025]
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0026]
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0027]
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
[0028]
本领域技术人员应理解，在缓释碳源固定化好氧反硝化复合菌剂的制备步骤(1)
‑
(3)前后，或这些任意步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。
[0029]
实施例
[0030]
一、菌剂的制备
[0031]
所选好氧反硝化菌为实验室保存的好氧反硝化菌剂pseudomonasmendocina lyx和acidovorax sp.strain yd725，菌株分别保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心cgmcc，保藏编号为cgmcc no.10611，中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no：m 2021536。实验前将两种菌株置于lb 培养基中进行培养至对数期，将对数期的好氧反硝化细菌菌液在转速8000 r/min离心10min，倾去上清液，留下细菌沉淀，将两种菌株沉淀按1:1的比例混合，用0.9％生理盐水定容至5ml形成复合菌液。
[0032]
将丝瓜络按自身形状剪成厚度为1cm的块状体，放置于4％的naoh溶液中煮沸30min，然后用去离子水冲洗去除残留的naoh溶液，然后放置于 65℃烘箱中烘干12h至恒
重，于干燥器中贮存得到的改性丝瓜络。
[0033]
称取10g pva(聚乙烯醇)，加入90m去离子水均匀搅拌，浸泡过夜，将pva溶液置于90℃的水浴锅中加热并不断搅拌至全部溶解，取出后放到室温下冷却至室温，将20mlpva溶液与5ml好氧反硝化细菌菌悬液混合均匀。
[0034]
将灭菌的丝瓜络放入混合液，待混合液充分进入丝瓜络的缝隙，用无菌镊子将浸满混合液的丝瓜络移至2％氯化钙的饱和硼酸溶液(称取40g硼酸，加入20g氯化钙定容至1l)中，放置于4℃冰箱交联24h，将形成的丝瓜络块用无菌生理盐水充分冲洗后，转移到0.9％的生理盐水中，于4℃冰箱中贮存备用。
[0035]
二、菌剂强化植物修复水体污染实验
[0036]
①
实验装置及配水
[0037]
实验装置图1所示。
[0038]
实验反应器有效体积为5l，包括反应区、进水口、出水口、取样口、植物固定篮、曝气装置，通过外置进水箱蠕动进水。
[0039]
配水：乙酸钠0.35g/l,硝酸钾0.075g/l,磷酸氢二钠0.1g/l，磷酸二氢钾0.1g/l，硫酸镁0.01g/l，所提供硝酸盐氮浓度为10mg/l，模拟微污染饮用水环境。
[0040]
②
实验过程
[0041]
实验设置两组反应器，分别为对照组(不添加菌剂，以空白载体代替) 和强化组(添加菌剂)，两组均使用生长趋势相似，根系状况相似的香根草，其中，基于定植篮中添加的空白丝瓜络填充物的总体积，添加十分之一的比例的菌剂进行实验，反应器运行过程中，使用微孔曝气泵曝气，保证水体溶解氧浓度，同时使水体混合，水力停留时间控制在24h，每隔24h 更换新鲜水体，更换水体前后，分别从上中下层取水口分别取样5ml混合得到15ml水样代表整体水环境硝酸盐氮浓度，使用酚二磺酸光度法测定硝酸盐氮浓度，计算硝酸盐氮去除率。整体实验周期为28天。
[0042]
实验结果如图2所示，在菌剂强化初期(阶段1)，对照组与强化组对 no3‑
‑
n的去除效果相似，在1
‑
9天内，对照组和强化组的no3‑
‑
n平均去除率分别为96.82％和98.03％，在强化初期，对照组和实验组并未看出差异，可能是香根草从无营养水体进入到微营养水体，植株加速对营养的吸收，并加以利用于自身生长，菌剂的强化效果无法有效体现。在第9天后(阶段 2)，可能是植物度过对营养物质的饥渴期，对照组对no3‑
‑
n的去除率从第9 天的97.05％降到第10天73.73％,降低了23.32％，在随后的10
‑
28天的平均去除率仅为72.18％，但强化组出现了和对照组相反的现象，阶段2中维持了和阶段1相似的去除效率，阶段2的平均去除率为97.76％，出现这种现象的原因是菌剂的强化作用，香根草处理效果下降后，得益于菌剂联合作用，菌剂发挥了脱氮效果，实现了体系强化作用，维持了体系对no3‑
‑
n的去除效果，保证了体系对no3‑
‑
n的处理效率。
[0043]
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。