一种杜梨花药愈伤的诱导及遗传转化方法与流程

1.本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种杜梨花药愈伤的诱导及遗传转化方法。


背景技术：

2.杜梨为蔷薇科梨属落叶乔木，其抗干旱、耐寒凉、结果期早、寿命长，通常作为各种栽培梨的砧木。杜梨木材致密可作各种器物，树皮含鞣质可入药，应用广泛，具有研究价值。
3.在植物的遗传性研究中，构建愈伤组织再生系统相较于其他再生方式试材广泛、易于接受外源基因、转化率高、扩繁量大，具有显著优势。花药是花丝顶端膨大呈囊状的部分，是雄蕊的重要组成部分，因此花药愈伤相比其他部位诱导出的愈伤组织具有更好的全能性。
4.目前尚无使用杜梨花药进行愈伤诱导及遗传转化方法。


技术实现要素：

5.本发明公开了一种杜梨花药愈伤的诱导及遗传转化方法，通过该方法获得高质量胚性愈伤组织，建立杜梨花药愈伤稳定遗传转化体系，可为杜梨的遗传理论研究和新品种改良提供理论基础，为杜梨遗传性研究提供纯系材料。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种杜梨花药愈伤的诱导方法，包括如下步骤：
8.(1)杜梨花蕾采回后，4℃预处理3
‑
7天；
9.(2)对预处理后的花蕾进行消毒处理；
10.(3)将花蕾中的花药取出，接种到诱导培养基上暗培养20
‑
60天，获得花药愈伤组织；
11.诱导培养基为：nn69 15
‑
30g/l蔗糖 1.0
‑
3.0mg/l 2,4
‑
d 0.5
‑
1.5mg/l6
‑
ba 6
‑
10g/l琼脂；
12.(4)将诱导出的花药愈伤组织接到增殖培养基中进行增殖培养，获得胚性愈伤组织；
13.增殖培养基为：
14.1/2ms 15
‑
30g/l蔗糖 1.0
‑
3.0mg/l 2,4
‑
d 0.5
‑
1.5mg/l 6
‑
ba 6g/l琼脂。
15.优选地，消毒处理为：将步骤(1)中的花蕾使用质量分数75％的酒精洗涤2
‑
3次，去除表面灰尘和部分微生物；然后再使用质量分数0.1％hgcl2及质量分数30％naclo再次进行消毒，无菌水清洗后利用无菌滤纸吸干花蕾表面水分，备用。
16.优选地，步骤(3)中暗培养温度为25
±
2℃。
17.优选地，步骤(4)中增殖培养培养温度为25
±
2℃，保证黑暗环境，每20
‑
30天进行一次继代，增殖速度达到三周增殖一倍时即可进行转化。
18.一种杜梨花药愈伤的遗传转化方法，包括如下步骤：
19.(1)使用携带外源基因的根癌农杆菌转化上述方法获得的胚性愈伤组织，随后接种到共培养培养基中暗培养2
‑
4天；
20.共培养培养基为：1/2ms 15
‑
30g/l蔗糖 1.0
‑
3.0mg/l 2,4
‑
d 0.5
‑
1.5mg/l 6
‑
ba 6g/l琼脂；
21.(2)共培养结束后使用脱菌液洗涤2
‑
3次，无菌水洗涤3
‑
5次，在无菌滤纸上吸干水分后转移到筛选培养基中筛选；
22.脱菌液为：1/2ms 15
‑
30g/l蔗糖 300
‑
500mg/l头孢霉素cef 100
‑
300mg/l羧苄青霉素carb。
23.优选地，转化条件为：
24.使用携带外源基因的根癌农杆菌的重悬液浸泡胚性愈伤组织并微微摇晃；
25.浸泡侵染时间5
‑
15min，重悬液中乙酰丁香酮as工作浓度100
‑
300μmol/l。优选地，共培养温度为25
±
2℃。
26.优选地，筛选培养基为：
27.1/2ms 15
‑
30g/l蔗糖 1.0
‑
3.0mg/l 2,4
‑
d 0.5
‑
1.5mg/l 6
‑
ba 300
‑
500mg/l头孢霉素cef 50
‑
100mg/l卡那霉素 6
‑
10g/l琼脂。
28.综上所述，通过本发明方法诱导杜梨花药产生愈伤组织，诱导率高，通过增殖培养获得的胚性愈伤组织用于遗传转化研究，转化率达99％以上。
附图说明
29.图1所示为实施例1诱导出的杜梨花药愈伤组织。
30.图2所示为实施例1增殖培养基中的杜梨花药愈伤组织。
31.图3所示为实施例1筛选培养基中的抗性愈伤。
32.图4所示为实施例1gus染色下的抗性愈伤。
具体实施方式
33.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.实施例1
35.以杜梨为研究对象，进行花药愈伤诱导及遗传转化：
36.将杜梨花蕾采回后于4℃冰箱中预处理7天。
37.预处理后的花蕾使用质量分数75％的酒精洗涤3次，去除表面灰尘和部分微生物；然后再使用质量分数0.1％hgcl2及质量分数30％naclo分别消毒15min，无菌水清洗后利用无菌滤纸吸干花蕾表面水分，备用。
38.将花蕾中的花药取出，接种到如表1所示各组诱导培养基上暗培养25天，获得花药愈伤组织(图1)；计算诱导率，结果如表1所示。
39.表1
[0040][0041]
确定最佳诱导培养基为：nn69 30g/l蔗糖 1.0mg/l 2,4
‑
d 0.5mg/l6
‑
ba 6g/l琼脂。
[0042]
最佳诱导培养基中诱导培养30
‑
60天诱导率可达到80％
‑
95％，且各组别间差异较小。
[0043]
对于最佳诱导培养基诱导出的愈伤组织，淘汰掉生长速度缓慢，质地偏硬以及褐化的愈伤，选择增殖速度快(约三周增殖一倍)、质地疏松、不易褐化的接到增殖培养基中进行增殖培养(图2)，培养温度为25
±
2℃，保证黑暗环境。
[0044]
增殖培养基：1/2ms 30g/l蔗糖 1.0mg/l 2,4
‑
d 0.5mg/l 6
‑
ba 6g/l琼脂。
[0045]
培养25天后进行一次继代，继续培养25天获得花药胚性愈伤组织。
[0046]
使用携带外源基因(商业化载体pbi121
‑
gus)的根癌农杆菌的重悬液浸泡胚性愈伤组织并微微摇晃；浸泡侵染时间15min，重悬液中乙酰丁香酮as工作浓度300μmol/l。
[0047]
侵染处理后的胚性愈伤组织接种到共培养培养基中25
±
2℃暗培养2
‑
4天。
[0048]
共培养培养基为：1/2ms 30g/l蔗糖 1.0mg/l 2,4
‑
d 0.5mg/l 6
‑
ba 6g/l琼脂。
[0049]
共培养结束后使用脱菌液洗涤2次，无菌水洗涤3次，在无菌滤纸上吸干水分后转移到筛选培养基中筛选。
[0050]
脱菌液为：1/2ms 30g/l蔗糖 400mg/l头孢霉素cef 200mg/l羧苄青霉素carb。
[0051]
筛选培养基为：1/2ms 30g/l蔗糖 1.0mg/l 2,4
‑
d 0.5mg/l 6
‑
ba 400mg/l头孢霉素cef 50mg/l卡那霉素 6g/l琼脂。
[0052]
将筛选培养基中培养获得的抗性愈伤(图3)放入gus染色缓冲液中，置于37℃恒温培养箱培养24h，先后使用质量分数75％和95％的酒精对其进行脱色，染色获得的抗性愈伤如图4所示。
[0053]
使用紫外分光和荧光法分别测定抗性愈伤中gus蛋白的含量和4
‑
mug的含量，通过计算测得gus酶活：
[0054]
使用蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度，以bsa作为标准品制定标准曲线，使用紫外分光光度计读取595nm波长下的数据。
[0055]
以反应终止液na2co3作为空白对照，使用1m m的4
‑
mug配制不同浓度的4
‑
mug溶液：2μm、1.5μm、1μm、100n m、80n m、60n m、40n m、20nm，使用荧光分光光度计测定荧光值，以4
‑
mug的浓度和荧光强度值分别作为横坐标和纵坐标，制作荧光标准曲线。
[0056]
取100μl抗性愈伤蛋白上清液加入到900μl 37℃预热的gus蛋白反应缓冲液中，迅速混匀，立即取出。100μl加入到900μlna2co3反应终止液中，作为0min时间点的样品保存待测定。然后将剩余反应液继续37℃水浴反应，30min时取出，将100μl反应液加入到含有900μlna2co3反应终止液中，反应完的样品均室温避光保存。然后使用荧光分光光度计测定0min和30min样品的荧光强度值。根据gus荧光标准曲线计算30min内生成的4
‑
mug。gus酶活力表示：4
‑
mug nm
·
min
‑1·
mg
‑1protein。
[0057]
转化后筛选到的抗性愈伤gus酶活可达到18000
‑
21000nm
·
min
‑1·
mg
‑1protein
[0058]
进一步地，将筛选培养基中培养获得的抗性愈伤在筛选培养基中继代三次，抗性愈伤可持续增殖，遗传稳定；统计胚性愈伤组织用于遗传转化研究的转化率，达99％以上。
[0059]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0060]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。