富含二十二碳六烯酸的微生物油的制作方法

1.本发明涉及一种富含二十二碳六烯酸(dha，c22:6n3)的微生物油，其包含相对于总脂肪质量大于60％的dha和相对于总脂肪质量至少80％的甘油三酯。


背景技术：

2.含有dha的油来自若干种来源，最众所周知的是鱼、磷虾和诸如微藻的微生物。已知许多微生物菌株产生pufa，特别是二十二碳六烯酸(dha)、花生四烯酸(ara)或二十碳五烯酸(epa)，也由符号ω3和ω6标识。这些pufa广泛用于工业，特别是用于人类或动物食品或化妆品，并且它们的工业生产已经不断改进了许多年(wo 1997/037032、wo 2001/054510、wo 2013/136028、wo 2015/004402、us 2017/016036、us 2017/335356)。用于选择适合工业生产的菌株的标准是它们的高生物量生产率、显著的甘油三酯(tg)积累和在脂肪中高的pufa含量。如今，许多已知的工业菌株都符合这前三个标准，并且在脂肪中的pufa含量大约是35％或在最好的情况下甚至50％。
3.然而，需要具有高pufa含量的浓缩油，即供应诸如浓缩油胶囊的浓缩产品，其使得有可能减少等效量pufa所需的单位剂量的数量。为了获得具有高pufa含量(例如，高于55％的dha)的油，可以通过添加pufa将油富集(us 2014/323569)和/或通过涉及使用诸如乙醇的溶剂的将甘油三酯转化为乙酯的方法将油浓缩。乙酯是一种人工化学形式，它们在自然界中不存在。呈乙酯形式的脂肪酸的生物利用度远低于呈甘油三酯的形式的生物利用度(ghasemifard等人，2014)。此外，所述方法除去粗油中存在的维生素和抗氧化剂。因此，浓缩油更易于氧化。
4.可以将这些乙酯转化回甘油三酯，它们是“重新形成”的甘油三酯，以便提高生物利用度。还可以添加抗氧化剂以增加油随时间的稳定性。然而，这种浓缩油与天然油完全不同，它经受了许多转化过程，所述转化过程改变了其组成：脂肪酸谱、维生素、色素和其他抗氧化剂分子，剥夺了pufa的其天然保护。然而，pufa是敏感分子(特别是对温度敏感)的分子，所述分子可以将顺式键转换为反式键(tsuzuki w，2012)。还应注意，甘油三酯的重新形成是不完全的，经如此处理的油仍含有可变比例的乙酯，这使其区别于未经处理的油。通常通过蒸发除去在酯交换(乙酯转化为甘油三酯)过程中释放的乙醇。尽管如此，在浓缩油中仍残留痕量乙醇。
5.希望最小化油处理过程的另一个原因是形成污染物，诸如一氯丙二醇(2
‑
mcpd、3
‑
mcpd)和缩水甘油及其衍生物(2
‑
mcpd、3
‑
mcpd和缩水甘油脂肪酸酯)。特别是在鱼油的纯化和除臭步骤之后，检测到这些污染物的存在(miyazaki和koyama，2017)。目前，关于浓缩过程对污染物形成的影响的可用数据很少。然而，从乙酯重新形成甘油三酯可能导致甘油二酯的增加，所述甘油二酯是污染物前体化合物。缩水甘油(和缩水甘油酯)的水平受制于法规(eu)2018/290/ec，以限制其在食品中的含量：在食用油中的浓度不得超过1000μg/kg，除了旨在用于制备婴幼儿和婴儿用食品的食用油(其中限值为500μg/kg)。在用于婴幼儿和婴儿的制剂中，最高水平甚至更低：在粉末中为75μg/kg，并且在液体中为10μg/kg。此水平将
在2019年进一步降低(分别为50和6μg/kg)。针对油和婴幼儿食品，目前正在进行最大mcpd浓度的评估。目前，法规仅涉及水解的植物蛋白和酱油(20μg/kg的限值)。
6.因此，令人感兴趣的是获得天然富含pufa的油，其组成尽可能接近于生产微生物的脂溶性物质，并且在处理期间产生最少污染物。这使其特别适于将dha整合到食品产品中。其非常低的3
‑
mcpd和缩水甘油含量与其高dha含量的组合使其对于旨在用于婴幼儿和婴儿的食品的制备而言是理想的。
7.此外，这些浓缩油通常通过昂贵且对环境有害的处理方法而获得。
8.另一个已知的解决方案包括产生寻求促进pufa产生的代谢途径的经遗传修饰的微生物(hamilton等人，2016)或被认为产生更多dha的突变体(wo 2017/09804)。然而，技术解决方案的选择受限于所获得的油的用途，特别是在人类食品中的(fedorova
‑
dahms i.等人，2011)。
9.需要天然浓缩pufa的油，所述油不需要除提取方法外的其他处理，即其中pufa基本上呈如由微生物产生的甘油三酯的形式。更特别地，需要具有高pufa含量和较低饱和脂肪酸含量的油。除了油品质的问题之外，对低饱和脂肪酸含量的关注正朝向粘度较低的油，其更易于在工业水平上使用，特别是其处理需要更少能源。
10.本发明用具有高dha含量的油来满足这种需求，所述油包含相对于总脂肪质量至少60％的dha。这种油既不含乙酯，也不含痕量溶剂(乙醇或甲醇)，并且具有降低的3
‑
mcpd和缩水甘油含量(与目前市场上含有大于60％的dha的油相比)。


技术实现要素：

11.本发明涉及一种微生物油，其包含二十二碳六烯酸(dha)，其特征在于所述微生物油包含相对于总脂肪质量至少80％的甘油三酯、相对于总脂肪质量大于60％的dha，并且饱和脂肪酸含量是相对于总脂肪质量小于25％。
12.本发明还涉及一种稀释的微生物油，其包含与另一种油混合的根据本发明的富含甘油三酯和dha的微生物油。
13.本发明的另一个目的是一种微生物生物质，其包含根据本发明的富含甘油三酯和dha的油。
14.本发明还涉及根据本发明的富含甘油三酯和dha的任选稀释的油或含有这种油的生物质用于人类或动物食品，特别是新生儿、儿童或孕妇或哺乳妇女用食品的用途。
15.本发明的另一个目的是一种食品，其特征在于所述食品包含根据本发明的富含甘油三酯和dha的任选稀释的油。
具体实施方式
16.根据本发明的油是微生物油，其包含相对于总脂肪质量大于60％的dha，有利地相对于总脂肪质量至少62％的dha、更有利地至少65％的dha、优选大于67％、更优先地至少70％、甚至更优先地75％的dha。
17.根据本发明的油的这些特征既涉及如存在于微生物生物质中的油，又涉及从此生物质中提取的油，无论是粗制的还是纯化的。
18.本发明还涉及一种稀释的油，其包含与另一种油混合的根据本发明的油。
19.本发明还涉及一种药物、化妆品或食品组合物，其包含根据本发明的油，无论是粗制、精制或稀释的。
20.本发明还涉及粗制、精制或稀释的根据本发明的油或含有所述油的生物质用于人类或动物食品，特别是新生儿、儿童或孕妇或哺乳妇女用食品的用途。
21.具体实施方式
22.根据本发明的油是从在允许细胞生长(以产生生物质)和具有高dha含量的油的产生的条件下生长的微生物细胞的生物质获得的微生物来源的油。
23.根据本发明的油是微生物油，其包含相对于总脂肪质量大于60％的dha，有利地相对于总脂肪质量至少62％的dha、更有利地至少65％的dha、优选大于67％、更优先地至少70％、甚至更优先地至少75％的dha。
24.优选地，根据本发明的油具有相对于饱和脂肪酸高含量的不饱和脂肪酸。根据本发明的油中的不饱和脂肪酸基本上是dha和dpa(二十二碳五烯酸，c22:5n6)。ara(花生四烯酸，c20:4n6)含量通常是小于0.5％、或甚至小于0.3％、有利地小于0.1％。epa(二十碳五烯酸，c20:5n3)含量通常是小于1.5％、有利地小于1％、更有利地小于0.5％。ara和epa的百分比是相对于总脂肪质量给出的。
25.有利地，组合的dha和dpa含量是相对于总脂肪质量至少70％，相对于总脂肪质量有利地至少75％、更有利地至少80％、并且甚至更有利地至少85％。在某些情况下，总dha dpa占总脂肪质量的最多90％。对于具有最高dha含量(至少70％)的油，组合的dha和dpa含量是至少80％、优先地至少85％。
26.对于根据本发明的富含dha的油，dha/dpa比率优选是至少3、更优先地至少4，范围为从4至9。对于具有最高dha含量(至少70％)的油，dha/dpa比率有利地是从4至7。
27.饱和脂肪酸含量是相对于总脂肪质量小于25％、或甚至小于20％、更优先地小于15％、甚至更优先地小于10％。
28.饱和脂肪酸基本上是棕榈酸(c16:0)。存在含量小于2％或甚至小于1％的其他饱和脂肪酸，特别是十五烷酸(c15:0)或肉豆蔻酸(c14:0)或硬脂酸(c18:0)。有利地，除棕榈酸以外的c10至c22饱和脂肪酸彼此独立地以痕量存在，每种的含量是小于0.1％或甚至不存在(考虑到分析方法的不确定性，为0％)，特别是对于c10、c11、c12、c17、c20、c21和c22饱和脂肪酸。百分比是相对于总脂肪质量给出的。
29.棕榈酸含量优选是总脂肪质量的小于20％、更优先地小于15％、甚至更优先地小于10％。
30.对于具有最高dha含量(至少70％)的油，c10至c22饱和脂肪酸含量是优选小于15％、更优先地小于10％。
31.测量根据本发明的油的高dha含量和低饱和脂肪酸(sfa)含量的一种方法是建立dha/sfa比率。
32.其有利地是至少2.5、优先地至少3、更优先地至少5、甚至更优先地至少6。在某些情况下，它可能达到至少8或甚至至少9。对于具有最高dha含量(至少70％)的油，dha/sfa比率是至少4、优先地至少6、更优先地至少8、最高约9。
33.还可以通过(dha dpa)/sfa比率来测量相对于饱和脂肪酸(sfa)多不饱和脂肪酸的高含量。
34.其有利地是至少2.5、优先地至少3、更优先地至少4、甚至更优先地至少5。在某些情况下，它可能达到至少8或甚至至少9。对于具有最高dha含量(至少70％)的油，(dha dpa)/sfa比率是至少5、优先地至少7、更优先地至少10、最高约11或更大。
35.根据本发明的油基本上呈甘油三酯的形式。甘油三酯占总脂肪质量的至少80％、有利地总脂肪质量的至少90％、更有利地至少93％。例如通过薄层色谱法分析甘油三酯含量(jouet等，2003)。
36.根据本发明的油的这些特征既涉及如存在于微生物生物质中的油，又涉及从此生物质中提取的油，无论是粗制的还是纯化的。
37.在某些情况下，取决于所使用的方法，从生物质中提取油可能导致dha和dpa含量稍微增加，从而有利于相对于低分子量饱和脂肪酸对这些pufa的提取。然而，此浓度基本上不改变生物质中所含的油的固有特性，特别是甘油三酯含量。在所有情况下，根据本发明的油是这样的油，所述油未经受通过添加pufa(例如呈酯的形式)、通过浓缩和/或通过除去饱和脂肪酸(诸如棕榈酸)而对其脂肪酸含量的显著改变。
38.根据本发明的特定实施方案的油含有大于10mg天然类胡萝卜素/kg油、或甚至大于30mg/kg、优先地大于40mg/kg、甚至更优先地大于60mg/kg、或甚至至少65mg/kg。存在的类胡萝卜素主要是虾青素和β
‑
胡萝卜素。所述油含有大于20mg/kg、或甚至大于30mg/kg、更优先地大于40mg/kg的虾青素。还存在角黄素，但量较少。可能存在其他类胡萝卜素，诸如叶黄素和玉米黄质，但它们处在所用方法的检测限上。术语“天然类胡萝卜素”意指未添加类胡萝卜素，它们来自与油相同的生物质并且与油同时从此生物质中被提取。它们是在没有特别刺激的情况下由菌株在异养发酵条件下产生的。因此，这些天然类胡萝卜素存在于整个过程中，从而保护脂肪酸(特别是dha)免受氧化。精制过程可以除去色素，因此精制油可能含有更少的类胡萝卜素(如果有的话)。
39.根据标准aocs cc 13j
‑
97(2017年修订)中描述的方法用分光光度计通过测量加德纳(gardner)指数来评估油的颜色。测量量度包括18个等级，范围为从透明(1)到深红色/棕色(18)。一些类胡萝卜素，包括虾青素和β
‑
胡萝卜素，根据其浓度而显示出或多或少强烈的颜色。因此，以较高的加德纳指数反映它们的存在。根据本发明的特定实施方案的油具有高于8或甚至高于10、优选在12与17之间的加德纳指数。
40.加德纳量度在传统上用于评估油的老化，因为富含多不饱和脂肪酸(pufa)的油的氧化可能导致颜色发黄(对于透明油)，因此加德纳值较高。然而，通过茴香胺指数和过氧化指数可以更精确地测量富含pufa的油的氧化。根据本发明的油具有低的茴香胺指数和过氧化物指数(这保证了低的氧化产物)和高的加德纳指数(由于存在类胡萝卜素)两者。根据本发明的油具有小于5、或甚至小于2、优选小于1.5的茴香胺指数和小于5、或甚至小于或等于1、优选小于或等于0.5的过氧化指数。
41.根据本发明的油具有相当低的熔融温度，其相关于dha含量的增加而降低。根据标准iso 6321测量熔融温度。实际上，具有大于600mg dha/g脂肪酸(或约大于62％的dha)的油具有低于20℃、甚至小于或等于5℃的熔融温度。因此，它们在室温下为液体。具有大于700mg dha/g脂肪酸(或约大于73％的dha)的油具有低于
‑
5℃的熔融温度。低的熔融温度有利于储存和处理(特别是泵送)，因为可以在冷藏油时以液体形式储存它以便限制老化。必须将在储存过程中冻结的油温热以进行取样以及向混合物中的掺入。然而，温度是加速氧
化的因素。
42.此特性还以粘度值来反映，所述粘度值是通过粘度计在22℃下(viscoman，gilson)测量的。根据本发明的油具有在室温下小于或等于50pa.s、或甚至小于40、优选小于30的粘度值。
43.通过培养产生富含dha的油的微生物而获得根据本发明的油。使得可能获得此类油的微生物菌株是工业菌株，即根据本发明，脂肪含量占干物质的至少45％、优先地干物质的至少约50％的菌株，并且所述菌株在至少50g/l、优先地至少70g/l、更优先地至少100g/l的细胞密度下具有生长能力。
44.本领域技术人员熟悉产生pufa的微生物工业菌株，其中主要是破囊壶菌(thraustochytrid)、鞭毛藻(dinoflagellate)、硅藻(diatom)、黄绿藻(eustigmatophyte)，特别是用于产生dha的隐甲藻属(crypthecodinium)、裂殖壶菌属(schizochytrium)、破囊壶菌属(thraustochytrium)或aurantiochytrium微生物。
45.脂肪中的pufa含量的分析根据技术人员的标准方法进行，特别是在以下文章中描述的：gas chromatographic quantification of fatty acid methyl esters:flame ionization detection vs.electron impact mass spectrometry,dodds等人,lipids,第40卷,第4期(2005)。
46.更特别地，可以提及的是aurantiochytrium mangrovei菌株ccap4062/7和ccap4062/8和裂殖壶菌属物种(schizochytrium sp.)ccap4087/7，其产生包含相对于总脂肪质量大于60％的dha的油。本发明还涉及能够产生包含大于60％的dha的油的那些菌株。
47.工业培养用于生产发酵液(其然后将用于生产油)的微生物的方法是本领域技术人员众所周知的，无论是以自养、异养还是混养模式。以异养或混养模式的工业培养允许至少50g/l、优先地至少70g/l、更优先地至少100g/l的细胞密度。
48.根据本发明，“工业培养”意指在适用于其生长和pufa产生的培养基中并且以适用于产生足以满足市场的量的体积培养菌株。
49.这些工业培养通过以不连续的“分批”模式、半连续的“补料分批”模式或连续模式发酵来进行。发酵罐具有范围可以为从1000l至大于200m3的容积。
50.合适的培养基优选是化学限定的培养基，其包含碳源、氮源、磷源和盐。“化学限定的培养基”意指其中每种元素的含量已知的培养基。有利地，培养基不包含富或复合有机物质。富或复合有机物质意指呈混合物形式的未纯化有机物质，其中混合物的各组分的确切组成和浓度不是准确已知的，未控制，并且可能在批次与批次之间显示出显著的可变性。作为富或复合有机物质的例子，可以提及的是作为蛋白质水解反应产物的酵母提取物或蛋白胨，或富矿物物质，诸如海产矿物盐或其他复合生长剂，其每种组分浓度不固定。
51.通常，工业培养方法包括促进生物质产生的生长步骤，随后是促进产生特别是脂肪和pufa的积累步骤。专利申请wo 2001/054510中描述的方法值得注意地是这种情况。更最近地，已经描述了使用同时促进产生生物质和pufa的培养条件的方法。可以特别提及的是在申请wo 2012/035262、wo 2015/004402和wo 2015/004403中描述的培养方法。当然，技术人员应能够适配培养条件，特别是培养基的组成、在培养期间添加营养物的条件、温度、氧合循环和光照条件以促进生物质的产生。
52.工业培养基的温度有利地大于17℃。
53.根据本发明，“生物质”有利地意指通过它们的培养而产生的一组微生物细胞，特别是通过上述方法产生的可能保留或可能未保留其物理完整性的细胞。因此，应理解，所述生物质可以包含从0％至100％的一定量的降解微生物细胞。“降解的”意指所述微生物细胞的物理完整性已被改变，诸如裂解的微生物，例如由均质化或酶促裂解过程而导致的。一旦产生，此生物质可以是原始的、刚从其培养基中分离出的、干燥或未干燥的、降解或未降解的。
54.取决于其是否干燥，生物质全部或部分地可以具有1％至90％的水分含量。
55.因此，本发明还涉及包含如先前所定义的油的微生物生物质。
56.根据第一实施方案，生物质具有70％至90％、优先地80％至85％的水分含量。当其主要由优化的工业微生物组成时，尤其如此，所述工业微生物是在发酵液过滤以从培养基中分离出培养的微生物、然后干燥而培养的。
57.根据本发明的另一个实施方案，生物质是全部或部分干燥的，并且具有1％至10％、优先地2％至7％的水分含量。
58.可以将生物质包装以用于储存或像这样使用，例如作为食品补充剂或用于人类或动物食用的食物。
59.从通过微生物培养产生的生物质中分离出根据本发明的油的方法是本领域技术人员众所周知的。可以特别提及的是固
‑
液提取，其基于使用溶剂(液相)通过喷洒或浸渍来提取干燥的生物质(固相)中所含的油；液
‑
液提取，其基于在细胞初步裂解后从油中分离出水相并且然后倾析或离心。优选地，在无有机溶剂的情况下进行提取。可以特别提及的是申请wo 01/53512、wo 02/10423、wo 2014/122092、wo 2015/092546和wo 2015/095694。
60.还可以提及的是用于提高从用于富含pufa的油的微生物中的脂肪提取产率的优选方法。此方法包括在第一温度下进行细胞裂解，后者在低于第一温度的第二温度下继续进行，然后从裂解的生物质中机械分离出油(过滤、倾析)。
61.细胞裂解通过酶促或机械裂解(研磨)来完成。裂解的第一部分的温度优选是至少50℃，同时保持低于除了促进细胞裂解之外还将使油的组成降解的温度，即低于80℃、优选至多70℃的温度。
62.可以使用的酶是已知的，特别是在wo 2015/095688、wo 2011/153246、us 6750048和wo 2015/095694中描述的，特别是蛋白酶或纤维素酶，诸如由novozyme公司以名称alcalase 2.5l、alcalase 2.4l、novozym 37071、flavourzyme 1000l、novozym fm 2.4l,protamex,viscozyme出售的酶。使用条件是由供应商推荐的那些条件，温度是为最佳酶活性而推荐的温度，至少50℃并且最高70℃、优选约65℃。有利地，酶促裂解在贫氧气气氛中进行。
63.机械裂解方法也是众所周知的，特别是通过球磨机、混合器
‑
分散器、高压均质化针磨机或冲击磨机、超声波、脉冲电场。可以特别提及的是球磨机：netzsch/discus
‑
1000；wab/ecm
‑
ap60；高压均质化机：gea/ariete；混合器
‑
分散器：silverson/700
‑
x，针磨机：hosakawa/contraplex；冲击磨机：netzsch/condux。
64.裂解的第一部分在现有技术推荐用于细胞裂解的通常条件下进行，特别是在酶促裂解的持续时间或研磨循环方面。
65.裂解继续步骤通过修改实施条件来完成裂解，而不必预先提取裂解的生物质。第
二部分中的裂解温度比第一部分的裂解温度低至少10℃。优选地，裂解的第二部分的温度小于或等于40℃，有利地范围为从5℃至40℃。在较低的温度下的裂解的第二部分或裂解的结束有利地进行至少30'、有利地最多30h。
66.从裂解的生物质中机械分离出油也是技术人员众所周知的，作为重力分离，特别是通过如专利申请wo 01/53512中描述的离心。也可以使用连续分离，特别是通过离心板分离器。此类分离器已知从包含固体残余物和水的复合介质中连续提取油，如专利申请wo 2010/096002中所描述，特别是由尤其是alfa laval、flottweg或spx flow technology santorso公司出售的。在用于获得根据本发明的油的方法中，此连续分离步骤是优选的。
67.所获得的油通常是被称为粗油的油，其可以按原样使用或可以被精制，特别是促进其储存，通过防止其变腐烂或改变其颜色以使其更易于被消费者接受。这些精制步骤是本领域技术人员众所周知的，特别是脱胶、澄清和除臭。它们除去(全部或部分地)磷脂、色素、挥发物和游离脂肪酸。实际上，与粗油相比，这些方法基本上不改变饱和或不饱和脂肪酸的相对含量，也不改变所获得的精制油的甘油三酯含量。
68.本发明还涉及一种包装的油，其包括具有合适容积的容器以容纳所述油，所述油是如先前所定义的富含dha的油(粗制或精制的)并且以大于1l的油量、有利地以大于10l的油量、更特别地以大约220l的油量、并且更特别地以大约20m3的油量包装。
69.本领域技术人员可以使用能够保持油或生物质的体积并且保护其以用于其储存和运输的任何容器。有利地，容器的容积将等于或基本上大于以限制容器中空气的存在并且限制氧化的这种方式包装的油或生物质的体积。容器将有利地是不透明的，以便避免产品由于光线、特别是紫外线而降解。有利地，容器将是气密的，使得未被油或生物质占据的任何体积都可以被惰性气体填充。
70.可以将根据本发明的油与其他油混合以用于其最终用途。此稀释改变稀释油的组成中dha和其他不饱和脂肪酸的总含量。然而，鉴于用于稀释的油的脂肪酸谱，仍然有可能在最终油中鉴定来自根据本发明的富含dha的油和来自稀释油的脂肪酸的相对百分比。
71.因此，本发明还涉及一种稀释的油，其包含与另一种油混合的根据本发明的油。用于稀释根据本发明的富含dha的油的油通常并且优选地是适用于人类或动物食品食用的植物油。可以特别提及的是向日葵、油菜籽、大豆、核桃、芝麻、大麻、榛子、摩洛哥坚果、橄榄、亚麻子或适用于食品用途的任何其他油。添加的油还可以是含有其他pufa、特别是ara和/或epa的油，特别是其他微生物来源的油或鱼油。
72.本发明还涉及一种组合物，其包含根据本发明的油(无论是粗制的、精制的还是稀释的)或包含根据本发明的生物质。
73.根据本发明的组合物可以包含一种或多种赋形剂。赋形剂是一种组分或组分的混合物，其在本发明中用于为了组合物的储存和使用而赋予其所希望的特征，包括食品和药物、化妆品和工业组合物。当将赋形剂添加到药物组合物中时，所述赋形剂可以被描述为“药学上可接受的”赋形剂，其特性从药典中得知被用于与人类和动物组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其他并发症。可以使用不同的赋形剂，诸如有机或矿物碱、有机或矿物酸、ph缓冲剂、稳定剂、抗氧化剂、粘附剂、脱模剂、包衣剂、外相组分、控制释放组分、表面活性剂、保湿剂、填充剂、润肤剂或其组合。
74.取决于它们的目的，根据本发明的组合物特别是药物、化妆品、营养药物组合物或
食品。
75.食品旨在用于人类和动物两者，并且包括固体、糊状或液体组合物。可以特别提及的是普通食品、液体产品(包括奶、饮料、治疗性饮料和营养饮料)、功能性食品、补充剂、营养药物品、婴儿用制剂(包括早产婴儿用制剂)、孕妇或哺乳妇女用食品、成人用食品、老年食品和动物饲料。
76.根据本领域技术人员已知的用途，根据本发明的富含dha的油(无论是粗制的还是精制的)或含有它的生物质可以直接用作或作为添加剂添加在油、涂抹料、另一种脂肪成分、饮料、基于大豆的酱、乳制品(奶、酸奶、奶酪、冰淇淋)、烘焙产品、营养产品(例如以营养补充剂的形式(以胶囊或片剂形式))、维生素补充剂、食品补充剂、待稀释用于饮料的粉末(诸如能量饮料)或用于婴儿配制品的奶粉、成品或半成品粉末状食品等中。
77.动物饲料也是本领域技术人员已知的。它们特别旨在用于农场动物，诸如牛、猪、鸡、绵羊、山羊或用于贝类动物或养殖鱼类的养鱼业。
78.包含富含dha的油的药物组合物也是技术人员已知的，所述油单独使用或与其他药物产品组合使用。
79.可以将根据本发明的油(粗制或精制的)或含有它的生物质配制成单剂量组合物的形式，特别是适用于口服施用的片剂、胶囊、粉末、颗粒的形式。
80.根据本发明的富含dha的油(无论是粗制的还是精制的)或含有它的生物质的优点是可以将其以较小的量用在这些混合物和组合物中。
81.本发明还涉及粗制、精制或稀释的根据本发明的油或含有它的生物质用于人类或动物食品，特别是新生儿、儿童或孕妇或哺乳妇女用食品的用途。
82.此类用途是本领域技术人员众所周知的，特别是在专利申请wo 2010/107415中和在dsm公司的网站上描述的(https://www.dsm.com/markets/foodandbeverages/en_us/products/nutritional
‑
lipids/life
‑
dha.html)。
83.实施例
84.实施例1：破囊壶菌的高dha含量生物质的脂肪酸谱
85.在锥形瓶中在atcc 790(改良)培养基中生长破囊壶菌菌株(aurantiochytrium mangrovei
‑
fccb1897、fccb1800、ccap4062/8)。用裂殖壶菌属物种的菌株(特别是菌株ccap4087/7)获得了相似的结果。
86.一旦培养物在固定相中，就通过离心回收生物质，并且然后进行冷冻干燥，然后通过gc
‑
fid(从标准iso 12966
‑
2改编的方法)分析生物质的脂肪酸组成。
87.改良atcc 790培养基的组成：
88.酵母提取物
ꢀꢀ
5.0g/l
89.蛋白胨
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5.0g/l
90.d
‑
葡萄糖
ꢀꢀꢀ
30.0g/l
91.海盐
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20g/l
92.表1代表生物质中所含的脂肪酸的组成。结果表示为总脂肪酸含量的百分比。sfa是饱和脂肪酸。
93.表1
[0094][0095][0096]
实施例2：高dha含量菌株的发酵罐培养物
[0097]
在从1至5l可用的发酵罐(生物反应器)中进行培养，所述发酵罐带有专用自动化系统和由计算机工作站进行的监控。它们是使用两株aurantiochytrium mangrovei菌株并且用两种不同的培养方案进行的。通过添加碱(对于实施例b1和b2，用nh4oh，并且对于实施例a，用naoh)将系统调节在ph 5，其中在整个培养时间段期间进行ph调节，并且提供氮供应(在实施例b1和b2的上下文中)。将培养温度设置为30℃，然后设置为22℃，并且最后在培养结束时设置为18℃。
[0098]
菌株ccap4062/7用于实施例a和b1，而菌株fccb1897用于实施例b2。
[0099]
培养基的组成在表2中给出。
[0100]
表2
[0101][0102][0103]
以533:11:1的碳:氮:磷(cnp)摩尔比(实施例a)或用仅由葡萄糖组成的溶液(实施例b1和b2)制造呈富集溶液形式的葡萄糖添加物。
[0104]
培养物监测：
[0105]
通过测量干质量(在whatman gf/f过滤器上过滤，然后在105℃下进行烘箱干燥最少24h，然后称重)来监测总生物质浓度。对于生物质根据从iso 12966
‑
2改编的方法并且对于油根据欧洲药典(european pharmacopoeia 9.0(2.4.29.))进行脂肪酸分析。
[0106]
表3中给出了用条件a、b1和b2获得的生物质的脂肪酸谱。结果表示为总脂肪酸含量的百分比。
[0107]
表3
[0108][0109][0110]
实施例3：在工业条件下的培养
[0111]
高dha含量菌株当在工业规模发酵罐(诸如10m3或180m3罐)中在类似于实施例2的条件下生长时产生具有相似脂肪酸组成的生物质，其中呈富集溶液形式的培养基b和葡萄糖添加物是以533:0.4:1的碳:氮:磷(cnp)摩尔比制造的。
[0112]
表4中给出了在10m3和180m3罐中培养后ccap4062/7菌株生物质的脂肪酸谱。结果表示为总脂肪酸含量的百分比。
[0113]
表4
[0114][0115][0116]
实施例4：从高dha含量菌株的生物质中提取油
[0117]
根据wo 2015/095694(实施例9)中描述的方法从实施例3的生物质(180m3罐)中提取油。所述油的脂肪酸组成与在表4中给出的生物质的组成相似。
[0118]
实施例5：从高dha含量菌株的生物质中提取油
[0119]
通过以下顺序进行在与实施例3相同的条件下产生的生物质的提取
[0120]
(a)通过酶促手段(例如，用来自novozymes的alcalase 2.5l或alcalase 2.4l或novozym 37071)在65℃的温度下进行细胞裂解持续4h，
[0121]
(b)通过将温度降低在5℃与40℃之间进行裂解，持续包括在30分钟与30h之间的持续时间，
[0122]
(c)通过离心板分离机进行机械油分离。
[0123]
提取产率是从生物质中提取的60％脂质。
[0124]
表6中给出了从生物质中提取的油的脂质谱。结果表示为总脂肪酸含量的百分比。
[0125]
表6
[0126][0127][0128]
实施例6：油品质：抗氧化剂和污染物
[0129]
根据实施例3的条件进行若干种异养发酵。根据实施例5的条件从发酵液中提取油。根据以下方法通过lc/dad测量提取的油中的类胡萝卜素：虾青素(包括酯形式)，参考方法：dsm版本1.5 2009；皂化的β
‑
胡萝卜素(顺式和反式总和)，参考方法：en 12823
‑
2:2000；
角黄素，参考方法：roche索引号2264；叶黄素和玉米黄质，参考方法：roche索引号2264。
[0130]
表7
[0131]
批号abcdedha(mg/g fa)670674663700707dha(％mg)70.671.170.672.272.4β
‑
胡萝卜素(mg/kg fa)1414.113.411.711.9虾青素(mg/kg fa)46.141.438.22825.9虾青素酯(mg/kg fa)24.54.74.85角黄素(mg/kg fa)3.53.33.23.73.8总类胡萝卜素(mg/kg fa)65.663.359.648.346.6加德纳指数14.816.7>1812.312.3茴香胺指数1.171.130.541.351.97过氧化氢指数(meq/kg)10.10.110.1
[0132]
还在相同批次中测定污染物，诸如缩水甘油以及2
‑
mcpd和3
‑
mcpd。
[0133]
表8
[0134][0135]
实施例7：粘度
[0136]
通过粘度计(viscoman，gilson)在不同温度下测量在与实施例5类似的条件下产生和提取的油的粘度。根据标准iso 6321评估熔融温度。
[0137]
表9
[0138][0139]
参考文献
[0140]
‑
ep 0 223 960；ep 1 001 034
[0141]
‑
us 2014/323569,us 2017/016036,us 2017/335356
[0142]
‑
wo 1994/008467；wo 1997/037032；wo 2001/054510；wo 03/049832；wo 2010/107415；wo 2012/035262；wo 2013/136025；wo 2013/136028；wo 2014/146098；wo 2015/004402；wo 2015/004403；wo 2015/150716；wo 2016/030631,wo 2017/094804
[0143]
‑
fedorova
‑
dahms i.&al.,safety evaluation of dha
‑
rich algal oil from schizochytrium sp,food and chemical toxicology,2011,49,3310
‑
3318
[0144]
‑
folch j,et al.,a simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.j biol chem.1957may；226(1):497
‑
509
[0145]
‑‑
hamilton m.&al.,heterotrophic production of omega
‑
3 long
‑
chain polyunsaturated fatty acids by trophically converted marine diatom phaeodactylum tricornum,marine drugs,2016,14,53
[0146]
‑‑
omega
‑
3long chain fatty acid“bioavailability”:a review of evidence and methodological considerations.
[0147]
‑‑
ghasemifard s,turchini gm,sinclair aj.prog lipid res.2014oct；56:92
‑
108.doi:10.1016/j.plipres.2014.09.001.epub 2014sep 16.review.
[0148]
‑
wakako tsuzuki,study of the formation of trans fatty acids in model oils(triacylglycerols)and edible oils during the heating process,jarq 46(3),215
‑
220(2012)
[0149]
‑
kinuko miyazaki*and kazuo koyama,an improved enzymatic indirect method for simultaneous determinations of 3
‑
mcpd esters and glycidyl esters in fish oils,j.oleo sci.66,(10)1085
‑
1093(2017)
[0150]
‑
jouhet j.,marechal e.,bligny r.,joyard j.,block m.a.(2003).transient increase of phosphatidylcholine in plant cells in response to phosphate deprivation.febs lett.544 63
‑
68.
[0151]
pct
[0152]
(原版电子表格)
[0153]
(本表格不是国际申请的一部分，并且也不视为国际申请的表格)
[0154][0155]
pct
[0156]
(原版电子表格)
[0157]
(本表格不是国际申请的一部分，并且也不视为国际申请的表格)
[0158]