一种蒙药肋柱花提取物、制备方法及用途与流程

1.本发明属于民族药领域；尤其涉及一种蒙药肋柱花提取物、制备方法及用途。


背景技术：

2.肥胖症是who确定由基因、环境和运动因素共同作用引起，特别是由摄入食营养物质过剩导致体内脂肪堆积引起的十大慢性代谢疾病之一。肥胖不仅仅会带来身体形态的改变，更重要的是因超重和肥胖引起的代谢综合症——高血压、高血脂、2型糖尿病、冠心病、恶性肿瘤、多囊卵巢综合症、睡眠呼吸暂停等疾病，已经成为我们生活中的健康的隐形“杀手”。肥胖症体内甘油三酯存储量过多会引起内脏脂肪组织中巨噬细胞的显著积累，从而引起脂肪因子和促炎细胞因子的释放改，如tnf
‑
和il
‑
6等导致代谢异常。因此，肥胖具有持续的全身低水平炎症反应的特点。目前的治疗方法主要有roux
‑
en
‑
y胃分流术、可调节胃束带和袖状胃切除术，认知补救后行为减肥治疗，纳米颗粒抗血管生成疗法治疗、使用hypothalamic brain
‑
derived neurotrophic factor(bdnf)或fibroblast growth factor 21(fgf21)[11]基因疗法，以及肠道菌群等。肠道菌群是人体最大的微生态系统，对机体的物质和能量代谢产生重大影响。目前，肠道微生物群被认为是肥胖发展的重要因素。
[0003]
近年来随着对肠道菌群研究的深入，逐渐发现肠道菌群与肥胖的形成和发展息息相关。肠道菌群栖居在人体肠道内，并且与人体相互依赖生存的细菌构成的微生物群。人体的肠道有100～1500种近数百万亿个细菌，其数目与人体细胞总数接近，比例约1∶1。肠道菌群对人体健康和维持人体生理功能具有巨大的影响和作用，例如可调节机体免疫系统和代谢异常性疾病，也可以通过对肠道上皮细胞的影响来控制人体对能量的吸收。长期进食高脂、高糖饮食，可造成肠道菌群紊乱，使有益菌比例下降，而致病菌比例增加。肠道菌群的失调还会导致肠道黏膜通透性的增加和慢性炎症的发生。
[0004]
蒙药肋柱花〔lomatogoniumrotatum(l.)fries ex nym.〕,蒙古名哈比日根
‑
地格达，1998年被载入《中华人民共和国卫生部药品标准
·
蒙药分册》，具有平息“协日”，清热，健胃，愈伤等功能。近期研究表明蒙药肋柱花中的山酮类化合物、獐牙菜苦苷、木犀草素、齐墩果酸等成分具有不同程度的保肝、利胆活性，为肋柱花的主要活性成分之一。研究者发现蒙药肋柱花除了有保肝利胆作用外，其黄酮类化合物1
‑
羟基
‑
3,5,8
‑
三甲氧基黄酮、l
‑
羟基
‑
3,7,8
‑
三甲氧基黄酮、甲基獐牙菜苦苷和6,8
‑
二羟基
‑
1,2
‑
二甲氧基黄酮可以治疗肥胖相关疾病，例如可减轻高糖食物摄入引起的高胆固醇血症和高甘油三酯血症，并改善胰岛素抵抗大鼠的脂质和瘦素代谢。然而，肋柱花是否具有调节肠道微生物群预防肥胖的潜在作用还未报道。因此，本发明选用蒙药肋柱花为原料，深入探究其对肠道菌群的影响。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供了一种蒙药肋柱花提取物、制备方法及用途。
[0006]
本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007]
将km雄性小鼠给予高脂饲料建立肥胖模型。待8w之后，除普通饮食组(nd)，肥胖模
型小鼠(以nd组为实验对照组，体重大于nd组小鼠的20％)随机分为高脂饮食组(high fat diet group，hfd)，肋柱花高剂量组(lr1.8g/kg)、肋柱花中剂量组(lr0.9g/kg)、肋柱花低剂量组(lr0.18g/kg)和阳性对照组(orlistat，0.048g/kg)。每周观察并记录小鼠体重和摄食量。连续给药9周后检测相关减肥指标。收集小鼠新鲜粪便，运用16s rdna amplicon测序技术检测菌群情况。
[0008]
本发明涉及一种蒙药肋柱花提取物，将肋柱花全草经二氯甲烷溶液浸泡，用乙醇提取，干燥，得到肋柱花提取物。
[0009]
本发明还涉及前述的肋柱花提取物的制备方法，包括如下步骤：
[0010]
步骤1，将蒙药材肋柱花全草，阴凉处晾干，粉碎；
[0011]
步骤2，用二氯甲烷溶液浸泡一夜后，每2小时提取一次，提取2次；
[0012]
步骤3，药渣用95％乙醇浸泡一夜后，每3小时提取一次，提取2次，回收乙醇，冷冻干燥机制成粉末。
[0013]
本发明还涉及前述的蒙药肋柱花提取物的用途，用于肠道菌群构成比率调节剂中的制备。
[0014]
本发明所涉及的蒙药肋柱花提取物用于肠道菌群构成比率调节剂，将本发明所涉及的肋柱花提取物给药高脂模型小鼠，最终改变了小鼠肠道微生物群的组成，使高脂模型小鼠肠道菌群firmicute、proteobacteria相对丰度，firmicute/bacteroidetes比值下降，bacteroidetes相对丰度增加，最终使得本发明所涉及的肋柱花提取物给药改变了小鼠肠道微生物群的组成；本发明通过调节高脂饮食所导致的肠道菌群紊乱，达到减肥作用。
[0015]
本发明具有以下优点：
[0016]
本发明所涉及的蒙药肋柱花提取物给药改变了小鼠肠道微生物群的组成，使高脂模型小鼠肠道菌群firmicute、proteobacteria相对丰度和firmicute/bacteroidetes比值下降，bacteroidetes相对丰度增加，所以本发明所涉及的肋柱花提取物通过调节高脂饮食所导致的肠道菌群紊乱，达到减肥作用。
附图说明
[0017]
图1是蒙药肋柱花提取物对hfd饮食肥胖小鼠肠道微生物群alpha多样性的影响图；
[0018]
图2是蒙药肋柱花提取物对hfd饮食肥胖小鼠肠道微生物群beta多样性的影响图；
[0019]
图3是蒙药肋柱花提取物对hfd饮食肥胖小鼠肠道微生物群结构组成的影响图。
具体实施方式
[0020]
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。
[0021]
实施例
[0022]
本实施例涉及肋柱花提取物、制备方法及用途。
[0023]
一、实验仪器
[0024]
varioskan
tm
lux多功能微孔板读数仪(thermo fisher scientific
‑
cn)，
[0025]
sigma 3
‑
18ks高速冷冻离心机，
[0026]
fd
‑
1a
‑
50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)，全自动生化仪电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。
[0027]
二、实验药品与试剂
[0028]
肋柱花采自内蒙古锡林郭勒盟西乌旗，经内蒙古民族大学蒙医药学院布和巴特尔教授鉴定为龙胆科植物肋柱花lomatogoniumcarinthiacum(wulf)reichb.的干燥全草。
[0029]
高脂饲料(山东恒容生物科技有限公司)，
[0030]
普通饲料(辽宁长生生物技术股份有限公司)。
[0031]
三、实验动物
[0032]
实验选用雌雄sps级km小鼠，5周龄，体质量(35
±
2)g，80只，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物许可证号：scxk(辽)2015
‑
0001。
[0033]
四、方法
[0034]
4.1肋柱花提取物的制备
[0035]
将蒙药材肋柱花全草，阴凉处晾干粉碎后再用二氯甲烷溶液浸泡一夜后4h提取2次，药渣用95％乙醇浸泡一夜后6h提取2次，回收乙醇，再用使用冷冻干燥机制成粉末。
[0036]
4.2动物分组、造模、给药和样品采集
[0037]
将80只sps级km小鼠适应性饲养1周后，随机分为2组，10只给予普通饲料为普通饮食组(normal diet group，nd)，其余给予高脂饲料建立肥胖模型，自由饮水、摄食，动物房内12h昼夜循环，室温(22
±
2)℃，相对湿度40％～50％。待8周之后，以普通饮食组为实验对照组，剔除抗肥胖小鼠，以平均体重超过20％为肥胖标准，确定肥胖模型。待造模成功后，在高脂饲料喂养的基础上将肥胖模型随机分为高脂饮食组(high fat diet group，hfd)、肋柱花高、中、低剂量组(1.8g/kg、0.9g/kg、0.18g/kg)组和阳性对照(orlistat，0.048g/kg)组，每组n＝10只。nd和hfd给予同等体积的生理盐水，每天1次，连续灌胃给药9周。在此期间每周观察并记录小鼠体质量、摄食量。实验末次给药后，禁食12h，不禁水，测体重后10％水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉后测量体长，肥胖指数(lee’s指数)，采集血清，称取肾周、睾周、肠周脂肪和肝组织，在结肠部分收集粪便样品后立即在液体氮气中冷冻，并储存在
‑
80℃。
[0038]
4.3肠道微生物群分析
[0039]
小鼠处死后立即从结肠取新鲜粪便标本，液氮速冻后保存于
‑
80℃，利用thermo nanodrop 2000紫外微量分光光度计和1％琼脂糖凝胶电泳进行总dna质检。16s rdna扩增选择区域为v3
‑
v4区，使用的通用引物为341f和806r(f：cctacgggrsgcagcag；r：ggactacvvgggtatctaatc)。以稀释后的基因组dna为模板，使用kapa hifi hotstartreadymix pcr kit高保真酶进行pcr，确保扩增的准确性和高效性。用2％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，并用axyprep dna凝胶回收试剂盒(axygen公司)切胶回收pcr产物。
[0040]
回收后，利用thermo nanodrop 2000紫外微量分光光度计和2％琼脂糖凝胶电泳进行文库质检。文库质检合格后，使用qubit进行文库定量，并根据每个样品的数据量要求，进行相应比例的混合。使用illumina miseq pe250进行上机测序。设计16s特定引物扩增特异区域，得到425bp左右扩增片段。加接头，采用illumina平台，测序得到pe250的paired
‑
end数据，通过拼接得到较长序列，从而进行16s分析。
[0041]
对原始数据进行qc后，用usearch软件对数据进行去嵌合体和聚类分析，usearch
聚类时，先将reads按照丰度从大到小排序，通过97％相似度进行聚类，得到otu(operational taxonomic units)，每个otu被认为可代表一个物种。统计每个样品匹配到otu的reads数，为避免因样品测序数据大小不同造成分析的偏差，在测序深度足够的情况下，依据匹配到otu的最小序列数进行随机抽平处理，进行alpha diversity分析。从每个otu中分别提取一条read作为代表序列，将该代表序列与rdp(核糖体数据库项目)数据库比对，对每个otu进行物种分类，得到物种丰度表。
[0042]
alpha diversity通过observed species指数、chao1指数、shannon指数、simpson指数以及pd_whole_tree5个指数对样本物种多样性的复杂性进行了分析。用beta diversity分析来比较各样品在物种多样性方面存在的差异。alpha diversity和beta diversity分析均采用qiime软件进行分析。为了进步展示样品间物种多样性差异和不同的环境样本中微生物进化的差异程度采用主坐标分析((principal coordinates analysis，pcoa))和算术平均未加权配对组法(unweighted pair group method with arithmetic mean，upgma)聚类。lefse采用线性判别分析(lda)来估算每个组分丰度对差异效果影响的大小，找出对样品划分产生显著性差异影响的群落或物种。使用kruskal
‑
wallis秩和检验和wilcoxon秩和检验的方法对不同分组之间进行显著性差异分析，以找出对组间划分产生显著性差异影响的物种。
[0043]
试验数据首先利用excel软件对其进行预处理，统计图均采用graphpad prism 8.0.2作图。计量资料以表示，组间数值比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验。多组间比较采用anova方差分析，以p＜0.05为差异有统计学意义。
[0044]
五、实验结果
[0045]
5.1肋柱花提取物对肥胖小鼠肠道菌群结构的影响
[0046]
通过使用illumina miseq平台对16s rrna(v3 v4区域)进行测序，研究hfd和lr0.18g/kg对小鼠肠道菌群的影响。根据97％的同一性水平，nd、hfd和hfd lr0.18g/kg组(每组n＝6)的otu平均值分别为516、548和506，hfd组的otu高于nd组，而肋柱花给药显着降低otu数目。如图1肋柱花对hfd饮食肥胖小鼠肠道微生物群alpha多样性的的影响图，其中，a
‑
b为shannon和bserved_species曲线图，c
‑
d为shannon和bserved_species多样性指数，每条线代表一个样本，随着样本量的增加，线条在逐渐趋于平缓，由shannon曲线图可见，测序的深度已经满足了检测样品中的所有物种。如图1中，c、d图所示，bserved_species和shannon指数中hfd组和nd组存在显著性差异，hfd组菌群多样性显著高于nd组，肋柱花治疗后改变了这一情况(
*
p＜0.05)。
[0047]
见图2肋柱花对hfd饮食肥胖小鼠肠道微生物群beta多样性的影响图所示，其中a为基于otu丰度的肠道微生物pcoa图，b为基于otu的非加权组平均法层次聚类分析图；pcoa和upgma层次聚类分析用于显示不同的环境样本中肠道微生物群组成的差异程度，结果见图2中a图，显示hfd组与nd组分开聚类，相比与hfd组，nd组和hfd lr0.18g/kg组的肠道微生物组成更加相似(p＜0.05)，表明肋柱花提取物对hfd喂养小鼠肠道菌群组成有实质性影响。此外，pc1占总方差的23.74％，其总方差高于pc2占13.44％的总方差，表明肋柱花提取物可以将受hfd影响的肠道微生物组成恢复到趋于nd组的正常状态。结果见图2中的b图，如预期的那样，在nd、hfd和hfd lr0.18g/kg组的样本进化树的结果中也观察到了明显的分离，这与pcoa的结果一致。
[0048]
见图3肋柱花对hfd饮食肥胖小鼠肠道微生物群结构组成的影响图所示，其中a
‑
b图为肠道微生物群门水平样品组成分析图，c图为肠道微生物群属水平样品组成分析图；由附图3中的a、b图可见，通过门分类柱状图可以发现，小鼠肠道微生物区系结构主要由菌门水平的firmicutes和bacteroidetes组成。高脂饮食肥胖可明显改变肠道微生物群落结构，因此除了个别样本个体差异外，与nd组相比hfd组中厚壁菌门(firmicutes)和变形杆菌门(proteobacteria)相对增多，拟杆菌门(bacteroidetes)相对减少。lr 1.8g/kg给药降低了firmicutes和proteobacteria，增加了bacteroidetes和firmicutes/bacteroidetes比值。因此肋柱花可以明显地将由高脂饮食所增加的菌减弱到类似于nd组的水平。如附图3中的c在属水平差异物种分析图所示，hfd组与nd组菌群存在的差异菌属有clostridium xlva、roseburia、desulfovibrio、acetatifacto、pseudoflavonifractor、黄杆菌属(flavonifractor)等6个属。肋柱花给药后显著降低clostridium xlva、roseburia、acetatifactor、pseudoflavonifractor属水平，增加了desulfovibrio属水平。这些结果表明，肋柱花可能改善hfd引起的肠道菌群失调。
[0049]
人或动物的饮食量受多方面的影响而有所不同，例如，心情、运动、食物气味或胃肠激素。因许多有毒物质都含有苦味，所以当动物接触苦味物质使产生强烈的厌恶感。苦味作为一种重要的防御机制，通过苦味物质与苦味受体(t2rs)相互作用，再经过神经递质等传递在大脑中产生味觉。苦味物质与胃肠激素也有密切关联。已有研究发现奎宁等苦味物质则通过与苦味受体t2rs结合，刺激l细胞分泌glp
‑
1激素而glp
‑
1具有降血糖、调节脂代谢和肥胖、调节食物的摄取及对胃排空也有所影响。研究发现，t2rs也在肠道内分泌细胞中选择性地表达，当使用苯甲地那铵(bd)等苦味激动剂刺激分泌胰高血糖素样多肽1(stc
‑
1)细胞时，迅速升高胞内ca
2
浓度。ca
2
浓度的升高会促进胆囊收缩素(cck)的释放,进而调节胃肠蠕动和胃排空。
[0050]
机体处于正常状态下宿主与微生物群处于微生态平衡的主要原因是肠道内菌群之间保持着相互依赖相互制约的关系。当人体处于健康状态时，肠道中bacteroidetes和firmicute处于优势地位，占菌群数量的90％以上。已研究表明，与瘦组相比，肥胖组的bacteroidetes的相对比例降低，而firmicute的相对比例增加。并且随着体重减轻bacteroidetes增加，而firmicute降低。还有研究表明，长期喂养高脂饮食会使机体f/b比值增加，而本发明证实了肋柱花提取物会降低由高脂饮食引起的f/b比值增加。
[0051]
机体会发生肥胖是由于一些革兰氏阴性细菌如proteobacteria等致病菌细胞壁外壁会引起肠道内大量脂多糖的产生，脂多糖会使肠屏障受损，增加肠道通透性，导致脂肪累积量增多。其次革兰氏阴性菌的结构特性导致其鞭毛更易吸收脂质成分，引起脂肪累积量不断增多，导致肥胖发生并发展。同样，本发明成功证实了肋柱花提取物会使肠道proteobacteria相对丰度降低，减少肥胖。
[0052]
bacteroidetes和firmicutes与机体的减肥有密切关系，研究表明，肠道微生物群在肥胖机体中通过促进营养物质的消化和吸收在脂肪形成中发挥作用。因此，调节proteobacteria、bacteroidetes和firmicutes相对丰度可能是肋柱花具有减肥作用的原因之一。
[0053]
总之，肋柱花提取物干预可抑制高脂饮食引起的体重增加和脂肪积累，调节血清血脂指标，具有减肥作用。此外，肋柱花提取物可以调节高脂饮食所引起的小鼠肠道菌群紊
乱，如降低firmicutes、proteobacteria相对丰度和f/b比值，增了bacteroidetes相对丰度。这些结果表明，通过肋柱花提取物调节肠道菌群紊乱，可以有效减肥的目的。
[0054]
本发明16s rrna分析表明，肋柱花提取物给药改变了小鼠肠道微生物群的组成，使高脂模型小鼠肠道菌群firmicute、proteobacteria相对丰度和firmicute/bacteroidetes比值下降，bacteroidetes相对丰度增加。结论肋柱花提取物通过调节高脂饮食所导致的肠道菌群紊乱，达到减肥作用。
[0055]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。