一种木薯抗低温制剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及作物抗低温制剂技术领域，特别涉及一种木薯抗低温制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.木薯适宜生长的年平均气温要求高于20℃，若温度低于15℃时将会抑制木薯的生长，如果温度继续降低将会导致木薯死亡。近十几年来，国内学者为了研究木薯抗低温特性，主要从低温胁迫对木薯植株形态和生理生化的影响方面进行探索，通过观察木薯在低温胁迫试验期间酶类、激素调节等确定主要的生理生化指标，为抗低温植株的筛选提供参考意义。
3.在外界环境因素的刺激下植物会对体内活性赤霉素(gibberellins，gas，ga)的水平进行调控，以此来维持植物的生长发育，信号通路在体内gas平衡的调控中起到了重要的作用。最近对gas的研究发现，gas合成与信号传导中的相关基因及调控蛋白与植物的抗逆性有着密切的关系。植物可通过对赤霉素相关代谢基因表达调控来适应外界不利环境，例如合成代谢相关基因ga20oxs、ga3oxs和ga2oxs，以及dellas等ga信号传导相关蛋白等。
4.植物应答低温胁迫是个复杂的过程。近期的研究发现赤霉素相关基因也参与植物耐低温的调控过程，其中cbf/dreb1是植物对低温胁迫适应过程中的最重要元件，如中国专利cn1876813a《一种提高结缕草抗寒性的方法》研究发现将拟南芥冷诱导基因的转录激活因子基因cbf1/dreb1b转化结缕草胚性愈伤组织，可提高结缕草的抗寒性。现有研究发现在过表达cbf1基因的拟南芥中，cbf1诱导的cor15b发生过量表达提高了植物耐寒性，但也减缓了植物的生长，造成植株矮小。这种植株矮小表型，可通过外施gas得到消除。基于这些结果进一步分析发现cbf1的表达使della蛋白家族中的gai和rga产生积累。而della蛋白作为赤霉素信号通路中的重要元件，其量的积累会造成植株矮化，外施gas可以消除矮化表型，因此della的积累应该源于gas合成量的降低。对gas合成相关基因的分析发现cbf1转基因材料中，ga2ox3和ga2ox6基因表达出现了上调，抑制了活性gas的合成。这一研究说明，在植物耐低温的响应中，赤霉素合成代谢和信号传导过程紧密参与其中，并直接影响了植物表型。
5.多肽激素被证明调控植物生长、发育及抗逆等许多生命过程，肽激素相关研究是生物学重点与热点方向。基于配体
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受体的细胞
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细胞通讯系统是复杂多细胞生物建立的重要分子基础之一。目前研究已经确定了几个植物激素分子在这些过程中起作用。最近在分子生物学分析方面的进展已经确定了植物激素受体和信号传递介质，并导致了许多肽基信号分子的发现。随后的分析揭示了这些肽在植物生命周期的多个方面的参与和贡献，包括发育和环境反应，类似于典型的植物激素的功能，说明这些肽激素是植物中关键调节因子。肽激素从基因组中转录成肽，多肽再经过进一步的翻译后修饰，才能够发挥其功能。肽激素在特定的细胞或组织中表达和分泌，肽类激素受体复合物通过下游分子激活细胞内信号，包括激酶和转录因子，然后触发细胞事件。
6.植物多肽被证明参与生长素、脱落酸等激素调节过程，从而实现对植物生命过程的调节，但植物多肽是否参与调节ga还未见报道。成熟多肽是由前体蛋白经过翻译后剪切、修饰，最终形成只有较短氨基酸并具有功能活性的多肽分子，该具有活性的多肽分子可以被位于细胞膜上特异的受体感知，进而在植物体内引起信号转导，从而导致植物体内一系列生理生化反应。成熟多肽直接外施对植物生长可产生影响，如气孔关闭等。但目前成熟多肽在植物尤其是作物上的应用研究很少，更没有将其应用于促进植物抗低温方面。


技术实现要素：

7.针对上述问题，本发明提出一种木薯抗低温制剂及其制备方法和应用。
8.本发明所述一种木薯抗低温制剂的功能成份为木薯ida成熟多肽。
9.进一步的，所述木薯ida成熟多肽的氨基酸序列为gvgvpippsgpskrhn。
10.进一步的，每1升所述木薯抗低温制剂含有15～30μg木薯ida成熟多肽、10～50g枸橼酸钠，0.1～1.0g枸橼酸，5～10g聚山梨酯
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80和100～200g甘油。
11.进一步的，每1升所述木薯抗低温制剂含有15μg木薯ida成熟多肽、10g枸橼酸钠，0.1g枸橼酸，5g聚山梨酯
‑
80和100g甘油。
12.进一步的，所述木薯抗低温制剂还包括助剂；
13.进一步的，所述助剂可以为本领域用于叶面润湿和叶面延展的常规助剂，但是可以理解的是，本领域任何常用的叶面用助剂均可加入从而促进本发明的ida成熟多肽抗低温制剂的应用，例如本领域的表面活性剂、延展剂、润湿剂等，助剂加入量为本领域技术人员根据经验进行添加。
14.另一方面，本发明还提供了所述木薯抗低温制剂的制备方法，具体的，包括以下步骤：
15.(1)配制木薯ida成熟多肽：将木薯ida成熟多肽粉末溶解在溶剂中，配制成ida成熟多肽母液；
16.(2)配制枸橼酸钠
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枸橼酸缓冲液：将枸橼酸钠和枸橼酸混合，配制成枸橼酸钠
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枸橼酸缓冲液；
17.(3)木薯抗低温制剂的制备：向步骤(1)得到的ida成熟多肽母液加入步骤(2)制得的枸橼酸钠
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枸橼酸缓冲液溶液，再加入聚山梨酯
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80、甘油，搅拌均匀，得木薯抗低温制剂。
18.进一步的，所述溶剂为水或二甲基亚砜。
19.进一步的，由于ida成熟多肽对储存温度有较高要求(不易在室温放置超过24小时)，因此ida成熟多肽母液一般为现用现配；若配制的ida成熟多肽母液在30天内不使用，则需将其置于
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70℃储存；若配制的ida成熟多肽母液在30天之内使用，则需将母液置于
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20℃储存；若配制的ida成熟多肽母液在一周之内使用，将其置于4℃储存即可。
20.进一步的，所述枸橼酸钠
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枸橼酸缓冲液的ph值为6.0～6.5。
21.进一步的，所述木薯抗低温制剂在木薯抗低温方面中的应用。
22.进一步的，所述应用的方法为在低温来临前，将木薯抗低温制剂喷洒于木薯的叶面或用木薯抗低温制剂浸泡棉球后，用棉球涂抹叶面；所述叶面为叶片完全伸展的叶面；所述低温为温度≤15℃。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
24.(1)本发明的木薯抗低温制剂可有效提高木薯对低温冷害的耐受能力，它能够促进木薯体内赤霉素失活基因ga2ox1的表达，从而使其抵抗低温的能力加强，使木薯可以在较低的温度下具有较强的生长势，在南方早冬遭遇低温冷害时保持较高光合同化性能，并获得较高的产量。
25.(2)本发明的木薯抗低温制剂中的ida成熟多肽人工合成方便，易于获得，可大批量合成；
26.(3)本发明的木薯抗低温制剂的配制和使用方法简单，田间可操作性强，对于施用人员不需要经过特殊培训，操作便利、实用。
附图说明
27.图1为本发明木薯抗低温制剂喷施木薯后进行低温处理表型图，图中左侧为本发明木薯抗低温制剂处理后的木薯，右侧为水处理后的木薯；
28.图2为本发明木薯抗低温制剂喷施木薯后进行低温处理影响ga失活基因ga2ox1基因的表达图；
具体实施方式
29.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.实施例1
31.每1升木薯抗低温制剂，包括：30μg木薯ida成熟多肽、50g枸橼酸钠、1g枸橼酸、10g聚山梨酯
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80和200g甘油，用二甲基亚砜溶剂补足1升。
32.该木薯抗低温制剂制备方法，包括以下步骤：
33.(1)配制木薯ida成熟多肽母液：取木薯ida成熟多肽粉末溶解在二甲基亚砜溶剂中，配制成ida成熟多肽母液；
34.(2)配制枸橼酸钠
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枸橼酸缓冲液：取枸橼酸钠和枸橼酸混合，配制成枸橼酸钠
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枸橼酸缓冲液，并调节溶液ph值为6.0；
35.(3)木薯抗低温制剂的制备：向步骤(1)得到的ida成熟多肽母液加入步骤(2)制得的枸橼酸钠
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枸橼酸缓冲液溶液中，再依次加入聚山梨酯
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80和甘油，搅拌均匀，得木薯抗低温制剂。
36.实施例2
37.每1升木薯抗低温制剂，包括：15μg木薯ida成熟多肽、10g枸橼酸钠、0.1g枸橼酸，5g聚山梨酯
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80和100g甘油，用水补足1升。
38.制备方法如下：
39.(1)配制木薯ida成熟多肽母液：取木薯ida成熟多肽粉末溶解在水中，配制成ida成熟多肽母液；
40.(2)配制枸橼酸钠
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枸橼酸缓冲液：取枸橼酸钠和枸橼酸混合，配制成枸橼酸钠
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枸橼酸缓冲液，并调节溶液ph值为6.2；
41.(3)木薯抗低温制剂的制备：向步骤(1)得到的ida成熟多肽母液加入步骤(2)制得的枸橼酸钠
‑
枸橼酸缓冲液溶液中，再依次加入聚山梨酯
‑
80和甘油，搅拌均匀，得木薯抗低温制剂。
42.试验例1
43.供试材料：木薯品种(tms60444)。
44.试验方法：
45.①
将木薯的茎段切成长1.5cm左右，并带有一个芽的茎，将其置于ms平板上栽培2周，再移栽到营养土中栽培4周，栽培的温度为26
±
2℃，光周期为光照16h，黑暗8h；
46.②
栽培结束后，将实施例2的木薯抗低温制剂稀释后用于的处理植株(稀释后ida成熟多肽的浓度为20μm/ml)，将生长状况一致(约5厘米高，2
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3片叶)的植株移至4℃的环境中进行低温处理；同时设置未使用木薯抗低温制剂处理的植株作为空白对照组；
47.③
在低温处理24h后，收集部分植株茎尖和嫩叶，用液氮冷冻，提取木薯叶片rna，rna的提取按天根公司rna提取剂的方法进行，提取rna后将rna反转录成cdna，采用定量pcr的方法对ga2ox1的表达进行分析，以空白对照组为对照，进行作图分析；并将植株在温度为26
±
2℃，光周期为光照16h，黑暗8h的条件下培养3天，做3次重复实验，观察表型；
48.从图1中可以看出，本发明木薯抗低温制剂处理后的植株的生长情况明显优于空白对照组，说明使用本发明木薯抗低温制剂可增强木薯的抗低温能力，能使木薯在较低的温度下具有较强的生长势。
49.从图2中可以看出，本发明木薯抗低温制剂处理后的植株，其ga失活基因ga2ox1的表达量高于空白对照组，说明ga2ox1的过表达能够提高木薯对低温的抵抗能力。
50.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。