一种高效液相色谱法检测米洛巴林及其对映体杂质的方法与流程

1.本发明属于药物分析领域，具体涉及一种高效液相色谱法检测米洛巴林及其对映体杂质的方法。


背景技术：

2.米洛巴林（mirogabalin、ds
‑
5565）是第一制药三共株式会社研发的一种药物，与加巴喷丁和普瑞巴林（pregabalin）等药物类似。米洛巴林是一种新型的优先选择性α2δ
‑
1配体，对中枢神经系统(cns)中电压敏感性钙通道复合物的α2δ
‑
1亚基具有高效性和选择性。米洛巴林结合α2δ钙通道(1和2)，但效能显著高于普加巴林。在治疗糖尿病周围神经性疼痛的ii期临床试验中显示了良好的效果。其结构式如下：。
3.米洛巴林的原料药是苯磺酸盐形式存在，且结构式中双键较少，紫外吸收较弱；化合物有明显的酸性和碱性基团，极性较大；化合物中有手性中心，也有顺反异构，对映体分离较差，在正相方法开发中受到不少限制，目前暂无文献报道米洛巴林及其对映体杂质的分离检测方法。米洛巴林对映体杂质结构式如下：。


技术实现要素：

4.本发明提供一种高效液相色谱法检测米洛巴林及其对映体杂质的方法：1）色谱条件：色谱柱chiral
‑
agp采用α1
‑
酸性糖蛋白键合硅胶为填充剂；采用浓度为5～30 mmol/l的乙酸铵缓冲溶液
‑
异丙醇为流动相，其比例为97～99∶3～1；检测波长为200 nm～210 nm；柱温为20～25 ℃；流动相流速为0.2～0.5 ml/min；2）供试品溶液的配制：将样品用水溶解；3）测定：精密量取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。
5.本方法所述流动相5～30 mmol/l的乙酸铵缓冲溶液
‑
异丙醇的比例为97∶3。
6.本方法所述流动相5～30 mmol/l的乙酸铵缓冲溶液
‑
异丙醇的比例为98∶2。
7.本方法所述流动相5～30 mmol/l的乙酸铵缓冲溶液
‑
异丙醇的比例为99∶1。
8.本方法所述乙酸铵缓冲溶液的浓度为10～20 mmol/l；优选为15 mmol/l。
9.本方法所述流动相流速为0.3～0.4 ml/min。
10.本方法所述检测波长为205 nm。
11.本方法所述柱温为22～25 ℃。
12.本方法所述色谱柱为大赛璐chiral
‑
pak
®ꢀ
agp 0.4 cm i.d.
ꢀ×
15 cm l
ꢀ×
5 um。
13.分离度，用于评价待测物质与被分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统分离效能的关键指标，用r表示，r等于相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。r越大，表明相邻两组分分离越好。一般说当r＜1.0时，两峰有部分重叠，当r＝1.0时，分离度可达98%，当r＝1.5时，分离度可达99.7%。
14.本发明提供的高效液相色谱法检测米洛巴林及其对映体杂质的方法可实现米洛巴林主成分与其对映体杂质分离度r ≥ 1.8，供试品溶液连续进样6次对映体杂质含量rsd ≤ 0.1%，进样重复性良好，方法耐用性好，可用于米洛巴林的质量控制。
附图说明
15.图1、实施例2方法专属性实验
‑
空白溶液。
16.图2、实施例2方法专属性实验
‑
消旋体定位。
17.图3、实施例2方法专属性实验
‑
苯磺酸定位。
18.图4、实施例2方法专属性实验
‑
供试品溶液。
具体实施方式
19.实施例1：色谱条件的筛选通过色谱柱、流动相、波长、流速等进行筛选确定色谱条件。
20.实施例1
‑
a色谱柱：大赛璐adh 250
×
4.6mm，5um；检测波长：265 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 ul；流速：0.5 ml/min；流动相为正己烷∶乙醇=90∶10，按照0 min、60min等度洗脱；结论：采用中性体系和大赛璐adh色谱柱，出峰较早，峰型较差。
21.实施例1
‑
b尝试在实施例1
‑
a的基础上，流动相中加入三氟乙酸和二乙胺；色谱柱：大赛璐adh 250
×
4.6mm，5um；检测波长：265 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 ul；流速：0.5 ml/min；流动相为正己烷∶乙醇∶三氟乙酸∶二乙胺=90∶10∶0.05∶0.1；按照0 min、60min等度洗脱；结论：在实施例1
‑
a基础上流动相中加入三氟乙酸和二乙胺，米洛巴林主成分及对映体出峰较早，峰型稍有改善，但未分离。
22.实施例1
‑
c尝试在实施例1
‑
a的基础上换用ash柱；色谱柱：大赛璐ash 250
×
4.6mm，5um；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 ul；流速：0.5 ml/min；流动相为正己烷∶乙醇=90∶10，按照0 min、60min等度洗脱；结论：采用大赛璐ash色谱柱，米洛巴林主成分及对映体未分离。
23.实施例1
‑
d
尝试在实施例1
‑
c的基础上，调整流动相；色谱柱：大赛璐ash 250
×
4.6mm，5um；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 ul；流速：0.5 ml/min；流动相为正己烷∶异丙醇∶三氟乙酸∶二乙胺=90∶10∶0.1∶0.05，按照0 min、60min等度洗脱；结论：在实施例1
‑
c基础上调整流动相，米洛巴林主成分及对映体出峰较早，且峰型不佳，响应较低。
24.实施例1
‑
e尝试在实施例1
‑
d的基础上，继续调整流动相；色谱柱：大赛璐ash 250
×
4.6mm，5um；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 ul；流速：0.5 ml/min；流动相为正己烷∶乙醇∶三氟乙酸∶正丁胺=90∶10∶0.03∶0.05，按照0 min、60min等度洗脱；结论：在实施例1
‑
d基础上调整流动相，米洛巴林主成分及对映体出峰稍提前，峰型稍有改善，但灵敏度不满足检测要求。
25.实施例1
‑
f尝试在实施例1
‑
e的基础上，换用ic柱；色谱柱：大赛璐ic 250
×
4.6mm，5um；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 ul；流速：0.5 ml/min；流动相为正己烷∶乙醇∶三氟乙酸∶正丁胺=90∶10∶0.03∶0.05，按照0 min、60min等度洗脱；结论：采用大赛璐ic色谱柱，米洛巴林主成分及对映体未分离。
26.实施例1
‑
g尝试在实施例1
‑
e的基础上，换用ay柱；色谱柱：大赛璐ay 250
×
4.6mm，5um；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 ul；流速：0.5 ml/min；流动相为正己烷∶乙醇∶三氟乙酸∶正丁胺=90∶10∶0.03∶0.05，按照0 min、60min等度洗脱；结论：采用大赛璐ay色谱柱，米洛巴林主成分及对映体未分离。
27.实施例1
‑
h尝试在实施例1
‑
e的基础上，换用oj柱；色谱柱：大赛璐oj 250
×
4.6mm，5um；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 ul；流速：0.5 ml/min；流动相为正己烷∶乙醇∶三氟乙酸∶正丁胺=90∶10∶0.03∶0.05，按照0 min、60min等度洗脱；结论：采用大赛璐oj色谱柱，米洛巴林主成分及对映体未分离。
28.实施例1
‑
i尝试大赛璐agp柱；色谱柱：大赛璐chiral
‑
pak
®ꢀ
agp 0.4 cm i.d.
ꢀ×
15 cm l
ꢀ×
5 um；
检测波长：205 nm；柱温：20 ℃；进样量：5 ul；流速：0.4 ml/min；流动相为10 mmol/l乙酸铵∶异丙醇=98∶2，按照0 min、20min等度洗脱；结论：采用大赛璐agp色谱柱，米洛巴林主成分及对映体杂质实现分离，分离度1.83。
29.实施例2：方法专属性【步骤1】流动相的配制：乙酸铵缓冲溶液（10 mmol/l）配制：称取乙酸铵 0.77 g，加水至1000 ml溶解制得。
30.【步骤2】溶液配制：将米洛巴林样品、苯磺酸样品及消旋体样品分别用水溶解，浓度为1.0 mg/ml。
31.色谱条件如下：色谱柱：大赛璐chiral
‑
pak
®ꢀ
agp 0.4 cm i.d.
ꢀ×
15 cm l
ꢀ×
5 um；检测波长：205 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 ul；流速：0.3 ml/min；流动相为10 mmol/l乙酸铵∶异丙醇=98∶2，按照0 min、20min等度洗脱；结果：米洛巴林保留时间：6.942 min；对映体杂质保留时间：7.760 min；苯磺酸保留时间：4.0 min。
32.本发明方法能实现米洛巴林主成分、对映体杂质和苯磺酸的完全分离，方法专属性好。
33.实施例3：重复性实验取6份供试品溶液，连续进样，记录色谱图，结果如下：（1）保留时间：6.762 min；峰面积：213.2063；主成分含量：99.88%；（2）保留时间：6.753 min；峰面积：212.4482；主成分含量：99.88%；（3）保留时间：6.741 min；峰面积：212.7714；主成分含量：99.89%；（4）保留时间：6.735 min；峰面积：212.2293；主成分含量：99.87%；（5）保留时间：6.733 min；峰面积：211.9069；主成分含量：99.87%；（6）保留时间：6.730 min；峰面积：212.2213；主成分含量：99.89%；重复性实验结果显示：6份供试品溶液连续进样，主成分保留时间、峰面积及含量rsd分别为0.19%、0.22%、0.01%，实验方法重复性好。
34.实施例4：耐用性实验通过将色谱条件的流速、流动相浓度、流动相比例、柱温等进行调整，测定结果不受影响的承受程度。
35.实施例4
‑
a、不同流速耐用性实验色谱条件如下：色谱柱：大赛璐chiral
‑
pak
®ꢀ
agp 0.4 cm i.d.
ꢀ×
15 cm l
ꢀ×
5 um；检测波长：205 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 ul；流速：0.2～0.5 ml/min；流动相为10 mmol/l乙酸铵∶异丙醇=98∶2，按照0 min、20min等度洗脱；结果如下：（1）流速为0.2 ml/min，分离度为2.73；（2）流速为0.3 ml/min，分离度为2.61；
（3）流速为0.4 ml/min，分离度为2.53；（4）流速为0.5 ml/min，分离度为2.42。
36.耐用性不同流速的测试结果显示：本测试方法在流速0.2 ml/min及0.5 ml/min之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
37.实施例4
‑
b、不同流动相浓度耐用性实验色谱条件如下：色谱柱：大赛璐chiral
‑
pak
®ꢀ
agp 0.4 cm i.d.
ꢀ×
15 cm l
ꢀ×
5 um；检测波长：205 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 ul；流速：0.4 ml/min；流动相为5～30 mmol/l乙酸铵∶异丙醇=97∶3，按照0 min、20min等度洗脱；结果如下：（1）乙酸铵缓冲溶液浓度为5 mmol/l，分离度为2.53；（2）乙酸铵缓冲溶液浓度为10 mmol/l，分离度为2.61；（3）乙酸铵缓冲溶液浓度为15 mmol/l，分离度为2.82；（4）乙酸铵缓冲溶液浓度为20 mmol/l，分离度为2.96；（5）乙酸铵缓冲溶液浓度为30 mmol/l，分离度为4.19。
38.耐用性不同流动相浓度的测试结果显示：本测试方法流动相乙酸铵缓冲溶液浓度在5 mmol/l及30 mmol/l之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
39.实施例4
‑
c、不同流动相起始比例耐用性实验色谱条件如下：色谱柱：大赛璐chiral
‑
pak
®ꢀ
agp 0.4 cm i.d.
ꢀ×
15 cm l
ꢀ×
5 um；检测波长：205 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 ul；流速：0.5 ml/min；流动相为15 mmol/l乙酸铵∶异丙醇=97～99∶3～1，按照0 min、20min等度洗脱；结果如下：（1）流动相为15 mmol/l乙酸铵∶异丙醇=97∶3，分离度为1.84；（2）流动相为15 mmol/l乙酸铵∶异丙醇=98∶2，分离度为2.61；（3）流动相为15 mmol/l乙酸铵∶异丙醇=99∶1，分离度为5.08。
40.耐用性不同流动相起始比例的测试结果显示：本测试方法的流动相乙酸铵缓冲溶液
‑
异丙醇起始比例在97∶3及99∶1之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
41.实施例4
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d、不同柱温耐用性实验色谱条件如下：色谱柱：大赛璐chiral
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pak
®ꢀ
agp 0.4 cm i.d.
ꢀ×
15 cm l
ꢀ×
5 um；检测波长：205 nm；柱温：20～25 ℃；进样量：5 ul；流速：0.3 ml/min；流动相为15 mmol/l乙酸铵∶异丙醇=98∶2，按照0 min、20min等度洗脱；结果如下：（1）柱温为20 ℃，分离度为2.81；（2）柱温为22 ℃，分离度为3.03；（3）柱温为25 ℃，分离度为2.61。
42.耐用性不同柱温的测试结果显示：本测试方法在柱温20 ℃及25 ℃之间变化，对
测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。