一种具有护肝作用的巨球菌制剂及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种具有护肝作用的巨球菌制剂及其应用，具体涉及埃氏巨形球菌在制备防治脂肪肝，保护肝脏，改善肝脏功能的制剂中的应用，属于微生物和代谢性疾病领域。


背景技术：

2.脂肪肝(fatty liver)是指的肝细胞内由于各种原因引起的脂肪堆积过多所发生的病变，是一种常见的肝脏病理改变。当肝内脂肪蓄积超过肝重量的5％或者在肝细胞中有50％以上存在脂肪变性时，即可视为发生脂肪肝。脂肪肝严重威胁当前人类健康，业已成为第二大肝病，同时由于现在饮食习惯的改变，其发病率仍在不断上升，并且发病年龄日趋年轻化。饮食，如长期的食物高热量的摄入，过度的饮酒等，是导致脂肪肝的一个重要诱因。随着社会的进步和物质生活水平的提高，人类膳食结构发生了较大的改变，从以素食为主逐渐过渡到以高脂、高糖为主的膳食结构。膳食结构的改变导致中国人群的疾病也随之发生了明显的改变，而长期的高脂饮食或饮酒等会影响患者的肝脏功能，引起脂肪肝等疾病，造成肝损伤。
3.近年来随着微生物组学和代谢组学等学科的发展，肠道菌群被发现与宿主的代谢等健康与疾病状态有密切关系。包括我们的前期研究在内的人群和实验动物的多项研究表明，饮食与肠道微生物的组成和变化存在密切关系。这些微生物可以通过代谢和免疫调节等途径作用于宿主，并最终影响或导致宿主多种疾病的发生、发展。肠道菌群中的益生菌(probiotics)作影响肠道细菌多样性和代谢的重要因素。例如益生菌lactobacillus rhamnosus等的补充具有促进肠道菌群健康的作用，改善宿主体重、肠道组成和代谢以及肝脏功能。因此肠道益生菌及其制剂成为防治脂肪脂等代谢性疾病非常重要的潜在防治手段。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的是提供埃氏巨球形菌在制备护肝药物中的应用。
5.在一种实施方式中，所述埃氏巨球形菌为megasphaera elsdenii dsm 20460、megasphaera elsdenii atcc 17752或megasphaera elsdenii atcc 17753中的一种或多种的组合。
6.在一种实施方式中，所述megasphaera elsdenii dsm 20460，购自德国微生物及细胞保藏中心(dsm)，所述megasphaera elsdenii atcc 17752，购自美国典型培养物保藏中心(atcc)；所述megasphaera elsdenii atcc 17753，购自美国典型培养物保藏中心(atcc)，均公开于公开号为cn110327375a的专利申请文件中。
7.在一种实施方式中，所述护肝药物具备(a)～(d)的至少一种作用：
8.(a)改善肝脏的脂肪变性状态；
9.(b)减少肝脏细胞甘油三酯沉积；
10.(c)提高abcg5和abcg8的表达；
11.(d)修复高脂饮食诱导肝损伤。
12.在一种实施方式中，所述药物还含有药学上可接受的载体。
13.在一种实施方式中，在药学上可接受的载体包括一种或多种选自药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂及矫味剂的载体。
14.在一种实施方式中，所述的药物组合物是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型。
15.在一种实施方式中，所述埃氏巨球菌在药物中重量占所述药物重量的15
‑
35％，或20
‑
30％。
16.在一种实施方式中，所述的填充剂应该理解为用于增加片剂重量和体积而便于压片的辅料稀释剂，或以吸收原料中多余液体成分的辅料吸收剂。所述填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸钙或微晶纤维素。
17.在一种实施方式中，所述粘合剂应该理解为原料药物本身无粘性或粘性不足，需加入粘性物质以便于制粒。所述粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮。
18.在一种实施方式中，所述润湿剂应该理解为原料药物本身无粘性，但可润湿其药物原辅料并诱发其粘性而制成颗粒的液体。所述润湿剂选自水、乙醇、淀粉或糖浆。
19.在一种实施方式中，所述崩解剂应该理解为一种能够加入片剂中而促进其片剂在胃肠液中快速崩解成细小粒子的辅料。所述崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羧丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠。
20.在一种实施方式中，所述润滑剂应该理解为一种有利于提高片剂在制粒过程中的流动性，有利于片剂脱模的化学物质。所述润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇。
21.在一种实施方式中，所述矫味剂应该理解为在药品中用以改善或屏蔽药物不良气味和味道的药用辅料。所述的矫味剂选自如单糖浆、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬、茴香或薄荷油的芳香剂；海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素或羧甲基纤维素钠的胶浆剂；柠檬酸、酒石酸或碳酸氢钠混合物的泡腾剂。
22.在一种实施方式中，所述的药物的剂型包括但不限于颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液；单个剂型含有为达到所需药量的预定活性物质，例如本发明的埃氏巨球菌菌剂。
23.本发明第二个目的是提供具有护肝作用的埃氏巨球菌菌剂，所述菌剂是将含有所述埃氏巨球菌的菌液通过常规冷冻干燥工艺制备或其他工艺制备所得到的粉剂，它含有106cfu/g以上的活性埃氏巨球菌细胞。
24.在一种实施方式中，所述的埃氏巨球菌菌剂含有至少106cfu/g的活性埃氏巨球菌。
25.在一种实施方式中，所述埃氏巨球菌接种至培养基中，于35～37℃厌氧培养。
26.在一种实施方式中，培养72h菌株达稳定期。
27.在一种实施方式中，应用kmi培养基进行培养。
28.在一种实施方式中，所述kmi培养基中还加入3.25ml/l乳酸。
29.在一种实施方式中，所述制剂是冻存剂，含有≥10
10
cfu/ml的埃氏巨球菌。
30.在一种实施方式中，所述冻存剂是将巨球菌稳定期的菌液用ph7.0～7.2的0.9％的生理盐水加0.1％的半胱氨酸盐酸盐缓冲液清洗1
‑
2次后，于
‑
80℃保存备用。
31.在一种实施方式中，所述保护剂含有0.1％半胱氨酸盐酸盐，30％甘油。
32.本发明还要求保护埃氏巨球菌在制备具有保肝、护肝作用的功能性食品方面的应用。
33.有益效果：本发明的埃氏巨球菌能够在肠道中保持较高的菌群丰度并且稳定存在，对大鼠的肝脏产生明显的保护作用，并且能够减轻肝脏脂肪变性，减轻有高脂饮食诱导的及大鼠的体脂和血脂异常，对高脂饮食诱导肝损伤的大鼠的肝脏产生保护作用，减轻其肝脏脂肪病变。这种降脂护肝的益生菌用于制备药物组合物，具有广泛的应用前景。
附图说明
34.图1为sd大鼠在粪菌移植前后巨型球菌相对丰度的改变，其中，t1:高脂饮食前，t2:高脂血症造模完成，t3:巨球菌移植后。
35.图2为对照组、脂肪肝模型组、脂肪肝模型 移植埃氏巨球菌m.e1、m.e2和m.e3组的大鼠肝脏外观照片。
36.图3为对照组、脂肪肝模型组、脂肪肝模型 移植埃氏巨球菌m.e1、m.e2和m.e3组的大鼠肝脏病理切片照片。
37.图4为对照组、脂肪肝症模型组、脂肪肝模型 移植埃氏巨球菌m.e1组的大鼠肝脏中abcg5和abcg8的相对定量。
38.图5为对照组、脂肪肝症模型组、脂肪肝模型 移植埃氏巨球菌m.e1组的大鼠肝脏切片的甘油红染色。
具体实施方式
39.实施例1：巨球菌的扩增培养培养和保存
40.1、培养基的制备：配制脑心浸液kmi培养基(例如thermo scientific公司的产品)，溶解于蒸馏水中，3.25ml/l的乳酸，混合均匀，然后调整其ph为7.0，115
‑
121℃灭菌15
‑
20min后，即得到所述培养基。
41.2、巨球菌的培养和菌悬液的制备：将所述埃氏巨球菌接种于步骤1的kmi培养基中，置厌氧培养箱中37℃培养72h，即可得数量级为108cfu/ml的稳定期埃氏巨球菌。
42.3、保护剂的制备：称取半胱氨酸盐酸盐1g/l，均匀溶解于30％的甘油保藏液中，115
‑
121℃灭菌15
‑
20min后，即得到所述保护剂。
43.4、保存方法：将巨球菌稳定期菌液用无菌的0.9％生理盐水缓冲液(ph 7.0)清洗1
‑
2次后，用所述的保护剂重悬达到浓度10
10
cfu/ml，即得巨球菌冻存剂，于
‑
80℃保存备用。
44.实施例2：脂肪肝sd大鼠模型的制备
45.对sd大鼠连续灌胃高脂乳制剂6周制备成模后，将其随机分为脂肪肝模型组(fld)组和fld 埃氏巨球菌组(m.e)，菌悬液的制备方法同实施例1，其中megasphaera elsdenii dsm 20460为m.e1组，megasphaera elsdenii atcc 17752为m.e2组，megasphaera elsdenii atcc 17753为m.e3组，每组各10只，具体分组及处理如表1所示，动物饲养于spf级动物房内，动物饲喂基础饲料，自由采食、饮水，温度20
‑
26℃，湿度40
‑
70％，定时更换垫
料，其他动物房条件按照国标gb14925
‑
2010执行。
46.表1不同分组的动物处理条件
[0047][0048]
实施例3：脂肪肝sd大鼠巨球菌移植实验
[0049]
选择12周龄雄性sd大鼠。所有动物在饮食干预前使用抗生素处理两周，减少固有菌群对后续实验的影响，以利于巨球菌移植发挥作用。处理方式为：氨苄青霉素(1mg/ml)，新霉素(1mg/ml)，甲硝唑(1mg/ml)和万古霉素(0.5mg/ml)，连续灌胃给予5d，每日一次。之后将制备好的巨球菌菌液(108cfu/ml)以200μl的剂量每天一次和饲料进行干预，其中细菌悬液以200μl/只，每日灌胃1次，连续处理4周，第0、4周采集一次血清备用，行安乐术处死大鼠，收取血清，肝脏，粪便等样品，如图1所示，在巨球菌移植之前，巨球菌的丰度非常低，但在移植之后，巨球菌的丰度最高可占整个肠道菌群的1％左右。
[0050]
对各组大鼠的体重进行测定，结果如表2所示；各组大鼠生长情况良好，体重每周均有增长，前期增长较快，后期缓慢增长。试验前各组大鼠体重差异不显著，实验结束后对照组体重最大，各实验组与对照组相比差异显著(p＜0.05)，试验组之间差异不显著。
[0051]
表2各组大鼠体重及肝重情况
[0052][0053]
注：*表示与脂肪肝模型组相比，差异显著(p＜0.05)
[0054]
对各组大鼠的肝脏形态进行观察，对照组、脂肪肝模型组、m.e1、m.e2和m.e3组的大鼠肝脏如图2所示。从图中可以看出，普通基础饲料饲喂的对照组大鼠的肝脏呈暗红色，质地均匀，模型组的大鼠肝脏表面有肉眼可见的脂肪斑块，表明存在肝脏脂肪变性。m.e组的大鼠肝脏表面呈淡黄色，表面颜色较模型组深，脂肪斑块也较少，表明其肝脏脂肪变性有明显程度的好转。该部分说明灌胃m.e单菌菌液对肝脏肝大鼠的脂肪变性具有明显的改善作用。
[0055]
对大鼠肝脏病理切片经he染色，在放大400
×
的光学显微镜下观察结果如图3所示。正常对照组大鼠肝小叶轮廓清楚完整，肝细胞索排列整齐，汇管区未见异常浸润或增
生。模型组和m.e组肝细胞均有以门管区为轴心发生的弥漫性空泡化现象，但m.e组肝细胞空泡化较模型组轻微。这也表明m.e对肝脏细胞有修复作用。
[0056]
实施例4：移植巨球菌明显改善大鼠肝脏中代谢相关基因表达
[0057]
abcg5和abcg8的表达增加可选择性地促进胆道中性甾醇的分泌，减少肠道对胆固醇的吸收，从而导致中性甾醇排泄选择性增加，胆固醇合成代偿性增加。利用qpcr相对的方法对大鼠的肝脏组织中的abcg5和abcg8 mrna表达量进行检测。如图4所示，移植巨球菌m.e可以增加肝脏abcg5和abcg8的mrna表达，显著改盖其肝的生理功能。
[0058]
实施例5：移植巨球菌明显改善大鼠肝脏中的细胞病变和甘油三酯沉积
[0059]
非酒精性脂肪肝疾病(nafld)的特征通常是与肥胖症相关，该现象的特征是肝内甘油三酸酯(ihtg)含量增加，并伴有炎症和纤维化。动物模型的建立方法同实施例2，收集实验组和对照组的肝脏组织样品，并用10％磷酸甲醛甲醛缓冲盐水(ph 7.4)固定。将包埋在石蜡中的样品切成薄片，并进一步用油红o染色。在显微镜下如图5所示，相对于对照组的正常肝组织细胞，高脂饮食的大鼠肝脏脂肪细胞发生了显著的变性，并且有大量的甘油三酯的沉积，而埃氏巨球菌移植可以一定程度上改善这种现象，也进一步说明埃氏巨球菌对肝脏有着一定的保护作用。
[0060]
实施例:6：制备含有巨球菌的胶囊制品
[0061]
将巨球菌在kmi培养基中于37℃厌氧培养24小时，在4℃于5000rpm条件下离心15min，用无菌的0.9％生理盐水(ph 7.2)冲洗1
‑
2次，使用上述保护剂重悬菌体使菌体终浓度达到10
10
cfu/ml。将菌悬液加入3％的海藻酸钠溶液中，充分搅拌使得细胞均匀分散于海藻酸钠溶液中，然后将此混合液挤压到氯化钙溶液中形成胶粒，静止固化30min，过滤收集胶粒，将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48小时，得到含本发明巨球菌冻干粉剂，将该粉剂装入市售的药用胶囊，即得所述的胶囊制品。
[0062]
实施例7：利用巨球菌制备片剂
[0063]
分别称取采用冷冻干燥方法制备的本发明巨球菌菌粉制剂25.7重量份、淀粉55.0重量份、纤维素衍生物(羧甲基纤维素钠)4.5重量份、羧甲基淀粉钠12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份与水1.0重量份，混合，采用常规方法制成湿颗粒，然后使用压片机进行压片，使用小型药物干燥机进行干燥，再包装得到片剂。
[0064]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。