一种野生苇蘑批量化培殖方法及应用与流程

1.本发明属于野生食用菌人工驯化育菇研究领域，涉及一种野生苇蘑批量化培殖方法与应用，更确切的说是一种野生苇蘑批量化培殖获得子实体的方法。


背景技术：

2.天津市七里海湿地为国家级湿地自然保护区，位于天津市东北部宁河区，总面积约95平方公里，该湿地内盛产一种野生蕈菌，当地人称之为苇蘑，口感独特、营养丰富，味道鲜美而独特，深受当地人喜欢，因其稀缺，价格昂贵，该蘑菇发生于夏季天气闷热，阴雨连绵之后的在厚积腐殖质中。近些年来，由于七里海生态环境遭到破坏，水源逐渐枯竭，湿地退化，越来越多的湿地被填充用于农业或建设，芦苇面积减少，再加上人为过度采摘以及其生长环境特殊，需在特定的温度，湿度、光照以及土壤等共同环境因素作用下生长，综合以上多种环境、人为因素，最终导致天津七里海湿地野生苇蘑产量和品质逐年降低，据2016年7月
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至今经当地民间环保人士吕绍生全面跟踪调查统计，该域内野生苇蘑难觅踪影，极有可能面临绝迹的危险，本发明人于2017年申请了一种野生苇蘑人工培殖的方法及应用的发明专利，该专利当时主要是解决小试能否出菇的问题，证明了小试范围内人工驯化能够在实验室条件下正常形成子实体，但批量化生产仍存在不确定性。后续的不断试验发现通过优化能够获得苇蘑批量培殖的基本条件和方法。
3.目前，经查阅资料且尚未见批量化人工驯化成功的相关报道，无疑进一步加剧其面临绝迹的局面。因此，为保护该域内湿地生态系统物种多样性、拯救和保护濒危野生蕈菌种质资源、实现天津七里海野生苇蘑的可持续合理有序开发利用，本发明建立了批量人工培殖模式，为保护该域内湿地生态系统物种多样性、拯救濒危野生蕈菌种质资源、开展后期的深入研究、实现天津七里海野生苇蘑合理有序开发利用提供了有力支持，天津七里海野生苇蘑的人工批量培殖模式建立具有极大的开发前景，生态效益、经济效益极其显著。


技术实现要素：

4.天津七里海野生苇蘑人工培殖模式包括母种的制作、原种的制作、栽培种的制作、批量培殖培养料制作、原基诱导条件建立、子实体批量培殖方式优化。
5.本发明通过以下措施实现：一种野生苇蘑的人工批量培殖的方法，其特征在于按如下的步骤进行（1）苇蘑母种制作及其培养条件采用优化后的培养基葡萄糖 10 g/l，马铃薯（浸提液） 200g/l，mgso4·
7h2o 1.5 g/l，kh2po
4 3 g/l，琼脂粉 20 g/l，vb
1 0.01 g/l，稻草粉 2.5 g/l，稻草（浸提液）25 g/l，芦苇腐殖质 5 g/l，将野生苇蘑菌株无菌操作接入到平板培养基上，接种后，用封口膜封口于29℃恒温培养10天可以获得浅黄色稀疏菌落即为母种纯培养物；适宜母种菌丝体生长的ph为5
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7；适宜菌丝体生长温度范围19
‑
34℃；最适温度为29℃，恒温、避光培养15
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20天即可长满90mm平板；所述的野生苇蘑菌株，具有seq id no:1所示的核苷酸序列；
（2）原种制作采自野生苇蘑生境芦苇腐殖质，用筛网过滤除去杂质，得到芦苇腐殖质。将麦粒浸泡24h。加入适量水煮熟，以不煮破种皮为宜。沥干水分。按照配方（90%芦苇腐殖质 10%麦粒，含水量60%）称料、拌料，立即装入聚丙烯栽培袋（300mm
×
150mm
×
0.05mm）中，于121℃灭菌2h。灭菌后，将原种培养袋转移到无菌室中，待其冷却到32=37℃，在超净工作台内进行接入1cm2母种3块，接种后于29℃恒温暗培养，23
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25天长满袋；（3）栽培种制作取2
‑
4cm新鲜无霉变长稻草段，用3%石灰水浸泡12h预湿，沥干水分，控制含水量在60%
‑
65%。麦粒和芦苇腐殖质的处理和制作方法与原种相同。按照配方（52%稻草、24%麦粒、24%芦苇腐殖质，含水量65%）称料，拌料，装入聚丙烯栽培袋内（300mm
×
150mm
×
0.05mm），袋装湿料150g，于121℃灭菌2h。冷却后，在超净工作台内，在每袋中接种原种，于29℃恒温暗培养，湿度65%，25
‑
28天长满袋；（4）浅盘式育菇培养料制作将长满平板的苇蘑栽培种纯培养物于无菌条件下接种于育菇培养料聚丙烯浅盘中，浅盘规格为：320mm
×
240mm
×
90mm，野生苇蘑育菇培养料配方为52%稻草、20%麦麸、24%芦苇腐殖质,4%蛭石，含水量65%，ph自然；每盘装湿料约600g，于121℃灭菌2h；（5）浅盘式育菇培养料发菌：冷却后，在超净工作台内接种适量栽培种，于29℃恒温暗培养，湿度65%，25
‑
28天长满盘；（6）原基诱导条件：将长满盘菌丝体于25℃培养12h，然后15℃培养12h，持续温差10℃刺激10天，即有原基大量产生；（7）子实体培殖条件：将已经原基转化并具有大量原基的育菇浅盘于25℃恒温条件下，湿度85
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90%，1000
‑
1500lx散射光，光照日期12h/24h，培殖10
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12天即可获得子实体。
6.本发明所述的人工培殖的方法，其中的人工培殖获得苇蘑子实体形态学特征描述：子实体肉质，较厚，柔软，轻质，菌盖直径大小5
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10cm、菌盖浅黄色、菌盖光滑无鳞片、肉质，中央凹陷，成熟后边缘成波浪状、菌褶蜡质边缘尖锐，延生、稀疏分布、有向菌盖变宽的趋势，菌柄位置为中生、中实、无菌环、菌托，成熟后孢子印白色。
7.人工培殖获得苇蘑子实体分子生物学特征描述：将人工培殖获得苇蘑子实体对其基因组dna后提取进行pcr扩增its序列片段，在genbank核酸序列数据库中进行blast搜索以获得同源性较高的多个种的its序列,再进行相似度比较，根据比对结果鉴定为 蜡伞科(hygrophoropsidaceae)、拟蜡伞属(hygrophoropsis)的一种蘑菇，具有seq id no:1所示的核苷酸序列。
8.本发明更进一步公开了野生苇蘑人工培殖的方法在提高了天津七里海地区苇蘑人工 批量培殖的方法与应用。实验结果显示：采用本发明公开的培殖方法，经过45天左右就可以批量获得天津七里海野生苇蘑子实体，为天津七里海内湿地生态系统物种多样性、拯救濒危野生蕈菌种质资源、开展后期的深入研究、实现天津七里海野生苇蘑合理有序开发利用提供了有力支持。
9.本发明更加详细的描述如下：天津七里海野生苇蘑人工批量培殖获得子实体其特征在于：菌盖大小约5
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10cm，浅黄色、菌盖表面光滑无鳞片，半蜡质或肉质，中央凹陷；菌褶常成蜡质，延生，较为稀疏；孢
子印白色，菌柄长约2
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3cm中生，中实，无菌环、菌托，成熟后菌盖上卷，边缘波浪状卷曲。
10.1.母种制作及其培养条件采用优化后的培养基葡萄糖 10 g/l，马铃薯（浸提液） 200g/l，mgso4·
7h2o 1.5 g/l，kh2po
4 3 g/l，琼脂粉 20 g/l，vb
1 0.01 g/l，稻草粉 2.5 g/l，稻草（浸提液）25 g/l，芦苇腐殖质 5 g/l，挑选生长旺盛的苇蘑斜面菌丝体纯培养物，在超净工作台内迅速接入到平板培养基上，接种后，用封口膜封口于29℃恒温培养10天可以获得浅黄色稀疏菌落即为母种纯培养物；适宜母种菌丝体生长的ph为5
‑
7；适宜菌丝体生长温度范围19
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34℃；最适温度为29℃，恒温、避光培养15
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20天即可长满90mm平板；2.原种制作采自野生苇蘑生境芦苇腐殖质，用筛网过滤除去杂质，得到芦苇腐殖质。将麦粒浸泡24h。加入适量水煮熟，以不煮破种皮为宜。沥干水分。按照配方（90%芦苇腐殖质 10%麦粒，含水量60%）称料、拌料，立即装入聚丙烯栽培袋（300mm
×
150mm
×
0.05mm）中，于121℃灭菌2h。灭菌后，将原种培养袋转移到无菌室中，待其冷却到32
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37℃，在超净工作台内进行接入1cm2母种3块，接种后于29℃恒温暗培养，23
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25天长满袋；3.栽培种制作取2
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4cm新鲜无霉变长稻草段，用3%石灰水浸泡12h预湿，沥干水分，控制含水量在60
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65%。麦粒和芦苇腐殖质的处理和制作方法与原种相同。按照配方（52%稻草、24%麦粒、24%芦苇腐殖质，含水量65%）称料，拌料，装入聚丙烯栽培袋内（300mm
×
150mm
×
0.05mm），袋装湿料150g，于121℃灭菌2h。冷却后，在超净工作台内，在每袋中接种适量原种，于29℃恒温暗培养，湿度65%，23
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25天长满袋；4.浅盘式育菇培养料制作将长满平板的苇蘑栽培种纯培养物于无菌条件下接种于育菇培养料聚丙烯浅盘中，浅盘规格为：320mm
×
240mm
×
90mm，野生苇蘑育菇培养料配方为52%稻草、20%麦麸、24%芦苇腐殖质,4%蛭石，含水量65%，ph自然；每盘装湿料约600g，于121℃灭菌2h；浅盘式育菇培养料发菌：冷却后，在超净工作台内接种适量栽培种，于29℃恒温暗培养，湿度65%，23
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25天长满盘；5.原基诱导条件将长满盘菌丝体于25℃培养12h，然后15℃培养12h，持续温差10℃刺激10天，即有原基大量产生；6.子实体批量培殖条件将具有大量原基的出菇浅盘于25℃恒温条件下，湿度85
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90%，1000
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1500lx散射光，光照日期12h/24h，培殖10天即可获得成熟子实体。
11.7.关于本发明所获得的子实体的评价如下：（1）人工批量培殖获得苇蘑子实体形态学特征描述人工批量培殖获得苇蘑子实体主要特征在于子实体肉质，柔软，菌盖直径大小5
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10cm、菌盖浅黄色、菌盖光滑无鳞片、肉质，中央凹陷，成熟后边缘成波浪状、菌褶蜡质边缘尖锐，延生、稀疏分布、有向菌盖变宽的趋势，菌柄中生、中实、无菌环、菌托，成熟后孢子印白色；（2）人工批量培殖获得苇蘑子实体分子生物学特征描述
将人工培殖获得苇蘑子实体对其基因组dna后提取进行pcr扩增its序列片段，在genbank核酸序列数据库中进行blast搜索以获得同源性较高的多个种的its序列,再进行相似度比较，比对结果显示为鉴定为蜡伞科(hygrophoropsidaceae)、拟蜡伞属(hygrophoropsis)的一种蘑菇。具有seq id no:1所示的核苷酸序列（3）人工批量培殖七里海野生苇蘑子实体的口感: 味道浓郁，鲜美，香味较浓。
12.（4） 七里海野生苇蘑与人工驯化苇蘑子实体形态比较结果表明：人工驯化批量培殖获得子实体略小，菌肉较厚，颜色淡黄色，革质化程度较低，具有较高的商品价值。
13.本发明公开的野生苇蘑人工培殖方法所具有的积极效果在于：（1）利用本发明所述的方法可进行天津市七里海野生苇蘑的人工培殖，苇蘑子实体生长周期为45天左右。具有生产成本低、操作简单、原基发生数量多、能够获得批量子实体等优点。
14.（2）天津七里海野生苇蘑人工培殖模式的建立对于天津七里海特有濒危食用菌苇蘑具有极高的拯救、保护、研究、开发、推广价值。
15.（3）本发明为保护湿地生态系统物种多样性、拯救濒危野生蕈菌种质资源、实现野生苇蘑的合理有序开发利用提供了有力支持，野生苇蘑人工批量培殖方法有极高的开发、推广价值，经济、生态效益显著。
附图说明
16.图1人工批量培殖获得子实体。
具体实施方式
17.下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。其中的野生苇蘑采摘于天津七里海。
18.实施例1本发明采用组织分离方法获取菌种，选择野生蕈菌色泽正常、未受病虫侵害的部分子实体，将表面杂物清除后，并用75%酒精擦拭，在无菌条件下，将供分离部分子实体纵切一分为二，在菌柄菌盖交界处取绿豆大小组织块，用镊子迅速将组织块接入pda平板内，于
恒温培养箱中29℃，暗培养10
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15天备用。
19.实施例2袋装量梯度单因素实验以最优培养料配方（52%稻草、24%麦粒、24%芦苇腐殖质）为基础，按照前期试验每袋装量150g湿料为参考，分别设置袋料湿重为100g/袋、150g/袋、200g/袋、250g/袋、300g/袋、350g/袋6个梯度，每个处理10袋，分别接入等量供试栽培种，于29℃温箱恒温培养，根据菌丝和原基生长情况，确定最佳袋装量。
20.结果表明200g袋装重量为筛选出的苇蘑人工栽培的适宜袋装量。
21.表1 不同袋装量对苇蘑菌丝、原基生长的影响注：－代表菌丝不萌发，＋代表菌丝长势较弱，＋＋代表菌丝长势一般，＋＋＋代表菌丝长势优良，＋＋＋＋代表菌丝长势旺盛；ｏ代表无原基出现，ｏｏ代表原基数量较少，ｏｏｏ代表原基数量较多。（同以下表格）实施例3稻草比例梯度单因素实验以最优培养料配方为基础，按照前期试验52%稻草培养料为参考，分别设置2%稻草、12%稻草、22%稻草、32%稻草、42%稻草、52%稻草6个梯度，不足100%部分以蛭石（仅作为填充材料，不提供菌丝生长所需营养）补充，每个处理50袋，分别接入等量供试栽培种，于29℃温箱恒温培养，根据菌丝和原基生长情况，确定最佳稻草比例。
22.结果表明：配方52%稻草为筛选出来的适合苇蘑进行人工栽培的栽培料比例。
23.表2不同稻草含量对苇蘑菌丝、原基生长的影响实施例4 麦粒比例单因素实验以最优培养料配方为基础，按照前期试验24%麦粒培养料为参考，分别设置4%麦粒、8%麦粒、12%麦粒、16%麦粒、20%麦粒、24%麦粒6个梯度，不足100%部分以蛭石（仅作为填充材料，不提供菌丝生长所需营养）补充，每个处理50袋，分别接入等量供试栽培种，于29℃温箱恒温培养，根据菌丝和原基生长情况，确定最佳麦粒比例。
24.结果表明：20%麦粒为筛选出来的适合苇蘑进行人工栽培的栽培料比例.
表3 不同麦粒含量对苇蘑菌丝、原基生长的影响实施例5芦苇腐殖质比例梯度单因素实验以最优培养料配方为基础，按照前期试验24%芦苇腐殖质培养料为参考，分别设置4%芦苇腐殖质、8%芦苇腐殖质、12%芦苇腐殖质、16%芦苇腐殖质、20%芦苇腐殖质、24%芦苇腐殖质6个梯度，不足100%部分以蛭石（仅作为填充材料，不提供菌丝生长所需营养）补充，每个处理50袋，分别接入等量供试栽培种，于29℃温箱恒温培养，根据菌丝和原基生长情况，确定最佳芦苇腐殖质比例。
25.结果表明：配方24%芦苇腐殖质为筛选出来的适合苇蘑进行人工栽培的栽培料比例。
26.表4不同芦苇腐殖质含量下对苇蘑菌丝、原基生长的影响 实施例6麦麸代替麦粒比例梯度单因素实验由于麦粒需要提前预煮，操作工艺比较繁琐，以麦麸替代麦粒，以最优培养料配方为基础，按照前期试验24%麦粒培养料为参考，分别设置4%麦麸、8%麦麸、12%麦麸、16%麦麸、20%麦麸、24%麦麸6个梯度，不足100%部分以蛭石（仅作为填充材料，不提供菌丝生长所需营养）补充，每个处理50袋，分别接入等量供试栽培种，于29℃温箱恒温培养，根据菌丝和原基生长情况，确定最佳麦麸比例。
27.结果表明：配方20%麦麸为适合苇蘑进行人工栽培的栽培料比例。
28.表5 不同麦麸替代麦粒含量下对苇蘑菌丝、原基生长的影响
ꢀ
实施例7覆土与不覆土对比处理出菇菌棒经统一接种后，于最适条件培养满袋后，袋内覆土2厘米厚度，覆土调制含水量为18％，覆土材质类型为芦苇腐殖土，覆土处理50袋，不覆土处理50袋，按照最佳出菇条件，以不做处理组作为对照，对比覆土处理后原基形成情况。
29.结果表明：覆土对原基的形成出现没有多大的影响，另外，由于覆土反而导致试验过程中出现了大量的菌包污染。
30.表6 覆土与不覆土处理结果（50个重复）注：－表示菌丝没有萌发，或没有出现原基，或没有出菇。＋表示菌丝长势稀少，或原基数量稀少，或出菇稀少。＋＋表示菌丝长势较好，或原基数量较好，或出菇较好。＋＋＋表示菌丝长势旺盛，或原基数量密集，或出菇旺盛。（下同）。
31.实施例8覆土材料灭菌与不灭菌对比处理出菇菌棒经统一接种后，于最适条件培养满袋后，袋内覆土2厘米厚度，调制覆土含水量为18％,覆土材质类型为芦苇腐殖土，覆土材料灭菌处理50袋，不灭菌处理50袋，按照最佳出菇条件，以不做处理组作为对照，对比覆土灭菌处理前后，生物因素(有益微生物)对苇蘑原基形成情况。
32.结果表明，覆土材料是否灭菌对原基的形成出现没有多大的影响，但是，由于覆土材料经过了灭菌，虽然试验过程中也有大量的菌包污染，但相较于没有经过灭菌处理的覆土材料处理的菌包，被污染数量有所减少。
33.表7 覆土材料灭菌与不灭菌处理结果 实施例9顶端与侧面出菇对比处理
出菇菌棒经统一接种后，于最佳条件培养满袋后，分别做上端开口出菇、侧壁划口出菇2种处理，每组处理50个，按照最适出菇条件，以不做处理组作为对照，对比顶端和侧面出菇处理下的原基形成情况。
34.结果表明：上端划口和侧壁划口相较之下上端划口出菇周期较短，但有畸形菇出现。
35.表8顶端与侧面出菇处理结果实施例10浅盘式出菇与袋装栽培出菇对比处理出菇菌棒经统一接种后，于最适条件培养满袋后，无菌条件下将满袋后的菌丝体掰碎后分别置于无菌50*40*10厘米浅盘出菇，加盖通氧透气封膜浅盘式出菇，每组处理50个，按照最适出菇条件，以不做处理组作为对照，对比浅盘式出菇与袋栽出菇处理下的原基形成情况。
36.结果表明：浅盘式出菇相较于袋栽出菇周期短，且畸形菇少。
37.表9 浅盘式出菇与袋栽出菇处理结果实施例11菌丝体培养及其原基诱导分化天津七里海野生苇蘑母种菌丝体培养条件特征为29℃恒温、黑暗避光，培养15天即可长满75mm平板，出菇菌棒菌丝体培养条件其特征为25℃恒温、黑暗避光，空间湿度60%，培养30
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35天即可长满菌袋（规格15
×
30
×
0.04mm聚丙烯塑料袋，装料湿重250g）。
38.天津七里海野生苇蘑原基分化其特征在于将满袋的菌丝体25℃培养12h，15℃培养12h，持续温差10℃刺激7
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10天，即有原基大量产生。
39.实施例12子实体培殖天津七里海野生苇蘑子实体的培殖，其特征在于将具有大量原基的菌袋于25℃恒温条件下，湿度85
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90%（优选85%），1000
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1500lx散射光（优选1500lx），培殖10
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15天（优选15天）即可获得子实体。附苇蘑its序列长度785base，测试报告由上海生工技术有限公司提供。