一种提高丝蛋白基水溶液浓度的方法及由所述方法制备的丝蛋白基水溶液与流程

1.本发明属于丝蛋白基材料处理技术领域，具体涉及一种提高丝蛋白基水溶液浓度的方法和由所述方法制备的丝蛋白基水溶液。


背景技术：

2.蛋白基天然高分子材料(如胶原蛋白、角蛋白、丝蛋白等)具有来源广泛、生物相容性好、生物可降解等特点，近年来受到广泛关注并被应用于植入介入材料、组织修复、组织工程、药物缓释等多个生物医学与生物工程领域。
3.在众多蛋白基天然高分子材料中，丝蛋白基材料因其出色的力学性能、生物相容性和生物可降解性，成为了近年来研究的热点。
4.除了直接利用天然丝纤维外，通过将天然丝纤维进行处理得到再生丝蛋白进而再加工成各种功能材料是目前的主要研究方向之一。通常再生丝蛋白的提取是通过水溶液法，具体为将天然丝纤维溶解在高浓度的无机盐(溴化锂、硫氰酸钠等)溶液或醇
‑
盐混合体系(氯化钙
‑
乙醇
‑
水等)中，之后在经过透析，纯化，得到再生丝蛋白水溶液。由于在透析过程中渗透压很高，大量的水会进入透析袋内，因此所得到的丝蛋白水溶液的浓度通常较低(一般为6wt.％左右)，低浓度的再生丝蛋白水溶液在材料制备及生产等方面受到了极大的限制。除了通过溶解再生法得到的丝蛋白水溶液外，其他的一些丝蛋白基水溶液，如经过化学修饰得到的再生丝蛋白衍生物的水溶液；经过物理混合得到的再生丝蛋白/添加剂的复合丝蛋白基溶液；通过基因重组技术得到的重组丝蛋白水溶液等也都会面临类似的限制。如何高效可控地将低浓度的丝蛋白基水溶液浓缩以得到较高浓度的溶液成为了目前亟待解决的问题。
5.现有技术中用于浓缩丝蛋白水溶液的方法主要分为两种，一种是透析袋渗透浓缩法，该方法主要是将丝蛋白水溶液置于透析袋中，然后在高分子聚合物(如聚乙二醇等)的浓溶液中进行透析，过程中透析袋中的水可以渗出以得到高浓度的丝蛋白溶液(us 8614293 b2)。然而，该方法耗时较长，需使用大量聚合物透析液，浓缩成本极高。并且，透析过程所用聚乙二醇等高分子在聚合生产过程中会有一些小分子或杂质离子残留，这些杂质离子有可能会渗透进入透析袋进而影响所制备的丝蛋白溶液纯度。另一种浓缩丝蛋白水溶液的方法是将丝蛋白水溶液置于透析袋中，然后放置在真空干燥箱内并在干燥箱内放入吸水剂，在一定温度下进行真空干燥，通过调控抽真空的时间及真空度能获得所需要的不同浓度的丝蛋白溶液(cn 102167724)。该方法需使用透析袋和大量的吸水剂，浓缩成本较高。
6.因此，仍需要一种高效、纯净、可控、低成本且具有工业化前景的高浓度丝蛋白基水溶液的制备方法。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种高效、纯净、可控、低成本且具有工业化前景的高浓度丝
蛋白基水溶液的制备方法。
8.本发明提供一种提高丝蛋白基水溶液浓度的方法，所述方法包括如下步骤：
9.(1)将起始丝蛋白水溶液放入透析袋中透析，经透析后的溶液在环境压力下在第一离心转速下离心，弃去沉淀物得到浓度为4.0
‑
8.0w/v％，优选为4.5
‑
6.5w/v％的丝蛋白基水溶液；
10.(2)将步骤(1)得到的丝蛋白基水溶液放置在真空环境下在第二离心转速下进行离心浓缩，从而得到浓度大于10w/v％的丝蛋白基水溶液。
11.在具体实施方式中，步骤(1)中的起始丝蛋白水溶液可以为天然丝蛋白水溶液；经过化学修饰得到的再生丝蛋白衍生物的水溶液；经过物理混合得到的再生丝蛋白/添加剂(如药物，生长因子，抗生素等)的复合丝蛋白基溶液；重组丝蛋白水溶液等。
12.在具体实施方式中，所述起始天然丝蛋白水溶液通过以下方法制备：将剪碎的蚕茧放入0.02m na2co3水溶液中，在60
‑
100℃的温度条件下煮30
‑
180min，从而对蚕茧进行脱胶处理，随后将干燥后的脱胶丝溶解于9
‑
10m，优选9.3m libr水溶液中，并放入60
‑
150℃烘箱2
‑
8h使其完全溶解。
13.在具体实施方式中，在步骤(1)中，对起始丝蛋白水溶液在以下透析条件下进行透析：透析时间为2
‑
5天，透析液为去离子水，透析袋截留分子量为3500道尔顿(da)。
14.在具体实施方式中，在步骤(1)中，所述第一离心转速为5000
‑
11000rpm，优选为9000rpm。
15.在具体实施方式中，在步骤(2)之前，可以向丝蛋白水溶液中添加用于改善丝蛋白基材料产品的性质的添加剂，所述添加剂选自甘油、无机盐、生物活性分子(如酶，抗生素，药物等)、无机材料、有机分子。添加剂的浓度可以为0.1
‑
50wt％。通过加入添加剂可以改善丝蛋白基材料产品的性质，如理化性质和生物学性质，但不会影响浓缩的效果。
16.在具体实施方式中，在步骤(2)中，在以下条件下进行真空离心：第二离心转速为100
‑
3000rpm，优选为300
‑
2000rpm，浓缩温度为5
‑
60℃，真空度0.1
‑
1000mbar，浓缩时间为3
‑
48h。
17.在具体实施方式中，在步骤(2)中得到的丝蛋白基水溶液的浓度为10
‑
50w/v％，优选为25
‑
40w/v％，优选地，步骤(2)中得到的丝蛋白基水溶液的浓度为步骤(1)中得到的丝蛋白基水溶液的浓度的6倍。
18.在具体实施方式中，所述方法还包括：在步骤(2)之后，进行在第三离心转速下的第三离心操作以分离沉淀的丝蛋白。
19.在具体实施方式中，所述第三离心操作在以下条件下进行：离心时间为5
‑
30min，离心温度为4
‑
30℃，第三离心转速为5000
‑
14000rpm，优选为9000rpm。
20.另一方面，本发明提供一种通过上述方法制备的丝蛋白基水溶液。
21.再一方面，本发明提供一种由上述丝蛋白基水溶液制成的丝蛋白基材料。
22.在具体实施方式中，所述丝蛋白基材料的形式可为薄膜、纤维、海绵、水凝胶、粉末中的任一种。
23.在具体实施方式中，薄膜、纤维、海绵、水凝胶或粉末形式的丝蛋白基材料的制备方法不受限制，可采用本领域中由丝蛋白基水溶液制备这些形式的常规方法。
24.有益效果
25.本技术提供的提高丝蛋白基水溶液溶度的方法相对于现有技术中的方法，优势在于：(1)不使用聚合物，如聚乙二醇，故所得的高浓度的丝蛋白基溶液中不会有在聚合物生产过程中残留的小分子或杂质离子，更纯净；(2)在真空浓缩过程中不使用吸水剂和透析袋，有效地降低了浓缩的成本。
26.另外，由于本技术中所提供的提高丝蛋白基水溶液浓度的方法中不掺入额外的杂质小分子或杂质离子，由此获得的高浓度丝蛋白基水溶液更为纯净，因此，可以更有利地使其应用于生物医学、组织工程、纺织、柔性电子器件等领域中的丝蛋白基材料(如薄膜、纤维、海绵、水凝胶、粉末等)，并因此提供相比现有技术的丝蛋白丝水溶液额外的优势。
附图说明
27.图1：丝蛋白水溶液浓缩时间与浓度的关系图。
28.图2：不同浓度纯丝蛋白水溶液中剪切速率与剪切粘度的关系图。
29.图3：28wt.％丝蛋白水溶液中模量与角速度的关系图。
30.图4：实施例4中丝蛋白初始浓度溶液与浓缩后高浓度溶液对比图。
具体实施方式
31.以下通过具体实施例来详细描述本发明的工艺过程，然而这些实施例仅为说明本发明方法的代表性实例，而不用于限制本发明的范围。
32.术语：
33.在本文中，术语“高浓度丝蛋白基水溶液”意指浓度大于10w/v％的丝蛋白基水溶液。
34.在本文中，术语“浓缩时间”是指在离心浓缩过程中，稀浓度溶液达到规定高浓度溶液时，仪器运行的时间。
35.在本文中，术语“丝蛋白”可以理解为“丝素蛋白”。
36.在下表1中列出以下实施例中使用的主要实验试剂及仪器的生产厂商。
37.表1主要实验试剂和实验仪器
[0038][0039]
实施例1
[0040]
(1)将剪碎的蚕茧放入0.02m na2co3水溶液中，在100℃的温度条件下煮30min，从而对蚕茧进行脱胶处理。随后将干燥后的脱胶丝溶解于9.3m libr水溶液中后，放入60℃烘箱4h使脱胶丝完全溶解。
[0041]
接着将完全溶解的溶液放入截留分子量为3500道尔顿(da)的透析袋中，其中透析液为去离子水，透析时间为3天，透析后的溶液经常压9000rpm离心弃去底部沉淀物得到初
始浓度为5.0％(w/v)的丝蛋白水溶液。
[0042]
(2)将上述制得的低浓度丝蛋白水溶液放置在真空环境下进行离心浓缩以制备高浓度丝蛋白水溶液。其中浓缩温度为45℃，离心转速为2000rpm,真空度20mbar，初始溶液体积为120ml,浓缩时间为11h。
[0043]
(3)经浓缩后的丝蛋白水溶液放入离心机中进行离心，弃去底部沉淀物以提纯，以供后续加工过程使用。其中离心转速为5000rpm，离心时间为10min,离心温度为4℃。最终制得的丝蛋白水溶液浓度为17wt.％，并且可以在低温下稳定保存。
[0044]
实施例2
[0045]
(1)将剪碎的蚕茧放入0.02m na2co3水溶液中，在100℃的温度条件下煮30min，从而对蚕茧进行脱胶处理。随后将干燥后的脱胶丝溶解于9.3m libr水溶液中后，放入60℃烘箱4h使脱胶丝完全溶解。
[0046]
接着将完全溶解的溶液放入截留分子量为3500道尔顿(da)的透析袋中，其中透析液为去离子水，透析时间为3天，透析后的溶液经常压9000rpm离心弃去底部沉淀物得到初始浓度为5.4％(w/v)的丝蛋白水溶液。
[0047]
(2)将上述制得的低浓度丝蛋白水溶液放置在真空环境下进行离心浓缩以制备高浓度丝蛋白水溶液。其中浓缩温度为45℃，离心转速为2000rpm,真空度20mbar，初始溶液体积为150ml,浓缩时间为14h。
[0048]
(3)经浓缩后的丝蛋白水溶液放入离心机中进行离心，弃去底部沉淀物以提纯，以供后续加工过程使用。其中离心转速为7000rpm，离心时间为15min,离心温度为4℃。最终制得的丝蛋白水溶液浓度为28wt.％，并且可以在低温下稳定保存。
[0049]
实施例3
[0050]
(1)将剪碎的蚕茧放入0.02m na2co3水溶液中，在100℃的温度条件下煮30min，从而对蚕茧进行脱胶处理。随后将干燥后的脱胶丝溶解于9.3m libr水溶液中后，放入60℃烘箱4h使脱胶丝完全溶解。
[0051]
接着将完全溶解的溶液放入截留分子量为3500道尔顿(da)的透析袋中，其中透析液为去离子水，透析时间为3天，透析后的溶液经常压9000rpm离心弃去底部沉淀物得到初始浓度为6.1％(w/v)的丝蛋白水溶液。
[0052]
(2)将上述制得的低浓度丝蛋白水溶液放置在真空环境下进行离心浓缩以制备高浓度丝蛋白水溶液。其中浓缩温度为45℃，离心转速为2000rpm,真空度20mbar，初始溶液体积为120ml,浓缩时间为13h。
[0053]
(3)经浓缩后的丝蛋白水溶液放入离心机中进行离心，弃去底部沉淀物以提纯，以供后续加工过程使用。其中离心转速为9000rpm，离心时间为15min,离心温度为4℃。最终制得的丝蛋白水溶液浓度为24％，并且可以在低温下稳定保存。
[0054]
实施例4
[0055]
(1)将剪碎的蚕茧放入0.02m na2co3水溶液中，在100℃的温度条件下煮30min，从而对蚕茧进行脱胶处理。随后将干燥后的脱胶丝溶解于9.3m libr水溶液中后，放入60℃烘箱4h使脱胶丝完全溶解。
[0056]
接着将完全溶解的溶液放入截留分子量为3500道尔顿(da)的透析袋中，其中透析液为去离子水，透析时间为3天，透析后的溶液经常压9000rpm离心弃去底部沉淀物得到初
始浓度为6.3％(w/v)的丝蛋白水溶液。
[0057]
(2)将上述制得的低浓度丝蛋白水溶液放置在真空环境下进行离心浓缩以制备高浓度丝蛋白水溶液。其中浓缩温度为45℃，离心转速为2000rpm,真空度20mbar，初始溶液体积为120ml,浓缩时间为16h。
[0058]
(3)经浓缩后的丝蛋白水溶液放入离心机中进行离心，弃去底部沉淀物以提纯，以供后续加工过程使用。其中离心转速为9000rpm，离心时间为20min,离心温度为4℃。最终制得的丝蛋白水溶液浓度为36wt.％，并且可以在低温下稳定保存。
[0059]
经上述浓缩过程后得到的丝蛋白基水溶液与浓缩前的丝蛋白基水溶液的对比照片参见图4。
[0060]
实施例5
[0061]
(1)将剪碎的蚕茧放入0.02m na2co3水溶液中，在100℃的温度条件下煮30min，从而对蚕茧进行脱胶处理。随后将干燥后的脱胶丝溶解于9.3m libr水溶液中后，放入60℃烘箱4h使脱胶丝完全溶解。
[0062]
接着将完全溶解的溶液放入截留分子量为3500道尔顿(da)的透析袋中，其中透析液为去离子水，透析时间为3天，透析后的溶液经常压9000rpm离心弃去底部沉淀物得到初始浓度为5.8％(w/v)的丝蛋白水溶液。
[0063]
(2)在上述制得的低浓度丝蛋白水溶液加入20wt％甘油，当两种溶液均匀混合后，放置在真空环境下进行离心浓缩以制备高浓度丝蛋白水溶液。其中浓缩温度为45℃，离心转速为1500rpm,真空度20mbar，初始溶液体积为150ml,浓缩时间为17h。
[0064]
(3)经浓缩后的丝蛋白水溶液放入离心机中进行离心得到上清液，以去除底部的沉淀。其中离心转速为9000rpm，离心时间为20min,离心温度为4℃。最终制得的复合溶液中固体物含量为31wt.％，并且可以在低温下稳定保存。
[0065]
实施例6
[0066]
(1)将剪碎的蚕茧放入0.02m na2co3水溶液中，在100℃的温度条件下煮30min，从而对蚕茧进行脱胶处理。随后将干燥后的脱胶丝溶解于9.3m libr水溶液中后，放入60℃烘箱4h使脱胶丝完全溶解。
[0067]
接着将完全溶解的溶液放入截留分子量为3500道尔顿(da)的透析袋中，其中透析液为去离子水，透析时间为3天，透析后的溶液经常压9000rpm离心弃去底部沉淀物得到初始浓度为5.4％(w/v)的丝蛋白水溶液。
[0068]
(2)在上述制得的低浓度丝蛋白水溶液加入10wt％甘油，当两种溶液均匀混合后，放置在真空环境下进行离心浓缩以制备高浓度丝蛋白水溶液。其中浓缩温度为30℃，离心转速为1500rpm,真空度15mbar，初始溶液体积为90ml,浓缩时间为23h。
[0069]
(3)经浓缩后的丝蛋白水溶液放入离心机中进行离心，弃去底部沉淀物以提纯，以供后续加工过程使用。其中离心转速为9000rpm，离心时间为20min,离心温度为4℃。最终制得的复合溶液中固体物含量为37wt.％，并且可以在低温下稳定保存。
[0070]
实施例7
[0071]
(1)将剪碎的蚕茧放入0.02m na2co3水溶液中，在100℃的温度条件下煮30min，从而对蚕茧进行脱胶处理。随后将干燥后的脱胶丝溶解于9.3m libr水溶液中后，放入60℃烘箱4h使脱胶丝完全溶解。
[0072]
接着将完全溶解的溶液放入截留分子量为3500道尔顿(da)的透析袋中，其中透析液为去离子水，透析时间为3天，透析后的溶液经常压9000rpm离心弃去底部沉淀物得到初始浓度为6.2％(w/v)的丝蛋白水溶液。
[0073]
(2)在上述制得的低浓度丝蛋白水溶液加入5wt％氯化钙溶液，当两种溶液均匀混合后，放置在真空环境下进行离心浓缩以制备高浓度丝蛋白水溶液。其中浓缩温度为30℃，离心转速为2000rpm,真空度10mbar，初始溶液体积为150ml,浓缩时间为22h。
[0074]
(3)经浓缩后的丝蛋白水溶液放入离心机中进行离心，弃去底部沉淀物以提纯，以供后续加工过程使用。其中离心转速为9000rpm，离心时间为20min,离心温度为4℃。最终制得的复合溶液中固体物含量为43wt.％，并且可以在低温下稳定保存。
[0075]
实施例8
[0076]
(1)将剪碎的蚕茧放入0.02m na2co3水溶液中，在100℃的温度条件下煮30min，从而对蚕茧进行脱胶处理。随后将干燥后的脱胶丝溶解于9.3m libr水溶液中后，放入60℃烘箱4h使脱胶丝完全溶解。
[0077]
接着将完全溶解的溶液放入截留分子量为3500道尔顿(da)的透析袋中，其中透析液为去离子水，透析时间为3天，透析后的溶液经常压9000rpm离心弃去底部沉淀物得到初始浓度为4.3％(w/v)的丝蛋白水溶液。
[0078]
(2)在上述制得的低浓度丝蛋白水溶液加入15wt％氯化钙溶液，当两种溶液均匀混合后，放置在真空环境下进行离心浓缩以制备高浓度丝蛋白水溶液。其中浓缩温度为30℃，离心转速为1500rpm,真空度20mbar，初始溶液体积为120ml,浓缩时间为25h。
[0079]
(3)经浓缩后的丝蛋白水溶液放入离心机中进行离心，弃去底部沉淀物以提纯，以供后续加工过程使用。其中离心转速为9000rpm，离心时间为20min,离心温度为4℃。最终制得的复合溶液中固体物含量为48wt.％，并且可以在低温下稳定保存。
[0080]
测试例1
[0081]
为探究在真空离心中，溶液浓度随真空离心时间的变化关系，进行以下测试例。
[0082]
(1)将剪碎的蚕茧放入0.02m na2co3水溶液中，在100℃的温度条件下煮30min，从而对蚕茧进行脱胶处理。随后将干燥后的脱胶丝溶解于9.3m libr水溶液中后，放入60℃烘箱4h使脱胶丝完全溶解。接着将完全溶解的溶液放入截留分子量为3500道尔顿(da)的透析袋中，其中透析液为去离子水，透析时间为3天，透析后的溶液经常压9000rpm离心得到初始浓度为5.0％(w/v)的丝蛋白水溶液。
[0083]
(2)将上述制得的低浓度丝蛋白水溶液放置在真空环境下进行离心浓缩，其中浓缩温度为45℃，离心转速为1500rpm,真空度20mbar，初始溶液体积为120ml。此过程中，需在一定时间间隔内取适量溶液，用天平称取其质量，为湿重，随后将其放置在60℃烘箱内烘干，并用天平称取此时样品的质量，为干重。通过公式(1)计算得到在一定的浓缩时间下，溶液的质量分数。测试结果如图1所示。
[0084][0085]
其中ω为溶液的质量分数，单位为wt.％；m为测试样品干重，m为测试样品湿重，单位均为g。
[0086]
(3)由图1可知，随着浓缩时间的增加，溶液浓度的增加速率逐渐提高。并且当溶液
浓度达到31wt.％时，所需浓缩时间仅为14.5h。因此，与现有技术的其他方法相比，浓缩时间大大缩短，浓缩效率显著提高。另外，上述结果也说明采用本发明的方法可以通过调节浓缩时间而得到确定浓度的丝蛋白基水溶液，从而使得本发明的方法在浓缩丝蛋白基水溶液中表现出可控性好，重复性好的优点。
[0087]
测试例2
[0088]
测试方法：在溶液的流变性能测试过程中，采用ares
‑
g2旋转流变仪(ta
‑
waters，usa)测试。测试时，采用直径为25mm的平行夹板，上下板夹具间的距离设置为0.5mm，测试温度为25℃。
[0089]
在剪切流变实验中，剪切速率由低到高进行扫描，剪切速率范围为10
‑2‑
102s
‑1。实验过程中测试的溶液为上面实施例制备的浓度分别为17wt.％,24wt.％,36wt.％的溶液，测试结果如图2所示。
[0090]
在小振幅频率扫描测试过程中，采用线性区内的应变振幅为1％，频率扫描由高到底进行，扫描范围为102‑
10
‑1rad/s。选取上面实施例制备的质量分数为28wt.％丝蛋白溶液进行小振幅频率扫描测试，测试结果如图3所示。
[0091]
结果分析：
[0092]
由图2可知，在不同浓度条件下，随着剪切速率的提高，溶液均表现出剪切变稀行为。且高浓度溶液在不同剪切速率条件下，与低浓度溶液相比，均具有较高的剪切粘度。
[0093]
由图3可知，储能模量g’和损耗模量g”均随频率的增加而增加。在频率约为3rad/s时，储能模量g’和损耗模量g”相交。在交点左侧(即在较低频范围内)，表现出g’＞g”；在交点右侧(即在较高频范围内)，表现出g’＜g”。
[0094]
上述结果证明相对于常规制备的丝蛋白溶液，通过本技术所得丝蛋白溶液具有优良可调的流变性能。