能降低甘油三酯的干细胞因子冻干粉及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种能降低甘油三酯的干细胞因子冻干粉及其制备方法和应用。


背景技术：

2.甘油三脂(triglyceride，tg)又称三酰甘油，是长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，是人体内含量最多的脂类，甘油三脂可来自于食物中脂肪的分解，肝脏也能将血液中的某些糖类转化为甘油三酯，大部分组织均可以利用甘油三酯分解产物供给人体能量，因此甘油三酯在体内是处于合成与分解的动态平衡之中。一旦平衡被打破，体内甘油三酯过量，就会形成高脂血症，引起脂质代谢系统的紊乱，进一步诱导肝代谢、糖代谢紊乱，最终出现伴随终身的，不能彻底根除的慢性疾病，比如脂肪肝、动脉粥样硬化、冠心病、ii型糖尿病、高尿酸症等。但甘油三酯含量的多少不具有可感受性，很多患者有了表观症状后才发现甘油三酯超标，因此错过了最佳治疗及预防的时间。已有研究证实，甘油三酯可引发众多慢性病，因此降低甘油三酯含量，将甘油三酯控制在合理的范围内是慢病治疗急需解决的问题。
3.目前在临床上针对甘油三脂高主要靠控制饮食并配合服用药物治疗。终身控制高脂、高碳水类食物的摄入，并且要坚持一日三餐服用多种药物，对于患者的经济、身心来讲痛苦感极强，且长时间的药物摄入对肝肾造成一定程度的损伤。很多患者难以坚持，到最后逐渐丧失生活的信心，放弃治疗。因此，急需一种使用方便、功效性强的治疗药物。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种能降低甘油三酯的干细胞因子冻干粉。
5.本发明的目的是提供一种能降低甘油三酯的干细胞因子冻干粉，所述干细胞因子冻干粉由脐带间充质干细胞培养液的上清经浓缩、冻干后得到。
6.优选的，上述能降低甘油三酯的干细胞因子冻干粉中，所述脐带间充质干细胞的代数为0
‑
10代。
7.本发明还提供了一种干细胞因子冻干粉的制备方法，将间充质干细胞接种于细胞培养瓶内，加入间充质干细胞培养基培养，待生长至密度为80
‑
95％时，无菌收集细胞培养上清液，离心去除细胞碎片后，经超滤浓缩膜包截流处理得到浓缩液，进而
‑
40℃冷冻干燥得到干细胞因子冻干粉。
8.优选的，上述能降低甘油三酯的干细胞因子冻干粉的制备方法中，所述间充质干细胞培养基为含体积分数10％胎牛血清的α
‑
mem。
9.优选的，上述能降低甘油三酯的干细胞因子冻干粉的制备方法中，所述的脐带间充质干细胞接种密度为(1.0
‑
5.0)
×
105/cm2。
10.优选的，上述能降低甘油三酯的干细胞因子冻干粉的制备方法中，所述离心条件为800
‑
1500rpm，离心5
‑
10min。
11.优选的，上述能降低甘油三酯的干细胞因子冻干粉的制备方法中，所述超滤浓缩膜包的截流分子量为5
‑
50kd。
12.优选的，上述能降低甘油三酯的干细胞因子冻干粉的制备方法中，冷冻干燥的温度为
‑
40℃。
13.本发明还提供了一种所述干细胞因子冻干粉的应用，所述干细胞因子冻干粉用于制备降低甘油三酯、葡萄糖和i型胶原的产品。
14.本发明还提供了一种所述干细胞因子冻干粉的应用，所述干细胞因子冻干粉用于制备促进肝细胞增殖的产品。
15.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
16.(1)本发明提供的一种能降低甘油三酯的干细胞因子冻干粉，是由低代次的脐带间充质干细胞培养上清经过超滤浓缩之后获得浓缩液，浓缩液再进行冻干而成，内含多种间充质干细胞分泌的细胞因子，通过细胞因子的调节作用，干预机体异常的脂肪代谢途径，降低甘油三酯合成，同时修复受损的肝脏细胞，从代谢源头解决甘油三酯合成与分解，从而恢复脂肪代谢平衡。
17.(2)本发明的冻干粉可促进肝脏细胞增殖，恢复肝脏代谢功能，从而调节糖代谢水平，减少葡萄糖生成，改善胰岛素抵抗；同时肝功能的恢复减少了肝脏中i型胶原的合成，有助于肝纤维化的预防及逆转。
18.(3)本发明的冻干粉通过口含的方式服用，则该冻干粉通过舌下毛细血管直接吸收入血，使用方便，且吸收完全、吸收速度快，减少了胃酸对干细胞因子的“首过”效应，提高了干细胞因子的生物利用率。
19.(4)本发明提供的一种具有降低甘油三酯作用的干细胞因子冻干粉，既可作为一种保健食品，又可作为一种原料，用于与高甘油三酯相关的代谢性慢性疾病保健食品或药品的开发。
附图说明
20.图1为实验例1的各组甘油三酯测试结果；
21.图2为实验例2的对照组(a)、模型组(b)、治疗组(c)和预防组(d)细胞形态；
22.图3为实验例2的各组葡萄糖测试结果；
23.图4为实验例3的各组i型胶原含量测试结果；
24.图5为实验例3的对照组(a)、模型组(b)、治疗组(c)和预防组(d)肝细胞形态；
25.图6为实验例4的各组肝细胞增殖情况。
具体实施方式
26.为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
27.在本发明的描述中，如未特殊说明，所用试剂均为市售，所用方法均为本领域常规技术。所述脐带间充质干细胞均为本实验室制备所得。
28.所述脐带间充质干细胞的具体制备方法如下：
29.1.组织接收：离体采集临床健康分娩的婴儿脐带，并放置在无菌生理盐水中(含
5％(v/v)青链霉素)，密封保存，1h内尽快送达实验室；
30.2.组织清洗：在超净工作台内，将接收的脐带组织取出，放入培养皿中，用生理盐水(含5％(v/v)青链霉素)冲洗两次，剪掉脐带两端结扎部位，生理盐水再次洗涤2
‑
3遍；沿脐带生长方向，用无菌剪刀剪开脐带，生理盐水(含5％(v/v)青链霉素)洗涤脐带内血块，直至组织发白。
31.3.组织贴壁培养：用无菌剪刀和镊子剔除脐带内血管(2条动脉，1条静脉)，生理盐水(含5％(v/v)青链霉素)清洗一遍，获得华通氏胶。华通氏胶剪碎至1mm3，将组织块均匀铺在无菌培养皿中，组织块表面滴少许胎牛血清(覆盖组织即可)，放置在37℃，5％co2培养箱中孵育。6
‑
8h后补加完全培养基(90％α
‑
mem 10％fbs)，继续培养箱中培养，间隔3
‑
4d换液。
32.4.细胞获得：组织块培养10
‑
14d后，显微镜下观察组织块周围有大量细胞爬出，此时转移组织块，0.01m、ph 7.2
‑
7.4的pbs缓冲液清洗细胞表面，加入0.25％不含edta的胰蛋白酶消化2
‑
3min，完全培养基终止后，吹打获得细胞悬液，800rpm离心5min，弃上清，所的沉淀即为p0代细胞。
33.需要说明的是，上述间充质干细胞制备所用初始材料均为离体材料，本发明是将离体的材料收集后使用，并非手术方法。本领域技术人员也可以选择其他合法合伦理的方式获得脐带，或者选择人工培养的脐带组织。
34.实施例1
35.一种能降低甘油三酯的干细胞因子冻干粉，按照以下步骤制备：
36.将p0代细胞间充质干细胞以1.0
×
105/cm2密度接种于细胞培养瓶内，加入间充质干细胞培养基培养，待生长至密度为80％时，无菌操作台环境下收集细胞培养上清，上清经离心去除细胞碎片后，再经超滤浓缩膜包截流处理得到浓缩液，进而
‑
40℃冷冻干燥后得到干细胞因子冻干粉，常温保存。每1ml浓缩液保存在一个西林瓶中，再经
‑
40℃冻干后保存备用，全部的浓缩液均分装并冻干。
37.所述的间充质干细胞培养基为含体积分数10％胎牛血清的α
‑
mem；
38.所述的离心条件为800rpm，离心10min；
39.所述的超滤浓缩膜包的截流分子量为5kd、50kd两种，去除细胞碎片后的上清液先经过50kd膜包超滤，收集滤过液，滤过夜再经过5kd膜包进行浓缩，收集回流液为最终的浓缩液。
40.实施例2
41.一种能降低甘油三酯的干细胞因子冻干粉，按照以下步骤制备：
42.将p10代细胞间充质干细胞以3.0
×
105/cm2密度接种于细胞培养瓶内，加入间充质干细胞培养基培养，待生长至密度为95％时，比如无菌操作台环境下收集细胞培养上清，上清经离心去除细胞碎片后，再经超滤浓缩膜包截流处理得到浓缩液，进而
‑
40℃冷冻干燥后得到干细胞因子冻干粉，常温保存。
43.所述的间充质干细胞培养基为含体积分数10％胎牛血清的α
‑
mem；
44.所述的离心条件为1500rpm，离心5min；
45.所述的超滤浓缩膜包的截流分子量为5kd、50kd两种，去除细胞碎片后的上清液先经过50kd膜包超滤，收集滤过液，滤过夜再经过5kd膜包进行浓缩，收集回流液为最终的浓缩液。
46.实施例3
47.一种能降低甘油三酯的干细胞因子冻干粉，按照以下步骤制备：
48.将p3代细胞间充质干细胞以1.2
×
105/cm2密度接种于细胞培养瓶内，加入间充质干细胞培养基培养，待生长至密度为85％时，比如无菌操作台环境收集细胞培养上清，上清经离心去除细胞碎片后，再经超滤浓缩膜包截流处理得到浓缩液，进而
‑
40℃冷冻干燥后得到干细胞因子冻干粉，常温保存。
49.所述的间充质干细胞培养基为含体积分数10％胎牛血清的α
‑
mem；
50.所述的离心条件为1000rpm，离心8min；
51.所述的超滤浓缩膜包的截流分子量为5kd、50kd两种，去除细胞碎片后的上清液先经过50kd膜包超滤，收集滤过液，滤过夜再经过5kd膜包进行浓缩，收集回流液为最终的浓缩液。
52.实施例4
53.一种能降低甘油三酯的干细胞因子冻干粉，按照以下步骤制备：
54.将p6代细胞间充质干细胞以3.6
×
105/cm2密度接种于细胞培养瓶内，加入间充质干细胞培养基培养，待生长至密度为90％时，无菌环境下(比如无菌操作台环境)收集细胞培养上清，上清经离心去除细胞碎片后，再经超滤浓缩膜包截流处理得到浓缩液，进而
‑
40℃冷冻干燥后得到干细胞因子冻干粉，常温保存。
55.所述的间充质干细胞培养基为含体积分数10％胎牛血清的α
‑
mem；
56.所述的离心条件为1200rpm，离心8min；
57.所述的超滤浓缩膜包的截流分子量为5kd、50kd两种，去除细胞碎片后的上清液先经过50kd膜包超滤，收集滤过液，滤过夜再经过5kd膜包进行浓缩，收集回流液为最终的浓缩液。
58.下面以实施例1制备的干细胞因子冻干粉为例，说明本发明的效果，下述实验例中所使用pbs为0.01m、ph 7.4。
59.实验例1干细胞因子作用于高甘油三酯细胞模型
60.配制干细胞因子溶液：取实施例1制备的一瓶干细胞因子冻干粉采用1ml的mem液体培养基复溶，得到干细胞因子溶液。
61.将生长状态良好的hepg2细胞按照1.2
×
104/孔的密度接种于96孔板中，设置对照组(control组)、模型组(model组)、治疗组(treatment组)和预防组(prevention组)。细胞贴壁培养24h后，除空白组外，其余各组细胞加入0.5mmol/l(终浓度)油酸进行孵育24h，预防组在油酸加入前2h提前加入12.5μl干细胞因子溶液进行共同孵育。除治疗组外，孵育24h结束后，其余各组收集细胞进行甘油三酯含量测定。治疗组在油酸孵育结束后，弃掉上清，pbs清洗两遍，加入12.5μl干细胞因子溶液，孵育24h后收集细胞，按照索莱宝甘油三酯检测试剂盒进行甘油三酯含量测定。
62.图1是干细胞因子作用后高血脂模型后各组的细胞中甘油三酯含量检测结果，图1中的纵坐标表示指代的是96孔板中每孔细胞中含有的甘油三酯含量，结果显示，与对照组相比，油酸诱导的模型组甘油三酯含量极显著升高(p＜0.01)，说明高血脂细胞模型造模成功；而经过干细胞因子干预的预防组和治疗组甘油三酯含量降低，且具有统计学意义(p＜0.05)，说明干细胞因子可显著抑制高血脂模型中甘油三酯的产生，对于高血脂既具有治疗
作用，又具有预防作用。
63.实验例2干细胞因子作用于高血糖细胞模型
64.配制干细胞因子溶液：取实施例1制备的一瓶干细胞因子冻干粉采用1ml的mem液体培养基复溶，得到干细胞因子溶液。
65.将生长状态良好的hepg2细胞按照1.2
×
104/孔的密度接种于96孔板中，设置对照组(control组)、模型组(model组)、治疗组(treatment组)和预防组(prevention组)。培养24h后，除空白组外，其余各组细胞加入0.5mmol/l(终浓度)油酸进行孵育，预防组在油酸加入前2h提前加入12.5μl干细胞因子溶液进行共同孵育。油酸孵育36h后，除治疗组外，其余各组弃掉上清，pbs清洗两遍，2％的mem培养基孵育20min，pbs清洗一遍，换无血清培养基孵育24h后收集上清作为葡萄糖检测的样本。治疗组在油酸孵育结束后，弃掉上清，pbs清洗两遍，加入12.5μl干细胞因子溶液孵育。孵育24h后，弃掉清，pbs清洗两遍，2％的mem培养基孵育20min，pbs清洗一遍，换无血清培养基孵育24h后收集上清作为葡萄糖检测的样本。
66.图2是干细胞因子作用后高血糖模型后各组细胞形态(40
×
倍放大)，如图可以看出，相对于对照组，油酸诱导的高血糖模型组细胞折光度降低，形态较差，数量减少；而经过干细胞因子预防(预防组)和治疗(治疗组)的细胞折光度好，细胞形态正常，数量接近于对照组。
67.按照索莱宝葡萄糖检测试剂盒说明书进行各组上清液中葡萄糖含量检测。图3是干细胞因子作用后各组的细胞上清中葡萄糖含量检测结果，结果显示，与对照组相比，油酸诱导的模型组葡萄糖含量显著升高(p＜0.05)，说明高血糖细胞模型造模成功；而经过干细胞因子干预的预防组和治疗组葡萄糖含量降低，且具有统计学意义，说明干细胞因子可显著抑制高血糖模型中葡萄糖的产生，对于高血糖既具有治疗作用，又具有预防作用。
68.实验例3干细胞因子作用于肝纤维化细胞模型
69.配制干细胞因子溶液：取实施例1制备的一瓶干细胞因子冻干粉采用1ml的mem液体培养基复溶，得到干细胞因子溶液。
70.将生长状态良好的hsc
‑
t6细胞按照1.2
×
104/孔的密度接种于96孔板中，设置对照组(control组)、模型组(model组)、治疗组(treatment组)和预防组(prevention组)。培养24h后，弃掉培养基，加入含2％fbs的mem培养液进行细胞饥饿12h。之后各组换含10％(v/v)fbs的mem培养基，除空白组外，其余各组细胞加入1.5μg/ml的lps进行孵育，预防组在lps加入前2h提前加入25μl干细胞因子溶液进行共同孵育。孵育24h后，除治疗组外，其余各组收集上清作为i型胶原检测的样本。
71.治疗组在lps孵育结束后，弃掉上清，pbs清洗两遍，加入25μl干细胞因子溶液孵育。孵育24h后，收集上清作为i型胶原检测的样本。按照上海酶联免疫i型胶原elisa检测试剂盒进行i型胶原含量检测。
72.图4是干细胞因子作用后肝纤维化细胞模型后各组的细胞中i型胶原含量检测结果，p＜0.05，结果显示与对照组相比，模型组i型胶原含量显著高于对照组，并具有统计学意义，说明肝纤维细胞模型造模成功；而经过干细胞因子干预的预防组和治疗组，i型胶原含量明显降低，具有统计学意义，尤其是预防组含量最低，且p＜0.01，表明干细胞因子对于肝纤维化具有预防及治疗作用。
73.图5是干细胞因子作用后肝纤维化细胞模型后各组肝细胞形态(40
×
倍放大)；由
图可以看出，lps诱导的肝纤维化模型组部分细胞出现崩解、凋亡，细胞数量减少，且细胞折光度降低，而经过干细胞因子干预后的预防组和治疗组细胞形态接近于对照组细胞形态，细胞折光度强，细胞数量增加。
74.实验例4干细胞因子与肝细胞共培养
75.配制干细胞因子溶液：取实施例1制备的一瓶干细胞因子冻干粉采用1ml的mem液体培养基复溶，得到干细胞因子溶液。
76.将生长状态良好的肝细胞(lx
‑
2)按照3
×
105/孔的密度接种于6孔板中，设置对照组(肝细胞组)及实验组(肝细胞 干细胞因子组)，加入含10％(v/v)fbs的dmem培养基培养过夜。待细胞贴壁后，实验组每孔加12.5μl加入干细胞因子溶液进行孵育，对照组不做任何处理，于24h、48h显微镜下观察细胞生长状况。
77.图6是共培养后干细胞因子促进正常肝细胞的增殖情况(40
×
倍放大)，由图可以看出，相对于正常肝细胞，干细胞因子与正常肝细胞共培养后48h，在视野下肝细胞数量明显增多，细胞密度几乎接近于100％，说明干细胞因子能促进肝细胞的增殖。
78.需要说明的是，在本发明中，所述实施例1
‑
4制备的干细胞因子冻干粉的甘油三酯、葡萄糖和i型胶原含量测试结果误差不超过8％，为了防止赘述，本实验例仅记载了实施例1制备的组合物的效果，但是不应忽略其他实施例2
‑
4效果的可信度。
79.需要说明的是，本发明所用冻干粉是由干细胞因子制备得到，并非干细胞，干细胞与细胞因子的优劣势区别的。
80.干细胞是一类具有自我复制能力强的多潜能细胞，其强大的旁分泌作用可用于修复损伤组织，因此近几年来在疾病治疗上备受关注，干细胞治疗包括单细胞悬液静脉移植及局部干细胞移植，无论哪种移植方式，都存在一定的风险，需要专业人员操作，且活细胞在体外存活时间短，易失活，因此普及性不高。
81.干细胞因子是干细胞培养过程中产生的代谢产物，也是干细胞治疗中发挥旁分泌作用的主力军，具有调节免疫、抗炎，诱导干细胞归巢的作用，在体外可进行大规模提取分离，并经过冻干工艺处理后，既能保留了干细胞因子的活性，又能长时间保存，远距离运输。干细胞因子中富含有多种生长因子和细胞因子，包括与代谢相关的成纤维细胞生长因子(fgf)、血管内皮生长因子(vegf)、肝细胞生长因子(hgf)及白介素10(il
‑
10)等。目前成纤维细胞生长因子fgf家族包含有23种亚型，分别参与内分泌调节，刺激新生血管形成，促进细胞有丝分裂增殖等，许多fgf家族成员都与脂肪代谢密切相关，如fgf9具有促进脂肪细胞新生，增加脂质代谢，增强胰岛素敏感性。hgf是肝细胞来源的最强有力的生长因子，以自分泌或旁分泌的形式作用于受损组织，作用于上皮细胞进而促进再生。众所周知，高甘油三酯、高血压最先累及受损的是血管内皮，内皮细胞一旦受损，易引起血栓及凝血障碍，遂致动脉硬化等病症。与vegf不同的是，hgf不但具有与vegf相同的促进血管内皮细胞增殖的功效，还可以特异性抑制血管内皮细胞死亡，即具有抑制血管内皮之死亡，又具有维持血管内皮之生存的功效。此外，hgf还可通过抑制tgf
‑
β1的表达，抑制肝星状细胞活化，减轻纤维化症状。vegf是一类参与血管再生的生长因子，vegf与内皮细胞膜上的受体vegfr结合后，在体内诱导血管新生、促进血管通透性增加、促进血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等，是促进血管内皮细胞生长的高度特异性物质。vegfb是vegf其中的一个亚型，其除了具有血管再生功效外，还与能量代谢密切相关，研究表明，抑制vegfb后，脂肪组织发育相关基因表达
改变，导致脂肪组织能量代谢下降，机体代谢减缓，因此vegfb具有加速能量消耗，调节脂肪合成的作用。il
‑
10参与i型糖尿病的免疫反应，能抑制th1型免疫反应，从而保护胰岛细胞，同时作为抗炎因子，能减轻肝脏炎症反应，减少肝损伤，起到保肝护肝的作用。需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
82.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。