一种双靶向DNA纳米载药复合体及制药用途的制作方法

一种双靶向dna纳米载药复合体及制药用途
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种双靶向dna纳米载药复合体及制药用途。


背景技术：

2.黑色素瘤(malignant melanoma)是人类皮肤肿瘤中恶性程度较高的一种，近年来，黑色素瘤的发病率持续增加，并呈年轻化的趋势。虽然免疫治疗和分子靶向治疗的最新进展为黑色素瘤提供了一些更为有效的治疗方式，但这些治疗方法仍然不能完全解决药物的毒副作用这个难题。因此，研发新的针对黑色素瘤的靶向治疗方法，降低化疗药物的毒副作用，对于提高黑色素瘤治疗的总体疗效至关重要。
3.cd44分子是一类跨膜单链糖蛋白，它通过介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的信号传导来调控细胞的多种生物功能。研究发现，cd44在多种肿瘤细胞表面过表达并与肿瘤的发生发展及侵袭转移密切相关。由于cd44基因在表达过程中有外显子选择性剪接和多种翻译后修饰(如糖基化修饰)现象存在，导致cd44基因产物呈现多结构和多功能化特征，其中在肿瘤细胞中特异性表达的cd44变体与肿瘤的恶性行为密切相关。鉴于在肿瘤细胞和正常细胞表面的cd44存在结构和功能上的差异，特异性靶向肿瘤细胞表面cd44的生物分子可望在肿瘤靶向治疗和药物靶向递送中发挥重要作用。
4.目前，最有效的靶向cd44的抗肿瘤策略是以抗cd44抗体作为靶向分子的抗体耦联药物。然而，各种强烈的毒副作用导致临床实验均被叫停。此外，cd44的天然配体是透明质酸(ha)，已有大量研究工作利用ha靶向识别肿瘤细胞表面的cd44分子，研发肿瘤靶向治疗方法。然而，肿瘤细胞可分泌大量ha，形成“糖外衣”，使药物难以穿透肿瘤细胞间质，不能顺利到达肿瘤细胞。而且，ha和cd44的相互作用掩蔽了cd44靶点的裸露，减低靶向药物的杀伤效果。
5.核酸适配体是一段单链dna或rna分子，具有特定的三维构象，能高亲和力的识别靶标分子，是理想的靶向识别分子。虽然核酸适配体作为靶向分子已经展现出了巨大的应用前景，但是还存在很大的优化空间。为了进一步改善核酸适配体的理化性质以增加它与靶标的亲和力和特异性，通常需要对核酸适配体序列进行合理的化学修饰，如将寡聚核酸链中戊糖环的2’位h用
‑
nh2、
‑
och3、
‑
f等取代，将正常的碱基用锁核苷等结构取代，或将磷酸二酯键修饰为硫代磷酸二酯键等。近年研究发现，通过指数富集的配体系统进化技术(selex)筛选获得的硫代修饰的dna核酸适配体能够特异性识别肿瘤细胞表面的cd44分子。与cd44抗体和ha相比，cd44核酸适配体具有肿瘤细胞间质穿透能力和靶标亲和力，又不会导致强烈的免疫反应，是更为理想的靶向分子。
6.核仁素是一种蛋白分子，高度保守，主要由n端、中心区域和c端三个不同的结构域组成，不同结构域发挥不同的生物学功能。其中，n端参与调节蛋白与蛋白之间的相互作用和细胞周期等；中心区域提供rna等核酸的识别结合位点等；c端功能上以帮助较大rna定位为主。有研究表明，在正常细胞膜表面核仁素表达量很少，而在黑色素瘤、hela(宫颈癌细胞)、乳腺癌细胞、肝癌细胞、淋巴瘤细胞等多种肿瘤细胞膜表面核仁素过表达，而且，核仁
素可以将抗肿瘤药物分子从细胞表面转运到细胞核。因此，针对核仁素的抗肿瘤靶向治疗一直是靶向治疗领域的研究热点。
7.as1411也叫gro29a，是由26个核苷酸组成的一种核酸适配体。有研究表明，as1411具有良好的抗肿瘤活性，在鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等80多种肿瘤中均能发挥抑制肿瘤细胞增殖的效果。更为重要的是，as1411可以特异性识别肿瘤细胞表面过表达的核仁素分子，并以受体介导的内吞方式选择性地将as1411浓集于肿瘤细胞内。多项研究均表明，as1411作为靶向分子能够修饰于药物转运载体上，从而将药物分子成功靶向递送到黑色素瘤等多种肿瘤细胞中，并发挥抗肿瘤治疗效应。目前，基于核仁素的靶向治疗方法中，as1411作为靶向分子的药物转运载体是研究最广泛和效果最好的一种靶向策略。虽然基于as1411的靶向治疗已经取得了一定的进展，但是目前研究中所使用的as1411均为天然核酸序列，耐核酸酶降解能力和靶标亲和力都有待提高。本发明对as1411进行了多种化学修饰，包括d
‑
异胸苷(d)、l
‑
异胸苷(l)和2
’‑
脱氧肌苷(di)修饰，并从中筛选得到一系列与靶标蛋白结合能力及生物学作用更强修饰物。与天然as1411相比，这些化学修饰物是更为理想的靶向分子。
8.阿霉素(doxorubicin，dox)是临床常用的一种蒽环类抗生素，其可以嵌插结合的方式结合于相邻的脱氧核糖核酸碱基对中，从而抑制脱氧核糖核酸合成，并且破坏脱氧核糖核酸的三级结构。dox在临床广泛用于治疗多种肿瘤，表现出较好的抗肿瘤疗效。临床实际使用过程中，由于阿霉素本身不具有细胞选择性，游离阿霉素因为其两亲性的性质可以容易的通过细胞膜进入细胞内发挥作用，因此阿霉素在临床使用过程中会对正常组织细胞产生严重的毒副作用，使其使用剂量受到限制，影响了阿霉素作为抗肿瘤药物的效果。因此，如何降低不良反应、降低对正常组织毒性是目前阿霉素在临床应用中亟待解决的问题。
9.近年来，dna自组装纳米技术得到了迅速发展，多种新技术(单分子剪切
‑
黏贴smcp、生物传感dna自组装等)使得遗传物质dna成为了“材料学新贵”，在医学、电子学和光子学等领域均表现出了巨大的应用前景。常见的dna纳米结构有dna四面体、dna纳米管和dna空间笼等。dna四面体结构具有较好的空间结构刚性和稳定性，由6条单链dna根据碱基互补配对原理自组装而成。它的每一条边均由dna双螺旋结构组成，而在每条边上均可以设计丰富的功能化修饰位点，如可以携带其它分子的手臂链。此外，dna四面体的双螺旋结构可以使化疗药物阿霉素以嵌插结合的方式嵌入其中。因此，dna四面体结构是理想的药物装运载体。
10.基于上述研究背景，核仁素和cd44在黑色素瘤细胞表面过表达，均为理想的肿瘤靶向识别位点。虽然基于核仁素和cd44的靶向治疗策略取得了一定的进展，但都存在尚需解决的问题。而且，上述靶向治疗策略均都只针对细胞表面单一靶点来实现对肿瘤细胞的识别。如药物转运载体能同时识别细胞膜上的这两种蛋白分子，既能增强对肿瘤细胞识别的特异性，又能提高肿瘤细胞对药物的摄取，降低药物的毒副作用，是更加精准有效的靶向治疗策略。


技术实现要素：

11.本发明的目的在于提供一种双靶向dna纳米载药复合体，该载药复合体是以一条aptamer1和一条天然as1411或化学修饰as1411以碱基互补配对的方式同时连接到dna四面
体上，所述化学修饰as1411分别记为as1411
‑
1、as1411
‑
2、as1411
‑
3，分别得到dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411、dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
1、dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
2、dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
3，
12.所述的dna四面体结构是将6条单链的dna链以碱基互补配对的方式组装而成；
13.所述的aptamer1、as1411、as14111
‑
1、as1411
‑
2、as1411
‑
3的序列如下：
[0014][0015][0016]
所述的6条单链的dna链具体为s1、s2、s4、s5、s7、s8，序列如下：
[0017][0018]
所述双靶向dna纳米载药复合体可以应用于制备治疗黑色素瘤的药物。所述载药复合体装载的药物为阿霉素。
[0019]
本发明构建了四种基于cd44和核仁素核酸适配体的双靶向dna纳米载药系统，与单靶向载药复合体和阴性对照组相比，四种双靶向载药复合体具有更强的耐核酸酶降解能力、靶向黑色素瘤a375细胞的能力、抑制a375细胞增殖的能力和诱导a375细胞发生g1期阻滞的能力。
[0020]
本发明以dna核酸四面体作为载体，以cd44核酸适配体和化学修饰as1411作为靶向分子，组装成一类新型dna纳米双靶向载药系统。以嵌插结合的方式装载抗肿瘤药物阿霉素后，这种新型双靶向dna纳米载药系统利用携带的两种核酸适配体特异性识别黑色素瘤细胞表面过表达的核仁素和cd44分子，将载药复合体特异性结合和富集到肿瘤细胞表面，并以受体介导的内吞方式转运入胞，由此将化疗药物阿霉素高效靶向递送至肿瘤细胞中，进而发挥抗肿瘤效应。本发明的成功实施将为肿瘤的精准靶向治疗提供新方法和新思路，具有重要的应用前景。
附图说明
[0021]
图1为dna四面体构建鉴别的电泳图；1：s1链；2：s1链 s2链；3：s1链 s2链 s7链；4：s1链 s2链 s4链 s7链；5：s1链 s2链 s4链 s5链 s7链；6：s1链 s2链 s4链 s5链 s7链 s8链。
[0022]
图2为dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411构建鉴别的电泳图；1：dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411；2：dna四面体
‑
aptamer1；3：dna四面体
‑
as1411；4：dna四面体。
[0023]
图3为dna四面体
‑
aptamer阴性对照
‑
as1411阴性对照构建鉴别的电泳图；1：dna四面体
‑
aptamer阴性对照
‑
as1411阴性对照；2：dna四面体
‑
aptamer阴性对照；3：dna四面体
‑
as1411阴性对照；4：dna四面体。
[0024]
图4为dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
1构建鉴别的电泳图；1：dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
1；2：dna四面体
‑
aptamer1；3：dna四面体
‑
as1411
‑
1；4：dna四面体。
[0025]
图5为dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
2构建鉴别的电泳图；1：dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
2；2：dna四面体
‑
aptamer1；3：dna四面体
‑
as1411
‑
2；4：dna四面体。
[0026]
图6为dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
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3构建鉴别的电泳图；1：dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
3；2：dna四面体
‑
aptamer1；3：dna四面体
‑
as1411
‑
3；4：dna四面体。
[0027]
图7为dna四面体阿霉素负载量。
[0028]
图8为dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
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阿霉素构建鉴别的电泳图；1:dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
阿霉素组；2:dna四面体
‑
aptamer1
‑
阿霉素组；3:dna四面体
‑
as1411
‑
阿霉素组；4:dna四面体
‑
阿霉素组；5:dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411组；6:dna四面体
‑
aptamer1组；7:dna四面体
‑
as1411组；8:dna四面体组。
[0029]
图9为dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑1‑
阿霉素构建鉴别的电泳图；1:dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑1‑
阿霉素组；2:dna四面体
‑
aptamer1
‑
阿霉素组；3:dna四面体
‑
as1411
‑1‑
阿霉素组；4:dna四面体
‑
阿霉素组；5:dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
1组；6:dna四面体
‑
aptamer1组；7:dna四面体
‑
as1411
‑
1组；8:dna四面体组。
[0030]
图10为dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑2‑
阿霉素”构建鉴别的电泳图；1:dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑2‑
阿霉素组；2:dna四面体
‑
aptamer1
‑
阿霉素组；3:dna四面体
‑
as1411
‑2‑
阿霉素组；4:dna四面体
‑
阿霉素组；5:dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
2组；6:dna四面体
‑
aptamer1组；7:dna四面体
‑
as1411
‑
2组；8:dna四面体组。
[0031]
图11为dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑3‑
阿霉素构建鉴别的电泳图；1:dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑3‑
阿霉素组；2:dna四面体
‑
aptamer1
‑
阿霉素组；3:dna四面体
‑
as1411
‑3‑
阿霉素组；4:dna四面体
‑
阿霉素组；5:dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
3组；6:dna四面体
‑
aptamer1组；7:dna四面体
‑
as1411
‑
3组；8:dna四面体组。
[0032]
图12为dna四面体
‑
aptamer阴性对照
‑
as1411阴性对照
‑
阿霉素构建鉴别的电泳图；1:dna四面体
‑
阿霉素组；2:dna四面体
‑
aptamer阴性对照
‑
阿霉素组；3:dna四面体
‑
as1411阴性对照
‑
阿霉素组；4:dna四面体
‑
aptamer阴性对照
‑
as1411阴性对照
‑
阿霉素组。
[0033]
图13为双靶向载药复合体耐核酸酶能力得到增强；a:核酸适配体aptamer1组；b:dna四面体组；c:dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
阿霉素组；d:dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑1‑
阿霉素组；e:dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑2‑
阿霉素组；f:dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑3‑
阿霉素组。
[0034]
图14为0.5μm dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411入胞效率明显增强；数据以表示，**p<0.01。
[0035]
图15为0.75μm dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411入胞效率明显增强，数据以表示，**p<0.01。
[0036]
图16为dna四面体
‑
aptamer阴性
‑
as1411阴性入胞效率无明显差异。
[0037]
图17为dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
阿霉素入胞效率；1：四面体
‑
阿霉素；2：四面体
‑
aptamer1
‑
阿霉素；3：四面体
‑
as1411
‑
阿霉素；4：四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
阿霉素；数据以表示，*p<0.05，**p<0.01。
[0038]
图18为dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑1‑
阿霉素入胞效率；1：四面体
‑
阿霉素；2：四面体
‑
aptamer1
‑
阿霉素；3：四面体
‑
as1411
‑1‑
阿霉素；4：四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑1‑
阿霉素；数据以表示，*p<0.05，**p<0.01。
[0039]
图19为dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑2‑
阿霉素入胞效率；1：四面体
‑
阿霉素；2：四面体
‑
aptamer1
‑
阿霉素；3：四面体
‑
as1411
‑2‑
阿霉素；4：四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑2‑
阿霉素；数据以表示，*p<0.05，**p<0.01。
[0040]
图20为dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑3‑
阿霉素入胞效率；1：四面体
‑
阿霉素；2：四面体
‑
aptamer1
‑
阿霉素；3：四面体
‑
as1411
‑3‑
阿霉素；4：四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑3‑
阿霉素；数据以表示，*p<0.05，**p<0.01
[0041]
图21为dna四面体
‑
aptamer阴性对照
‑
as1411阴性对照
‑
阿霉素入胞效率；1：四面体
‑
阿霉素；2：四面体
‑
aptamer1
‑
阿霉素；3：四面体
‑
aptamer阴性对照
‑
阿霉素；4：四面体
‑
as1411
‑
阴性对照
‑
阿霉素；5：四面体
‑
aptamer阴性对照
‑
as1411阴性对照
‑
阿霉素；数据以表示，*p<0.05，**p<0.01。
[0042]
图22为载药复合体入胞效率分析；1：四面体
‑
阿霉素；2：四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
阿霉素；3：四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑1‑
阿霉素；4：四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑2‑
阿霉素；5：四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑3‑
阿霉素；6：四面体
‑
aptamer阴性
‑
as1411阴性
‑
阿霉素，数据以表示，*p<0.05，**p<0.01。
[0043]
图23为24小时组中双靶向载药复合体cck8实验；数据以表示，*p<0.05。
[0044]
图24为48小时组双靶向载药复合体cck8实验；数据以表示，*p<0.05。
[0045]
图25为72小时组双靶向载药复合体cck8实验；数据以表示，*p<0.05。
[0046]
图26为dna四面体
‑
apt阴性
‑
as1411阴性
‑
阿霉素对a375抑制作用低于阿霉素组。
[0047]
图27为四种双靶向dna纳米载药复合体对a375细胞抑制作用明显高于双阴性dna纳米载药复合体系。
[0048]
注：aptamer简写为apt，说明书附图中，表示aptamer1、apt1表示的是同一物质。
具体实施方式
[0049]
实施例1材料与方法
[0050]
本发明所用的细胞系为人恶性黑色素瘤细胞a375，购于中国典型培养物保藏中心。本发明构建dna四面体的单链dna，均购自上海生工上海合成部，具体序列及修饰方法及修饰位点见下表1。
[0051]
表1 dna单链序列及修饰方法
[0052][0053]
本发明涉及的核酸适配体，均购自上海生工上海合成部，具体序列及修饰方法及修饰位点见下表2。
[0054]
表2核酸适配体序列及修饰方法
[0055][0056][0057]
1.1本发明所涉及溶液的配制
[0058]
1)10％完全细胞培养基：取dmem高糖培养基180ml，fbs特级胎牛血清20ml，存放至高压灭菌并烘干后的250ml规格丝口瓶，加入青霉素配制浓度为100μg/ml、链霉素配制浓度为100μg/ml。四度冰箱封口膜封口保存，保质期2周。
[0059]
2)磷酸盐缓冲液(pbs)：取磷酸盐干粉，先加入200ml去离子水，磁珠搅拌10分钟，待其溶解后，用去离子水定容到400毫升，继续磁珠800转搅拌30min，得到5倍的pbs储存液，置于4℃保存。取储存液用去离子水稀释5倍，即可得到工作液，调整ph至7.4，高压灭菌30min，冷却后置于4℃冰箱，保存备用，保质期1周。
[0060]
3)细胞冻存液(a375细胞)：20％特级胎牛血清、10％dmso、70％dmem高糖培养基，配置总量1ml/支，使用前30min配置。
[0061]
4)tm缓冲液：取tris
‑
base粉末0.0101g、mgcl2·
5h2o粉末0.0102g，与高压灭菌的去离子水10ml，共同放置于15ml试管中，震荡溶解10min，放置于4℃冰箱过夜备用，保质期2周。
[0062]
5)过硫酸铵(ap)工作液：称取0.6g过硫酸铵，加高压灭菌的去离子水6ml，存放与15ml离心管，震荡10min后4℃过夜备用，保质期2周。
[0063]
6)tbe储存液(5倍)称取tris
‑
base粉末27g、edta 1.86g、硼酸13.75g，置于1l烧杯中，加入300ml去离子水，磁力搅拌30min，用去离子水定容总量到500ml，继续搅拌60min，待其充分溶解后，室温保存备用，保质期2周。
[0064]
7)30％n,n
‑
亚甲基双丙烯酰胺(mba)溶液：带好手套，保护好口鼻，电子天平取丙烯酰胺粉剂58.4414g，甲叉双丙烯酰胺1.55844g，放入烧杯，加入高压灭菌的去离子水150ml，磁力搅拌2h后，用高压灭菌后的去离子水定容总量至200ml，用锡箔纸包裹避光，磁
力搅拌过夜，用50ml注射器抽吸后用0.22μm无菌针头滤嘴过滤，存放于避光容器中4℃冰箱保存。保质期3个月。
[0065]
8)非变性聚丙烯酰胺凝胶：取bio
‑
rad 1.0mm清水洗净残余胶，双蒸水清洗，电热干燥箱内烘干，取出与其他组件安装，配置凝胶，取去离子水9.4ml、30％mba 2.5ml、tbe储存液(5倍)3ml、ap 110μl、temed 10μl，在离心管震荡混匀，用移液器将混匀的凝胶溶液沿厚玻璃板侧平稳加入，凝胶溶液接近薄玻璃板平面时，插入样品梳，静止等待凝胶凝固，室温较高，25min，如室温较低，适当延长静止时间。
[0066]
9)阿霉素溶液配制：取阿霉素粉剂10mg,加入20ml灭菌的pbs缓冲液，配制成阿霉素储存液(10倍)，用1.5ml ep管分装，单支0.5ml阿霉素储存液，放置于
‑
20℃冰箱避光保存。将0.5ml阿霉素储存液加入9.5ml pbs缓冲液，配制成阿霉素工作液(86.24μmol/l)，4℃冰箱避光保存。保质期4周。
[0067]
1.2实验方法
[0068]
1.2.1黑色素瘤a375细胞培养
[0069]
1)细胞培养：将购置的细胞培养在dmem高糖完全培养基(dmem高糖培养基 10％胎牛血清 链霉素、青霉素)中，培养箱温度(37℃)、co2浓度(5％)、相对饱和湿度(95％)。培养期间根据培养瓶底部细胞密度来指导细胞培养操作。密度低于75％时，换液处理，吸去培养瓶中旧培养基，pbs缓冲液5ml洗涤a375细胞1次，吸去pbs缓冲液，加入dmem高糖完全培养基5ml。
[0070]
2)黑色素瘤a375细胞传代：培养瓶底黑色素瘤a375细胞密度达到75％左右，进行细胞传代处理，吸去旧培养基，加入pbs缓冲液洗涤a375细胞2次，加入37℃的含有edta胰酶(0.25％浓度)1ml，摇晃培养瓶使得胰酶覆盖黑色素瘤a375细胞。将培养瓶放置于显微镜下观察，当黑色素瘤a375细胞形态收缩变圆时，吸去胰酶，加入dmem完全培养基5ml终止消化，用吸量管吹打至细胞从培养瓶底部脱落，形成细胞悬液。将细胞悬液均匀的分装至新的3个培养瓶中。
[0071]
3)黑色素瘤a375细胞冻存：取对数期增长、形态良好的黑色素瘤a375细胞进行冻存。将细胞经过消化制成细胞悬液后，将细胞悬液转移到离心管中，离心5min(1000rpm)，离心结束吸去上层旧培养基，留下细胞团块，用预先配置的冻存液(20％胎牛血清 10％dmso 70％dmem高糖培养基)1ml重悬细胞，转移至高压灭菌的冻存管中，封口并记录细胞种类及冻存时间。将冻存管转移至程序梯度降温盒过夜，最后转移至液氮罐，长期存放。
[0072]
4)黑色素瘤a375细胞复苏：预先将恒温水浴锅温度设置为37℃，将黑色素瘤a375细胞从液氮中取出，立即将冻存管中下部置于水浴锅，缓慢晃动加速其融化过程，1min内融化后放入离心机进行离心(1200rpm)，吸去离心管内上层旧冻存液，用1ml dmem完全培养基重悬，并转移至细胞培养瓶中，再将培养瓶中加入dmem完全培养基4ml，放入细胞培养箱。
[0073]
1.2.2细胞计数：采用细胞计数板法进行细胞计数
[0074]
1.2.3细胞接种
[0075]
1)当培养瓶内细胞密度70％、形态良好、对数期增殖时，消化离心后，用1ml dmem完全培养基重悬。2)取100μl细胞悬液进行细胞计数。3)根据后续实验需求，取不同规格的细胞培养板(6/12/24/96孔)中，加入不同总量的dmem完全培养基(6孔
‑
3ml/12孔
‑
2ml/24孔
‑
1ml/96孔
‑
200μl)，晃动接种板，使dmem完全培养基完全润湿培养板孔底部。4)根据细胞
所需量计算加入细胞悬液的总量，滴入细胞悬液后，紧贴试验台顺时针/逆时针各晃动2圈，静置10min后放入co2细胞培养箱中。
[0076]
1.2.4 dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411载药体系构建
[0077]
1)取上海生工上海合成部合成的dna单链(s1、s2、s4、s5、s7、s8)，核对ep管标签及有无破损。2)将6条dna单链ep管放于高速台式离心机离心(12000rpm、5min)，用预选配制的tm缓冲液将dna单链配制成20μmol/l。3)六条dna单链各取等量混匀，放于pcr仪中构建，构建条件：42℃预热1秒，95℃10min，速降至4℃。4)取出上海生工上海合成部合成的核酸适配体aptamer1与aptamer1阴性，离心(12000rpm、5min)，用预配的tm缓冲液配制浓度成20μmol/l。5)将构建的dna四面体中加入等摩尔的核酸适配体aptamer1与aptamer1阴性，震荡混匀，放于pcr仪中构建，构建条件：42℃预热1秒，95℃10min，速降至4℃。6)取出上海生工上海合成部合成的核酸适配体as1411(as1411、as1411
‑
1、as1411
‑
2、as1411
‑
3、as1411阴性)，离心(12000rpm、5min)，用预配的tm缓冲液配制浓度成20μmol/l。7)将预构建的dna四面体
‑
aptamer加入等摩尔上述5种核酸适配体as1411，放于pcr预设条件，分别构建dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411、dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
1、dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
2、dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
3、dna四面体
‑
aptamer1阴性
‑
as1411阴性复合体。
[0078]
1.2.5阿霉素标准曲线
[0079]
1)避光下取出阿霉素储存液，用无菌的pbs缓冲液稀释成不同浓度(10nmol/l、50nmol/l、100nmol/l、500nmol/l、1000nmol/l、5000nmol/l、10000nmol/l)。2)将不同浓度阿霉素溶液加入黑色酶标板，多功能酶标仪(激发波长485nm、发射波长591nm)处测度阿霉素溶液的荧光强度。3)绘制阿霉素的浓度标准曲线。
[0080]
1.2.6 dna四面体阿霉素装载率
[0081]
1)取6条dna单链(s1、s2、s4、s5、s7、s8)pcr仪构建dna四面体。2)避光下取阿霉素工作液(86.24μmol/l)，按照dna四面体：阿霉素溶液摩尔比(1:10、1:20、1:25、1:50、1:100、1:1000、1:10000)进行混合，常温孵育1小时。3)孵育结束，将混合液转移至黑色酶标板，设置pbs缓冲液空白对照组，每组设置3个复孔，多功能酶标仪激发波长485nm、发射波长591nm)处检测混合液荧光强度。4)阿霉素嵌入dna双链后，会发生荧光猝灭，以此原理为指导，通过荧光的猝灭值，来计算dna四面体的装载率。
[0082]
1.2.7复合体结构表征
[0083]
1)pcr仪构建dna四面体、dna四面体
‑
aptamer复合体、dna四面体
‑
aptamer
‑
as1411复合体、dna四面体
‑
aptamer
‑
as1411复合体
‑
阿霉素。2)将预先配置的5％非变性聚丙烯酰胺凝胶与电泳装置安装，加入tbe电泳液(tbe储存液130ml 双蒸水1170ml)1300ml,取出电泳梳，电泳液冲洗电泳加样孔，以免残留凝胶影响。3)将上述样品与dna loading buffer(6
×
)混合，容量比为5:1，单孔加样总量6μl，电泳条件：电压100v、时间90min。4)电泳结束，将非变性聚丙烯酰胺凝胶放入eb稀释液(0.5μg/ml)中染色25min，放入凝胶成像仪中显像记录。
[0084]
1.2.8复合体血清稳定性及对照试验
[0085]
1)将核酸适配体as1411、dna四面体、dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411、dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
1、dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
2、dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
3分别与胎牛血清混合，混合比例(9:1)。混合液移至200μlep管中，放入37℃培养箱。2)按照0小
时、2小时、4小时、6小时、8小时、24小时、48小时时间点分别在培养箱中取样，取样放置于
‑
80℃低温箱暂时保存。3)所有时间点取样完成后，统一进行page凝胶电泳，eb染色后凝胶成像仪显像，考察随时间增长，样品的结构分解情况，并在不同组别间进行横向对比。
[0086]
1.2.9流式细胞仪分析复合体入胞效率
[0087]
1)流式细胞仪检测前24小时预先将对数期增殖，形态良好的细胞消化后，离心重悬、计数。24孔细胞培养板每孔加入1ml dmem高糖完全培养基，每个孔接种相同数量细胞(1
×
105个)，放入co2细胞培养箱培养。2)避光取dna单链b(s1链5’端cy
‑
5修饰)、s2、s4、s5、s7、s8、核酸适配体aptamer及as1411。高速离心机离心(12000rpm、5min)，用预选配制的tm缓冲液将上述dna链及核酸适配体配制成20μmol/l浓度。3)pcr仪构建含有cy
‑
5荧光标记的dna四面体、dna四面体
‑
aptamer复合体、dna四面体
‑
as1411复合体、dna四面体
‑
aptamer复合体
‑
as1411。4)在构建的上述复合体中加入阿霉素工作液，常温避光孵育1小时。5)24孔板内旧培养基吸去丢弃，用pbs缓冲液1ml每个孔洗涤2次。将孵育结束的dna四面体
‑
阿霉素、dna四面体
‑
aptamer
‑
阿霉素复合体、dna四面体
‑
as1411
‑
阿霉素复合体、dna四面体
‑
aptamer
‑
as1411
‑
阿霉素复合体，用dmem高糖培养基定容至200μl，分别加入24孔细胞培养板对应的孔中，送入培养箱避光孵育，孵育时间设置分组：1h组、2h组、3h组。6)孵育时间结束，吸去24孔细胞培养板中复合体药液，用pbs缓冲液洗涤2次，每孔加入0.25％胰酶消化液(a375细胞用含edta胰酶液)200μl，消化细胞后收集到1.5ml ep管中,冷冻离心机离心(
‑
4℃、1200rpm、5min),吸去上清，用pbs缓冲液重悬，重复离心操作一次，再次重悬后避光冰上送流式细胞分析仪分析入胞荧光强度。
[0088]
1.2.10 cck8检测a375细胞增殖实验
[0089]
1)将处于对数增殖期，细胞形态良好的黑色素瘤a375细胞从培养瓶消化离心，dmem高糖完全培养基重悬后，进行细胞计数，用dmem完全培养基将细胞悬液浓度调整至40000个/毫升。2)取96孔细胞培养板，最外侧一圈每孔加入200μl pbs(避免边缘效应，影响试验结果)。其余孔内用多通道移液器加入200μl细胞悬液(浓度：40000个/毫升)，放于co2细胞培养箱中培养24小时。3)取出dna单链(s1、s2、s4、s5、s7、s8)、核酸适配体aptamer、as1411、阿霉素工作液。通过pcr仪构建，加入阿霉素共同孵育后，构建dna四面体
‑
阿霉素、dna四面体
‑
aptamer
‑
阿霉素、dna四面体
‑
as1411
‑
阿霉素、dna四面体
‑
aptamer
‑
as1411
‑
阿霉素等一系列复合体。用dmem完全培养基将上述复合体浓度调整至不同需求(0.1μmol/l、0.3μmol/l、0.5μmol/l、0.75μmol/l、1.0μmol/l)。4)24孔细胞培养板内旧培养基吸去，pbs缓冲液洗涤2次，将上述药物分组加入，每组设置3个复孔。放置培养箱内培养，培养时间(24h组、48h组、72h组)。5)到指定时间后，将96孔细胞培养板内药液吸出，用pbs缓冲液洗涤2次。每孔加入cck
‑
8工作液100μl(90μl dmem培养基 10μl cck
‑
8液)，置于co2细胞培养箱孵育1h。6)多功能酶标仪检测450nm各组吸光度。
[0090]
1.2.12统计学分析
[0091]
用graphpad prism5.01单因素方差分析，数据用均数
±
标准差来表示检验水准α＝0.05，p＜0.05有统计学意义。
[0092]
实施例2实验结果
[0093]
第一部分dna纳米载药复合体的构建
[0094]
1.单靶向和双靶向dna纳米载药复合体的构建
[0095]
1.1 dna四面体的构建
[0096]
本发明中，使用与已报道的文献dna四面体结构类似，虽然本发明在dna四面体中添加了粘性末端的手臂链，但粘性末端的设计以不影响dna四面体空间结构为前提。构建的“dna四面体
‑
aptamer
‑
as1411”空间结构特殊，常用的marker标记不准确。我们通过pcr将dna单链逐条增加，相互验证构建过程中核酸链分子量的增加，page胶精度区分分子量改变来验证构建。从结果中可以看出，通过不断增加构建的dna单链，page胶显示出不断上移的条带，条带单一，分子量表现出明显区别。证明通过文献报道的构建方法，成功构建了dna四面体结构(图1)。
[0097]
1.2 aptamer1和as1411修饰的dna四面体纳米载药复合体的构建
[0098]
本发明将aptamer1、as1411(天然as1411序列)以碱基互补方式结合到dna四面体上，见(图2)，page胶结果显示与dna四面体组相比，随着核酸链数目的增加，分子量明显增大，且条带单一。这些结果表明成功构建了“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411”。
[0099]
本发明将aptamer阴性对照组、as1411阴性对照组以碱基互补方式结合到dna四面体上，见(图3)，page胶结果显示与dna四面体组相比，随着核酸链数目的增加，分子量明显增大，且条带单一。这些结果表明成功构建了“dna四面体
‑
aptamer阴性对照
‑
as1411阴性对照”。
[0100]
本发明将aptamer1、as1411
‑
1(12位和24位2
’‑
脱氧肌苷修饰)以碱基互补方式结合到dna四面体上，见(图4)，page胶结果显示与dna四面体组相比，随着核酸链数目的增加，分子量明显增大，且条带单一。这些结果表明成功构建了“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
1”。
[0101]
1.5 aptamer1和as1411
‑
2修饰的dna四面体纳米载药复合体的构建
[0102]
本发明将aptamer1、as1411
‑
2(13位和24位2
’‑
脱氧肌苷修饰)以碱基互补方式结合到dna四面体上，见(图5)，page胶结果显示与dna四面体组相比，随着核酸链数目的增加，分子量明显增大，且条带单一。这些结果表明成功构建了“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
2”。
[0103]
1.6 aptamer1和as1411
‑
3修饰的dna四面体纳米载药复合体的构建
[0104]
本发明中将aptamer1、as1411
‑
3(15位和24位2
’‑
脱氧肌苷修饰)以碱基互补方式结合到dna四面体上，见(图6)，page胶结果显示与dna四面体组相比，随着核酸链数目的增加，分子量明显增大，且条带单一。这些结果表明成功构建了“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
3”。
[0105]
2.构建装载阿霉素药物分子的dna纳米靶向载药复合体
[0106]
2.1阿霉素(dox)标准曲线
[0107]
制作的阿霉素(dox)标准曲线方程式为：y＝0.6082x 0.4922，r2＝0.9975，表明在预设的浓度范围内，阿霉素(dox)浓度与阿霉素荧光的相关性好。
[0108]
2.2确定dna四面体的阿霉素装载量
[0109]
如图7显示，在1:10、1:20、1:25浓度比时，dna四面体的负载量没有达到饱和状态。后将1:10、1:20、1:25的混合液用超滤管多次短时离心(dna四面体及dna四面体
‑
阿霉素复合体分子量大，留在超滤管上层)，取超滤管下层滤液多功能酶标仪测荧光值，与空白组统计学分析无差别。再次确定在1:25孵育浓度中，dna四面体的阿霉素负载量没有达到饱和，
使用此孵育浓度，可以避免游离阿霉素对后续实验干扰。
[0110]
,2.3装载阿霉素药物分子的dna纳米载药复合体的构建
[0111]
2.3.1“dna四面体
‑
阿霉素
‑
aptamer1
‑
as1411”的构建
[0112]
结果见图8，“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
阿霉素”组与“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411”相比，分子量明显增大。与其他组对比验证，表明已经成功构建了dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
阿霉素、dna四面体
‑
阿霉素、单靶向dna四面体
‑
阿霉素。
[0113]
2.3.2“dna四面体
‑
阿霉素
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
1”的构建
[0114]
结果见图9，“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑1‑
阿霉素”组与“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
1”相比，分子量明显增大。与其他组对比验证，表明已经成功构建了dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑1‑
阿霉素。
[0115]
2.3.3“dna四面体
‑
阿霉素
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
2”的构建
[0116]
结果见图10，“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑2‑
阿霉素”组与“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
2”相比，分子量明显增大。与其他组对比验证，表明已经成功构建了dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑2‑
阿霉素。
[0117]
2.3.4“dna四面体
‑
阿霉素
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
3”的构建
[0118]
结果见图11，“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑3‑
阿霉素”组与“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
3”相比，分子量明显增大。与其他组对比验证，表明已经成功构建了dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑3‑
阿霉素。
[0119]
2.3.5“dna四面体
‑
阿霉素
‑
aptamer1阴性对照
‑
as1411阴性对照”的构建
[0120]
结果见图12，“dna四面体
‑
aptamer阴性对照
‑
as1411阴性对照
‑
阿霉素”组与“dna四面体
‑
阿霉素”、“dna四面体
‑
aptamer1
‑
阿霉素”、“dna四面体
‑
as1411
‑
阿霉素”相比，分子量明显增大。与其他组对比验证，表明已经成功构建了dna四面体
‑
aptamer阴性对照
‑
as1411阴性对照
‑
阿霉素。
[0121]
第二部分双靶向载药复合体在黑色素瘤靶向治疗中的应用
[0122]
1.血清稳定性评估
[0123]
由dna单链和核酸适配体为原料构建的“dna四面体
‑
aptamer
‑
as1411
‑
阿霉素”载药复合体，能进入机体发挥良好的靶向治疗作用，前提必须有良好的耐核酸酶降解能力。我们在体外环境中将“dna四面体
‑
aptamer
‑
as1411
‑
阿霉素”系列载药复合体、dna四面体、核酸适配体aptamer1置于(10％胎牛血清、37℃)条件孵育，不同时间点取样page凝胶验证稳定性。结果见图13，核酸适配体aptamer1可以稳定存在2h，dna四面体则稳定的存在8h，“dna四面体
‑
aptamer
‑
as1411
‑
阿霉素”系列载药复合体更是在24h时还保持出良好的稳定性。表明本研究构建的四种“dna四面体
‑
aptamer
‑
as1411
‑
阿霉素”复合体的耐核酸酶的能力相比于单独as1411和四面体结构得到明显增强，为后续实验做好了比较理想的基础。
[0124]
2流式细胞仪分析复合体入胞效率
[0125]
本发明计将s1链5’用cy
‑
5荧光进行修饰，这样构建的dna四面体及以dna四面体为基础的一系列复合体都可以用cy
‑
5荧光来进行追踪，我们通过流式细胞仪来进行判断荧光强度的区别，体外验证双靶向载药复合体的靶向性及与单靶向相比的药物摄取量区别。初始验证上，我们的实验条件设置：复合体与a375细胞孵育时间为2h、复合体孵育浓度0.5μm。初步验证了双靶向药物载体复合物的靶向后，我们针对实验条件进行了一系列改变：孵育
时间由2h增加到(1/2/3h)三个时间点，复合体浓度由0.5μm增加到(0.1μm、0.5μm、0.75μm、1.0μm)四个浓度梯度。
[0126]
2.1流式细胞仪分析“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411”入胞效率及靶向性
[0127]
2.1.1流式细胞仪分析“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411”a375细胞入胞效率
[0128]
本发明先通过流式细胞仪分析“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411”(不添加阿霉素)在体外a375细胞的入胞效率，对比双靶向与单靶向及空白组的荧光量差别，初步判断双靶向的靶向作用，并与单靶向四面体相比，判断双靶向的优势。
[0129]
在0.5μm药物浓度、孵育2小时条件下，“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411”相比dna四面体a375细胞内荧光量明显增加，提高了约3倍左右；与单靶向四面体组相比，荧光量也得到较大的提升，结果见图14。
[0130]
在0.75μm药物浓度、孵育2小时条件下，“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411”相比dna四面体a375细胞内荧光量明显增加，提高了约3.5倍左右；与单靶向四面体组相比，荧光量也得到较大的提升，同0.5μm浓度组相比，入胞荧光量进一步增加。结果见(图15)。
[0131]
在0.5μm药物浓度、孵育2小时条件下，“dna四面体
‑
aptamer阴性
‑
as1411阴性”相比dna四面体，a375细胞内荧光量没有表现出增高的趋势，双阴性靶向复合体的a375细胞的荧光量低于dna四面体组，检测结果表明，“dna四面体
‑
aptamer阴性
‑
as1411阴性”没有表现出靶向作用，并因为分子量增大，入胞效率反而低于分子量相对较小的dna四面体组，也初步验证了双阴性对照靶向分子设计的有效性，结果见图16。
[0132]
2.2流式细胞仪分析四种“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
阿霉素”入胞效率
[0133]
2.2.1阿霉素药物对cy
‑
5荧光影响
[0134]
为了判断本研究中阿霉素是否对流式细胞仪检测cy
‑
5荧光值有影响，我们将空白组、阿霉素组、带cy
‑
5荧光的dna四面体
‑
阿霉素组与a375细胞孵育(浓度0.5μm、时间2h)。孵育结束消化离心重悬细胞后送流式细胞仪分析荧光。结果表明单独阿霉素组的cy
‑
5荧光值与空白组对照无区别，与dna四面体
‑
阿霉素组区别较大，排除了阿霉素对流式细胞仪cy
‑
5分析中荧光强度的影响，后续实验流式细胞仪检测的cy
‑
5荧光强度值来自与四面体中携带的cy
‑
5荧光分子。
[0135]
2.2.2“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
阿霉素”入胞效率
[0136]
为了验证“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
阿霉素”的靶向性，我们在体外a375细胞水平进行了载药体系的摄取实验。我们将cy
‑
5荧光分子标记在dna四面体上，在此基础上构建多种载药体系。采取多种药物浓度与a375细胞共孵育2h/3h，流式细胞仪检测细胞内荧光值。结果见图17，表明双靶向的“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
阿霉素”组与单靶向的“dna四面体
‑
aptamer1
‑
阿霉素”、“dna四面体
‑
as1411
‑
阿霉素”组及“dna四面体
‑
阿霉素”组相比，荧光量显著增加。并且随着药物浓度的不断提高，表现出了一定的药物浓度依赖性。孵育时间(0.5μm浓度、3h)相比(0.5μm浓度、2h)，细胞内荧光量也得到了显著的提高。
[0137]
2.2.3“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑1‑
阿霉素”入胞效率
[0138]
结果见图18，表明双靶向的“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑1‑
阿霉素”组与单靶向的“dna四面体
‑
aptamer1
‑
阿霉素”、“dna四面体
‑
as1411
‑1‑
阿霉素”组及“dna四面体
‑
阿霉素”组相比，荧光量显著增加。并且随着药物浓度的不断提高，表现出了一定的药物浓度依赖性。孵育时间(0.5μm浓度、3h)相比(0.5μm浓度、2h)，细胞内荧光量也得到了显著的提高。
[0139]
2.2.4“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑2‑
阿霉素”入胞效率
[0140]
结果见图19，表明双靶向的“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑2‑
阿霉素”组与单靶向的“dna四面体
‑
aptamer1
‑
阿霉素”、“dna四面体
‑
as1411
‑2‑
阿霉素”组及“dna四面体
‑
阿霉素”组相比，荧光量显著增加。并且随着药物浓度的不断提高，表现出了一定的药物浓度依赖性。孵育时间(0.5μm浓度、3h)相比(0.5μm浓度、2h)，细胞内荧光量也得到了显著的提高。
[0141]
2.2.5“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑3‑
阿霉素”入胞效率
[0142]
结果见图20，表明双靶向的“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑3‑
阿霉素”组与单靶向的“dna四面体
‑
aptamer1
‑
阿霉素”、“dna四面体
‑
as1411
‑3‑
阿霉素”组及“dna四面体
‑
阿霉素”组相比，荧光量显著增加。并且随着药物浓度的不断提高，表现出了一定的药物浓度依赖性。孵育时间(0.5μm浓度、3h)相比(0.5μm浓度、2h)，细胞内荧光量也得到了显著的提高。
[0143]
2.2.6“dna四面体
‑
aptamer阴性对照
‑
as1411阴性对照
‑
阿霉素”入胞效率
[0144]
结果见图21，在0.1μm、0.5μm、1.0μm浓度中，“dna四面体
‑
aptamer阴性对照
‑
as1411阴性对照
‑
阿霉素”组与“dna四面体
‑
aptamer阴性对照
‑
阿霉素”、“dna四面体
‑
as1411阴性对照
‑
阿霉素”组相比，荧光量无统计学差异。
[0145]
2.2.7四种双靶向载药复合体及双阴性靶向载药复合体入胞效率分析
[0146]
结果见图22，表明四种双靶向“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
阿霉素”载药复合体与“dna四面体
‑
aptamer阴性
‑
as1411阴性
‑
阿霉素”组、“dna四面体
‑
阿霉素”组相比，在体外水平进入a375细胞的荧光量明显增加。“dna四面体
‑
apt amer阴性
‑
as1411阴性
‑
阿霉素”组与“dna四面体
‑
阿霉素”组相比，在多种药物浓度及时间组别间，没有表现出明显的统计学差别。在四种双靶向“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑
阿霉素”载药复合体之中，“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑1‑
阿霉素”组进入a375细胞的荧光量更高，显示出更好的靶向性。
[0147]
本研究通过cck8方法评估了单靶向和四种双靶向dna纳米载药复合体对黑色素瘤a375细胞增殖效果的影响，并与空白对照组、阿霉素组、dna四面体
‑
阿霉素组、单靶向载药复合体组做横向对比。在(24h、48h、72h)时间点、(0.1μm、0.3μm、0.5μm、0.75μm、1.0μm)药物浓度组做纵向对比。
[0148]
2.3.1 cck8检测24小时a375细胞增殖
[0149]
本研究中将a375细胞与多种药物组处理24小时后，cck
‑
8检测结果见图23。在同等剂量下，四种双靶向dna纳米载药复合体对肿瘤细胞的抑制作用最明显，在浓度为1.0μm时，抑制作用最强，具有一定的剂量依赖性。与单靶向的dna纳米载药复合体相比，四种双靶向dna纳米载药复合体表现出更强的a375细胞抑制作用。24小时体外细胞水平细胞增殖实验结果，表明了四种双靶向dna纳米载药复合体更好的将药物聚集至肿瘤细胞的能力。
[0150]
2.3.2 cck8检测48小时细胞增殖
[0151]
本发明将a375细胞与多种药物组处理48小时后，cck
‑
8检测结果见图24。在同等剂量下，四种双靶向dna纳米载药复合体对肿瘤细胞的抑制作用最明显，在浓度为1.0μm时，抑制作用最强，具有一定的剂量依赖性。与单靶向的dna纳米载药复合体相比，四种双靶向dna纳米载药复合体表现出更强的a375细胞抑制作用。48小时体外细胞水平细胞增殖实验结果，表明了四种双靶向dna纳米载药复合体更好的将药物聚集至肿瘤细胞的能力。
[0152]
2.3.3 cck8检测72小时细胞增殖
[0153]
本发明将a375细胞与多种药物组处理72小时后，cck
‑
8检测结果见图25。在同等剂
量下，四种双靶向dna纳米载药复合体对肿瘤细胞的抑制作用最明显，在浓度为1.0μm时，抑制作用最强，具有一定的剂量依赖性。与单靶向的dna纳米载药复合体相比，四种双靶向dna纳米载药复合体表现出更强的a375细胞抑制作用。在1.0μm浓度组、72h中，四种双靶向dna纳米载药复合体组与阿霉素组抑制率都已接近100％。
[0154]
2.3.4 cck8检测双阴性对照dna纳米载药复合体对a375细胞增殖影响
[0155]
图26结果表明，dna四面体
‑
aptamer阴性
‑
as1411阴性
‑
阿霉素在五个浓度、三个时间上对a375细胞的抑制作用明显低于单独阿霉素组，也低于单靶向dna纳米载药复合体组。添加阴性单靶向的dna四面体
‑
阿霉素，肿瘤抑制效果也低于单靶向载药复合体组及阿霉素组。结果表明：设置了阴性靶向分子的载药复合体组失去靶向能力，大大降低了将阿霉素聚集在a375细胞的能力。
[0156]
2.3.5横向对比四种dna纳米载药复合体对a375细胞增殖影响
[0157]
图27结果表明，四种双靶向dna纳米载药复合体与双阴性靶向dna纳米载药复合体对比，表现出更强的a375细胞抑制作用，并表现出一定的浓度依赖性及时间依赖性。在四种双靶向dna纳米载药复合体中，由as1411
‑
1(12位和24位2
’‑
脱氧肌苷修饰)参与的“dna四面体
‑
aptamer1
‑
as1411
‑1‑
阿霉素”与其他三种双靶向dna纳米载药复合体相比，抑制a375细胞增殖作用更强，这与流式细胞仪检测的入胞效率结果相符。