一种样本保存液及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种既能保存病毒样品又能直接用于核酸扩增的样本保存液，涉及分子生物学技术领域。


背景技术：

2.病毒(biological virus)是一种个体微小，结构非常简单的非细胞生命形态，由一个核酸长链和蛋白质外壳构成，只含一种核酸(dna或rna)，必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物，不能独立生存，一旦离开了宿主细胞，就成了没有任何生命活动、也不能独立自我繁殖的化学物质。
3.病毒核酸的检测，有助于人类疾病的早期诊断、疑难样本的辅助诊断、耐药性监测、病程监控及预测、指导抗病毒治疗及疗效判定等重要领域。核酸检测主要包括pcr和基因测序两种检测方式，核酸结构的完整性在高效准确的诊断过程中起到了重要作用。因此，如何保存完整的病毒核酸对下游的基因分析具有非常重要的意义。
4.病毒核酸很容易降解，尤其是rna病毒，很容易被广泛存在的内源性或者外源性rna酶降解。而rna酶性质稳定，即使高温高压处理也无法使其失活，所以病毒核酸需要严格的储存条件。
5.现有的常规的病毒保存方法：(1)
‑
80℃超低温保存；(2)utm/mtm常规病毒保存液。
‑
80℃超低温保存，对环境设备的要求很高，如实验室没有超低温冰箱，就无法保存，而且病毒离开超低温环境也不便运输。utm常规病毒保存液保存病毒，无法对病毒进行灭活，活病毒可能会危及医务及操作人员的安全。mtm灭活型病毒保存液，可以安全地灭活病原样本，同时保存和稳定释放的dna和rna，但不能直接用于扩增检测，需进行核酸抽提。


技术实现要素：

6.本发明的目的就是提供一种既可以安全灭活病毒、保存病毒，又可以直接用于核酸扩增而无需进行核酸抽提的样本保存液。
7.本发明的另一个目的在于提供上述样本保存液的制备方法及其应用。
8.本发明提供了一种样本保存液，所述样本保存液包括：终浓度为10
‑
100mmol/l的缓冲化合物，体积百分比为5％
‑
30％的醇，体积百分比为0.01％
‑
2％的表面活性剂和终浓度为0.1
‑
1mmol/l的螯合剂。
9.进一步的，所述样本保存液包括：终浓度为20
‑
50mmol/l的缓冲化合物、体积百分比为15％
‑
30％的醇、体积百分比为0.05
‑
2％的表面活性剂和终浓度为0.1
‑
0.5mmol/l的螯合剂；
10.优选地，所述样本保存液包括：终浓度为20mmol/l的缓冲化合物、体积百分比为15％的醇、体积百分比为0.5％的表面活性剂和终浓度为0.1mmol/l的螯合剂。
11.进一步的，所述缓冲化合物包括磷酸盐缓冲液或hepes缓冲液。
12.进一步的，所述醇包括甲醇、乙醇或丙醇中的一种或多种。
13.进一步的，所述表面活性剂包括离子型表面活性剂或非离子型表面活性剂；
14.可选地，所述离子型表面活性剂包括十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂或月桂酰基肌氨酸钠中的一种或多种；
15.可选地，所述非离子型表面活性剂包括4
‑
壬基苯基
‑
聚乙二醇、乙基苯基聚乙二醇、聚乙二醇辛基苯基醚、吐温或山梨醇酐单月桂酸酯聚氧乙烯(20)醚中的一种或多种。
16.优选地，所述去污剂为浓度0.5％的聚乙二醇辛基苯基醚(triton x
‑
100)。
17.进一步的，所述螯合剂包括edta
·
2na、氨基三乙酸或8
‑
羟基喹啉中的一种或多种。
18.进一步的，所述病毒样本保存液的ph为6.5
‑
8。
19.本发明还提供了上述的病毒样本保存液的制备方法，其包括：将磷酸盐缓冲液、表面活性剂、甲醇、乙醇及溶剂均匀混合，并调节ph值至6.5
‑
8，即获得所述样本保存液。
20.另外，本发明还提供了上述的样本保存液在保存病毒样本中的应用。其包括：将待保存的病毒dna或rna样本置于上述的样本保存液中，混匀，保存。
21.综上，本发明提供的样本保存液的配方能够在快速裂解病毒释放dna或rna的同时，稳定dna/rna结构，对其形成保护，在高温放置15天后仍然能够保持dna/rna的完整性。本配方组合能够直接用于pcr或rt
‑
pcr扩增，各组分不会对扩增过程产生抑制，免除了dna/rna的抽提过程，使得病毒的检测步骤更简单，时间更短。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
23.1)本发明的样本保存液可以直接裂解样本，并对病毒进行快速灭活，减少运输人员及实验人员的感染危险，具有安全简捷、性能稳定等特点；
24.2)本发明的样本保存液中的配方成分不会对pcr或rt
‑
pcr检测过程产生抑制，所得样本可以直接用于pcr或rt
‑
pcr核酸检测，无需对样本dna或rna进行纯化，使得检测步骤更简便，并节省检测时间；
25.3)本发明的样本保存液在高温环境下(37℃)能很好的保持dna或rna结构完整性长达15天，降低了对样本的保存和运输条件的苛刻要求。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明具体实施例或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些具体实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1为本发明实施例2提供的实验对照组1的荧光显微镜下结果图，a、阳性对照组：慢病毒液与pbs 1:1稀释；b、阳性对照组：慢病毒液与pbs 1:2稀释；c、阳性对照组：慢病毒液与pbs 1:4稀释。如图1所示，pbs稀释后的慢病毒感染293t细胞，培养5天后，293t细胞产生明显的绿色荧光。说明慢病毒对293t细胞具有较强的感染能力。
28.图2为本发明实施例2提供的实验对照组2的荧光显微镜下结果图，a、阴性对照组：pbs与保存液y1:1稀释；b、阴性对照组：pbs与保存液y1:5稀释；c、阴性对照组：pbs与保存液y1:9稀释。以pbs代替慢病毒，检测保存液对293t细胞正常培养的影响。结果如图2所示，保存液y对293t细胞不产生影响，细胞形态与生长速度均正常(图2a、b、c)。
29.图3为本发明实施例2提供的实验组1的荧光显微镜下结果图，a、保存液y以1:1比例预处理慢病毒5min；b、保存液y以1:1比例预处理慢病毒30min；c、保存液y以1:1比例预处理慢病毒60min。慢病毒液与保存液y1:1混匀，室温下放置5min，30min及60min后，再对293t细胞进行感染。细胞培养5天后，在荧光显微镜下观察。如图3所示，病毒预处理5min，可观察到部分293t细胞产绿色荧光(图3a)，病毒未被彻底灭活，仍具有感染能力。病毒预处理30min，细胞未观察到绿色荧光(图3b)。说明病毒已失去活性，无感染能力。病毒预处理60min，细胞未观察到绿色荧光(图3c)。说明病毒已失去活性，无感染能力。
30.图4为本发明实施例2提供的实验组2的荧光显微镜下结果图，a、保存液y以1:2比例预处理慢病毒5min；b、保存液y以1:2比例预处理慢病毒30min；c、保存液y以1:2比例预处理慢病毒60min。如图4所示，慢病毒液与保存液1:2混匀，室温下放置5min，30min及60min后，再对293t细胞进行感染，细胞培养5天后，均未观察到绿色荧光。说明病毒均已失去活性，无感染能力。
31.图5为本发明实施例2提供的实验组3的荧光显微镜下结果图，a、保存液y以1:4比例预处理慢病毒5min；b保存液y以1:4比例预处理慢病毒30min；c、保存液y以1:9比例预处理慢病毒60min。如图5所示，慢病毒液与保存液1:4混匀，室温下放置5min，30min及60min后，再对293t细胞进行感染，细胞培养5天后，均未观察到绿色荧光。说明病毒已失去活性，无感染能力。
32.图6本发明实施例1配制保存液y与商品化样本保存液l的dna病毒保存效果比较。其中虚线为商品化保存液l室温放置不同时间保存dna病毒检测效果，实线为本发明实施例1配制保存液y室温放置不同时间保存dna病毒检测效果。
33.图7本发明实施例1配制保存液y与商品化样本保存液l在37℃(即a图)及常温条件下(即b图)的rna病毒保存效果比较。其中虚线为商品化保存液l 37℃及常温放置不同时间保存rna病毒检测效果，实线为本发明实施例1配制保存液y37℃及常温放置不同时间保存rna病毒检测效果
具体实施方式
34.下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.根据本发明的一个方面，提供了一种样本保存液，所述样本保存液包括：终浓度为10
‑
100mmol/l的缓冲化合物，体积百分比为5％
‑
30％的醇，体积百分比为0.01％
‑
2％的表面活性剂和终浓度为0.1
‑
1mmol/l的螯合剂。
36.其中，缓冲化合物能够维持样本保存液ph的稳定性。优选缓冲化合物可以包括磷酸盐缓冲液或hepes缓冲液，当选用上述缓冲化合物时，能够使ph值稳定在5.5
‑
6.5的弱酸性环境，保证样本保存液处于最佳性能。
37.螯合剂可有效抑制dnase/rnase活性。螯合剂的终浓度为0.1
‑
0.5mmol/l。上述浓度下的螯合剂可高效螯合金属离子，对抑制dnase/rnase活性具有一定辅助作用。优选螯合剂包括edta
·
2na、氨基三乙酸或8
‑
羟基喹啉中的一种或多种。
38.表面活性剂和醇均能够灭活病毒，使病毒灭活，且表面活性剂可裂解细胞。
39.通过上述特定浓度的特定组分相互配合，使得本发明提供的样本保存液具有安全、稳定、高效的优点，可以在5分钟内将病毒快速灭活，并可稳定保存病毒样本核酸，在保存病毒样本的基础上提高样本的安全性。并且，应用本发明提供的样本保存液常温环境即可实现对病毒样本的保存，经验证，本发明提供的病毒样本保存液在室温条件下保存时间为15天以上。因此，除实验室常规保存外，本发明提供的样本保存液也能够适用于临床及野外环境采集及运输病毒样本，普适性广。
40.下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明。但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为或用于以任何形式限制本发明。
41.实施例1：一种样本保存液的配制
42.本实施例提供了一种样本保存液y，包括终浓度为20mmol/l的磷酸盐缓冲液、体积百分比为15％的甲醇、体积百分比为25％的乙醇、质量体积百分比为0.5％的triton x
‑
100和终浓度为0.1mmol/l的edta
·
2na，ph值为6.5。
43.实施例2：样本保存液灭活性验证
44.1、仪器、试剂、样本
45.1)主要仪器：离心机，荧光倒置显微镜，超净工作台，二氧化碳培养箱。
46.2)主要试剂：双抗溶液(青霉素
‑
链霉素)，1
×
pbs缓冲液，胰蛋白酶，dmem高糖培养基，pbs，gene
‑
gfp融合慢病毒(滴度为5
×
108/ml)、本发明配制样本保存液y。
47.3)细胞系：293t人胚肾细胞
48.2、实验方案：
49.1)收集293t人胚肾细胞，分别种植于96孔板中，细胞数为5
×
104个细胞/孔，每孔100μl。37℃，5％co2培养箱中静置培养过夜。次日，小心吸去完全培养基，加入新鲜培养基，按照下表加入各组处理后的病毒液，每孔最终体积为100μl。
[0050][0051]
37℃，5％co2培养箱中静置培养8h后，观察细胞状态并更换为完全培养基。感染后每天在荧光显微镜下观察细胞状态并更换新鲜培养基，5天后停止观察。
[0052]
3、实验结果：
[0053]
如图1所示，pbs稀释后的慢病毒感染293t细胞，培养5天后，293t细胞产生明显的绿色荧光。说明慢病毒对293t细胞具有较强的感染能力。
[0054]
以pbs代替慢病毒，检测保存液对293t细胞正常培养的影响。结果如图2所示，保存液y对293t细胞不产生影响，细胞形态与生长速度均正常(图2a、b、c)。
[0055]
慢病毒液与保存液y1:1混匀，室温下放置5min，30min及60min后，再对293t细胞进行感染。细胞培养5天后，在荧光显微镜下观察。如图3所示，病毒预处理5min，可观察到部分293t细胞产绿色荧光(图3a)，病毒未被彻底灭活，仍具有感染能力。病毒预处理30min，细胞未观察到绿色荧光(图3b)。说明病毒已失去活性，无感染能力。病毒预处理60min，细胞未观察到绿色荧光(图3c)。说明病毒已失去活性，无感染能力。
[0056]
如图4所示，慢病毒液与保存液1:2混匀，室温下放置5min，30min及60min后，再对293t细胞进行感染，细胞培养5天后，均未观察到绿色荧光。说明病毒均已失去活性，无感染能力。
[0057]
如图5所示，慢病毒液与保存液1:4混匀，室温下放置5min，30min及60min后，再对293t细胞进行感染，细胞培养5天后，均未观察到绿色荧光。说明病毒已失去活性，无感染能力。
[0058]
4、实验结论：
[0059]
本发明配制的样本保存液y与慢病毒液2:1或4:1混合，室温放置5min即可使病毒失去活性。说明本发明配制的样本保存液在保存临床口咽拭子病原标本的时候，在室温放置5min左右即可使病毒失去活性。
[0060]
实施例3：样本保存液在dna病毒核酸保存中的应用
[0061]
本实施例中，以腺病毒标准品作为模型，检测本发明实施例1的样本保存液y对dna病毒样本核酸的保存效果，并对保存的样本进行pcr核酸检测。
[0062]
1、仪器、试剂、样本
[0063]
1)主要仪器：bsc
‑
1300
‑
iia2生物安全柜；miulab minute离心机；beckman microfuge18台式高速离心机；roche lightcycler480荧光定量pcr仪；sw
‑
cj
‑
1fd单人用超净工作台。
[0064]
2)主要试剂：引物探针对；pcr反应检测试剂盒。
[0065]
3)样本：腺病毒标准品
[0066]
2、实验方案：
[0067]
1)采用上述实施例1中的样本保存液y，按体积比1:2保存腺病毒，使终浓度为103copies/ul，于37℃放置，分别在放置1天、3天、5天、7天、15天时各取出10μl，立即放置
‑
20℃，之后一起进行pcr检测，并以提取好的103copies/ul的腺病毒dna做对照。
[0068]
2)在荧光定量pcr仪上对样本进行pcr扩增反应。
[0069]
反应体系如下：
[0070][0071]
反应程序如下：
[0072][0073]
3)实验结果：
[0074]
记录ct值，并绘制曲线图。如图6所示。
[0075][0076]
实施例4：样本保存液在rna病毒核酸保存中的应用
[0077]
本实施例中，以新型冠状病毒(2019
‑
ncov)假病毒作为模型，检测本发明实施例1的样本保存液y对rna病毒样本核酸的保存效果，并对保存的样本进行rt
‑
pcr核酸检测。并以某商品化样本保存液l的测试效果作为实验对照。
[0078]
1、仪器、试剂、样本
[0079]
1)主要仪器：bsc
‑
1300
‑
iia2生物安全柜；miulab minute离心机；beckman microfuge18台式高速离心机；roche lightcycler480荧光定量pcr仪；sw
‑
cj
‑
1fd单人用超净工作台。
[0080]
2)主要试剂：orf1ab引物探针对；n基因引物探针对；一步法rt
‑
pcr反应检测试剂盒。
[0081]
3)样本：新型冠状病毒(2019
‑
ncov)假病毒
[0082]
2、实验方案：
[0083]
1)采用上述实施例1中的样本保存液y，按体积比2:1保存新型冠状病毒(2019
‑
ncov)假病毒，使终浓度为104copies/ul，于37℃放置，分别在放置1天、3天、5天、7天、15天时各取出10μl，立即放置
‑
20℃，之后一起进行rt
‑
pcr检测，并以提取好的104copies/ul的新型冠状病毒(2019
‑
ncov)假病毒rna做对照。
[0084]
2)在荧光定量pcr仪上对样本进行rt
‑
pcr扩增反应。
[0085]
反应体系如下：
[0086][0087]
反应程序如下：
[0088][0089]
4)实验结果：
[0090]
记录ct值，并绘制曲线图。如图7所示，其中a图为37℃保存条件如下表：
[0091][0092]
b图为常温保存条件如下表：
[0093][0094][0095]
结论：综合以上结果我们可以得出，本发明提供的样本保存液可快速灭活病毒
dna/rna活性，并能保持dna/rna结构的稳定，并可直接用于下游pcr/rt
‑
pcr核酸检测，且检测灵敏度好。此外，与现有技术相比，本发明提供的样本保存液效果很好，在37℃至少可以保存15天以上，且均能有效检出病毒dna和rna核酸，可以有效地进行病毒样本的保存和运输，能更好地应用于大量dna/rna病毒样本的快速筛查检测中，为疫情的防控防治提供有力的物质支撑。