用于肿瘤细胞团簇分选的微流控芯片的制作方法

1.本技术涉及细胞团簇的分选器件，尤其涉及一种用于肿瘤细胞团簇分选的微流控芯片。


背景技术：

2.肿瘤转移是肿瘤患者死亡的主要原因，早期诊断和治疗对于提升肿瘤病人生存率具有至关重要的意义。肿瘤发生转移的步骤包括：肿瘤细胞从肿瘤病灶脱离、进入血液循环、侵犯远处器官，形成转移灶。循环肿瘤细胞(ctcs)是指从实体恶性肿瘤原发灶或转移灶释放进入外周血液循环的肿瘤细胞，在肿瘤转移过程中起着重要作用。部分肿瘤患者外周血中还存在团簇形式的循环肿瘤细胞(ctc clusters)，是由2个及2个以上的循环肿瘤细胞聚集形成，与单个肿瘤细胞相比，肿瘤细胞团簇具有更强的转移能力。相较于目前临床上传统肿瘤标志物检测和肿瘤的影像学检查，肿瘤细胞簇的检测能较早提示肿瘤的复发与转移。应用检测循环肿瘤细胞簇的结果进行分析，对推测每个独立患者具体预后、评估治疗反应的准确性和有效性都可以有明显改善。
3.基于微流控技术进行生物粒子操控具有灵敏度高、便携性好、可集成化等优势，根据操控力的来源分类，微流控技术可分为主动式和被动式。主动式主要利用外力场如电场、磁场及声场来实现生物粒子的操控；被动式操控则完全利用微管道自身的几何形状和内在自发的流体动力来进行操控，如捏流分离、确定性侧向位移及惯性微流控等。主动式操控技术具有分选精度高和实时可控的特点，但也存在样本处理量低、外加复杂物理场等缺点；而被动式一般结构简单、性能可靠，且处理通量较高，因此在集成化和商业化方面更具前景。
4.其中，惯性微流控技术利用流体惯性效应诱导细胞在流道中受惯性力作用迁移实现精确操控，具有流道结构简单、操作方便等优势，受到国内外学者广泛关注。然而惯性微流控技术对细胞的形状结构和尺寸大小较敏感，在针对团簇细胞和异形细胞分选时容易受流体扰动脱离预设聚焦位置。目前常见的用于细胞分离的螺旋形惯性微流控芯片虽然能达到一定的分离目的，但是其分离精度较主动式较低。


技术实现要素：

5.本技术提供了一种用于肿瘤细胞团簇分选的微流控芯片，其技术目的是使得微流控芯片的操控精度高、通量高，能够满足不同尺寸的细胞团簇或其他微纳米生物粒子的高效分离应用。
6.本技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
7.一种用于肿瘤细胞团簇分选的微流控芯片，包括上盖板、流道层和下盖板，所述流道层包括进样口、螺旋和突扩耦合流道、收集口和废液口，所述螺旋和突扩耦合流道呈螺旋型；
8.所述进样口设在所述螺旋和突扩耦合流道的始端，并通过导管与外界相连通；
9.所述螺旋和突扩耦合流道上设有螺旋主流道，所述螺旋主流道上均匀分布着矩形
突扩流道，所述螺旋主流道的末端依次设有梯形突扩流道和y形出口流道；
10.所述梯形突扩流道包括互相连接的第一梯形突扩流道和第二梯形突扩流道；所述第一梯形突扩流道的一端与所述螺旋主流道连接、另一端与所述第二梯形突扩流道连接；所述第二梯形突扩流道的一端与所述第一梯形突扩流道连接、另一端与所述y形出口流道连接；所述y形出口流道的一端连接所述收集口、另一端连接所述废液口；
11.所述螺旋主流道的横截面呈梯形，且所述螺旋主流道的内壁面的高度低于外壁面的高度；所述矩形突扩流道沿所述螺旋主流道的外壁面突扩分布。
12.本技术的有益效果在于：
13.(1)本技术提出的微流控芯片，用于肿瘤细胞团簇的高精度分选，突破了传统螺旋芯片的通用结构模型，设计了一种新型流道结构的螺旋流道芯片。
14.(2)螺旋主流道的设计为梯形横截面，其相比矩形流道结构，产生了垂直于截面主流动方向的非对称二次流旋涡。细胞在惯性升力和二次流迪恩拽力影响下逐渐产生惯性聚焦效果并横向迁移至不同的平衡位置，具体表现为小尺寸单体细胞受强二次流主导作用被诱捕至靠近流道外壁面的强涡流处，而大尺寸团簇细胞受强惯性升力主导作用聚焦于流道内壁面处，可以实现尺寸差异的单体细胞与团簇细胞的分离。
15.(3)沿流道外侧壁处引入了周期分布的矩形突扩流道，当细胞运动经过矩形突扩流道时，大尺寸团簇细胞受惯性升力主导作用迅速聚焦至流道内壁面处，而小尺寸单体细胞受局部迪恩流拖拽力主导作用绕过矩形突扩向外壁面迁移，从而使大尺寸团簇细胞与小尺寸单体细胞的平衡位置间距进一步增大。
16.(4)梯形突扩流道的设计进一步拉大了细胞平衡位置之间的距离，实现精确分选。
17.综上，本技术的芯片操控精度高、通量高、且制作简单，可以满足不同尺寸的细胞及其团簇或其他微纳米生物粒子的高效分离应用。
附图说明
18.图1为本技术所述微流控芯片的结构示意图；
19.图2为螺旋主流道的结构示意图；
20.图3为螺旋主流道在a
‑
a处和b
‑
b处的截面形状图；
21.图4为粒子在螺旋主流道上的聚焦示意图；
22.图5为粒子在矩形突扩流道上的聚焦示意图；
23.图6为粒子在梯形突扩流道上的聚焦示意图；
24.图7为y形出口流道处分选单体细胞和团簇细胞的明场叠加聚焦图；
25.图中：1
‑
进样口；2
‑
螺旋和突扩耦合流道；3
‑
收集口；4
‑
废液口；21
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螺旋主流道；22
‑
矩形突扩流道；23
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梯形突扩流道；24
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y形出口流道；211
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内壁面；212
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外壁面；231
‑
第一梯形突扩流道；232
‑
第二梯形突扩流道。
具体实施方式
26.下面将结合附图对本公开技术方案进行详细说明。
27.图1为本技术所述的微流控芯片的结构示意图，如图1所示，该微流控芯片包括上盖板、流道层和下盖板，作为具体实施例地，上盖板为pet薄膜，流道层由硅胶制成，下盖板
为pvc盖板。
28.流道层的结构如图2所示，流道层包括进样口1、螺旋和突扩耦合流道2、收集口3和废液口4，所述螺旋和突扩耦合流道2呈螺旋型。
29.所述进样口1设在所述螺旋和突扩耦合流道2的始端，并通过导管与外界相连通。
30.所述螺旋和突扩耦合流道2上设有螺旋主流道21，所述螺旋主流道21上均匀分布着矩形突扩流道22，所述螺旋主流道21的末端依次设有梯形突扩流道23和y形出口流道24。
31.梯形突扩流道23包括互相连接的第一梯形突扩流道231和第二梯形突扩流道232；所述第一梯形突扩流道231的一端与所述螺旋主流道21连接、另一端与所述第二梯形突扩流道232连接；所述第二梯形突扩流道232的一端与所述第一梯形突扩流道231连接、另一端与所述y形出口流道24连接；所述y形出口流道24的一端连接所述收集口3、另一端连接所述废液口4。
32.所述螺旋主流道21的横截面呈梯形，且所述螺旋主流道21的内壁面211的高度低于外壁面212的高度，如图3中(a)所示。所述矩形突扩流道22沿所述螺旋主流道21的外壁面212突扩分布，如图3中(b)所示。
33.作为具体实施例地，所述螺旋主流道21的通道宽度为500～600μm；所述螺旋主流道21的横截面为内侧低、外侧高的梯形，其内壁面211与外壁面212的高度比值为1/2～1/3.6，所述内壁面211的高度为50～75μm，所述外壁面212的高度为150～180μm。
34.作为具体实施例地，所述矩形突扩流道22的数量至少为25个，其沿所述外壁面212突扩的宽度为250～450μm。
35.作为具体实施例地，所述第一梯形突扩流道231的上底到下底的距离为1000μm，其腰与上底的夹角为120
°
；所述第二梯形突扩流道232的上底到下底的距离为1200μm，其腰与上底的夹角为100
°
。
36.如图4所示，两种不同尺寸的聚苯乙烯微球被用于模拟单体细胞和团簇细胞在螺旋主流道中的惯性聚焦迁移现象。聚苯乙烯微球在螺旋主流道内共同受到惯性升力和迪恩拽力的作用，两种作用力的大小主要由微球的尺寸决定，其中尺寸为7μm的微球由迪恩拽力主导迁移至螺旋主流道的外壁面处，而尺寸为15μm的微球由惯性升力主导迁移至螺旋主流道的内壁面。
37.如图5所示，矩形突扩流道22沿螺旋主流道21的外壁面212分布，作用是形成局部增强迪恩流。聚焦在外壁面的微球或单细胞在经过矩形突扩流道22时，因为增强迪恩流牵引进一步向外壁面212迁移，而聚焦在内壁面211的微球或团簇细胞主要由惯性升力引导而不受影响。
38.如图6所示，梯形突扩流道23通过二级梯形突扩逐步增加流道宽度。经梯形截面螺旋主流道21聚焦的微球经过二级梯形突扩进一步增加聚焦束位置间的横向距离，为后续y形出口流道24分离两种微球或细胞提供基础。
39.如图7所示，将包含单体细胞和细胞团簇的悬液样本以特定流速通入本技术所述的微流控芯片时，y形出口流道24处可以观察到的聚焦图谱，其中单体细胞聚焦于流道外壁面212处，团簇细胞聚焦于流道的内壁面211处。
40.综上所述，本实施例提出的细胞团簇分选微流控芯片具有基于尺寸的生物粒子精准操控能力。大尺寸细胞或团簇由惯性升力牵引聚焦在流道内壁面211处，小尺寸单细胞由
迪恩拽力牵引聚焦在外壁面212处。由流道外壁面212所设的突扩流道形成局部增强迪恩流，进一步将小尺寸单细胞迁移至流道外壁面212，而大尺寸细胞或团簇由惯性升力牵引始终聚焦在流道内壁面211。因此，细胞团簇分选微流控芯片可以实现单体细胞和团簇细胞的高精度、高纯度分离，且无需外加场、无需鞘液，可广泛用于生物细胞高效捕获和富集，也为生命医学和临床研究提供高效的前处理方法。
41.以上所述仅是本技术的优选实施方式，应当指出：对于本领域技术人员而言，在不脱离本技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本技术的保护范围。