用于治疗肺功能受损的植物性蜕皮素及其衍生物的制作方法

1.本发明涉及植物性蜕皮素和植物性蜕皮素的半合成衍生物用于治疗呼吸功能受损，特别是在神经肌肉疾病的情况下的呼吸功能受损的用途。


背景技术：

2.神经肌肉疾病的特征在于由运动神经元、神经肌肉接头和骨骼肌构成的运动单位的功能受损。除了具有这些病理状况的患者的运动功能受损之外，非常多的急性或进行性神经肌肉疾病还导致呼吸肌功能障碍，这继而可导致患者的呼吸衰竭、肺炎和死亡。事实上，呼吸系统病症是患有神经系统疾病的患者中死亡的主要原因(miller et al.，2009)。
3.患有神经肌肉疾病的患者可能会发生呼吸功能受损，其可以以明显的方式表现，其中感染例如肺炎或支气管炎频繁发生(主要是由于咳嗽无效引起)、感觉气短、咳出困难。然而，在一些情况下，表现不那么明显，并且患者食欲丧失以及严重体重减轻、头痛、出汗或严重疲劳。因此，尽早检出呼吸系统疾病至关重要。
4.近年来，对具有神经肌肉病理状况的患者中呼吸问题的护理得到了相当地改善，使得患者(例如患有迪谢内肌营养不良的儿童)的寿命能够提高。使用临床检查、使得能够探索呼吸功能的肺活量测定成像或为了评价气体交换的品质的气体定量(动脉血中氧和二氧化碳气体的水平的测量)来规则地监测呼吸参数。因此，这些规则评价可检测肌无力和肺功能障碍的结果，并因此可调整这些患者的医学护理，以便补偿他们衰竭的呼吸功能并且以提高他们的生活品质(birnkrant et al.，2007；finder et al.，2004；mckim et al.，2011)。可以以数个水平提供护理：其可以旨在维持呼吸装置的活动性和灵活性(通过主动或被动地活动或通过机械过吹气(hyper insufflations m
é
caniques)进行呼吸物理治疗)或者旨在清理气道以便去除由支气管产生的分泌物(辅助咳嗽或支气管引流)或者最后，当自然通气不再满足身体的需要时，通过非侵入性通气或在最严重的情况下通过气管切开术通气来补充患者的呼吸。
5.对皮质、脑干、脊髓、运动神经元、周围神经、神经肌肉接头或肌肉的损伤均可能导致呼吸系统衰竭。
6.导致呼吸肌功能障碍的慢性肌肉疾病有多种原因，包括(先天性、遗传性或获得性)肌病、重症肌无力或肌强直。
7.例如，在迪谢内肌营养不良(dystrophie musculaire de duchenne，dmd)中，呼吸衰竭导致许多肺部并发症是dmd患者中观察到的大多数死亡的原因(mayer et al.，2015；vianello et al.，1994；baydur et al.，1990；smith et al.，1987；inkley et al.，1974)。dmd是最常见形式的肌营养不良。每3500名男孩中一名男孩受其影响，并且其是由影响位于x染色体上的抗肌萎缩蛋白基因的突变导致的。一种不太严重的形式，贝克肌营养不良(dystrophie musculaire de becker，bmd)，也涉及抗肌萎缩蛋白基因，并且每18,000名男孩中一名男孩受其影响。患有dmd的男孩在仍能够行走时通常不会出现呼吸或咳嗽困难。随着他们年龄增长并且疾病会影响他们的呼吸肌，受影响的男孩存在感染呼吸系统感染的
风险，通常是由于咳嗽无效引起。平滑肌细胞以及相关地气道的平滑肌与许多呼吸系统疾病相关。
8.除了肌病过程，肺系统本身(气道或肺)的异常还与dmd患者中的呼吸衰竭密切相关(benditt和boitano，2013)。事实上，肺顺应性(肺响应于压力变化改变其容积的能力)降低的主要原因有两个：由通气不足导致的肺泡的收缩和闭陷(肺不张)，以及气道的纤维化和阻塞的出现，结果导致气道阻力的提高(lo mauro和aliverti，2016)。
9.在患有肌营养不良的患者中，肺的弹性特性受损，肺变得不那么可扩张。肌营养不良中肺可扩张性降低的原因尚不完全了解。尽管如此，已经提出了多种假设来试图解释肺弹性的降低：在先天性疾病的情况下肺组织发育不完全、通气不足诱导的肺不张、肺泡表面张力提高或由于纤维化引起的对肺实质的损伤。此外，解释可扩张性和肺顺应性的这种降低的重要因素之一是低肺容积呼吸，其是肌营养不良的特征(lo mauro和aliverti，2016)。
10.涉及的另一机制是呼吸肌的慢性和进行性退化，这实际上限制了肺活性的范围。实际上，系统的弹性特性部分地由系统所承受的应力确定。总肺容量是通气期间瞬时弹性收缩压力与由吸气肌收缩产生的压力之间平衡的结果。后者降低，并因此总肺容量也降低，这会改变呼气参数并导致肺顺应性降低。
11.总之，以呼吸系统无法提供充足的氧合作用及二氧化碳去除为特征的呼吸衰竭在患有dmd的患者中是常见的。
12.因此，在mdx小鼠(迪谢内肌病的最常用的鼠模型)中对呼吸系统衰竭的评价是在神经肌肉疾病的情况下建立和评价治疗解决方案时待考虑的重要参数。
13.在临床前研究期间评价mdx小鼠的呼吸系统具有显著优点：在一方面，其涉及临床上重要的缺陷，以及在另一方面，肺活量测定测量或体积描记测量是非侵入性的，并且可以在试验期间纵向地重复并且任选地按照对肌营养不良的多种治疗的效力的评价标准来进行。
14.多个团体已对mdx小鼠相比于健康对照小鼠的呼吸功能感兴趣，并且已报道了mdx小鼠中呼吸功能受损(gosselin et al.[2003]；polizzi et al.[2003]；polizzi et al.2013；和gayraud et al.，[2007])。因此，通过对受损的严重程度和这些受损发作的年龄进行一些修改，这些均报道了在常氧条件下呼吸参数的变化(huang et al.，2011)或响应于高碳酸血症的呼吸参数变化(gosselin et al.2003)。


技术实现要素：

[0015]
本发明人发现植物性蜕皮素和植物性蜕皮素的半合成衍生物通过限制呼吸参数随时间推移的变化，以及通过改善呼吸系统的力学参数显著改善了患有神经肌肉疾病的哺乳动物的呼吸功能。呼吸系统的呼吸参数和力学参数分别由用于清醒动物的全身体积描记和由用于经麻醉动物的中央控制单元(通常称为“计算机”)控制的活塞式呼吸机来确定，所述呼吸机使用强迫振荡技术，例如称为flexivent
tm
的装置。这些作用表明，具有遗传性或获得性神经肌肉病理状况的哺乳动物中的呼吸功能得到改善。
[0016]
植物性蜕皮素是在结构上与昆虫蜕皮激素有关的重要的多羟基化植物甾醇家族。这些分子由许多植物物种产生，并参与它们对虫害的防御。主要的植物性蜕皮素是20
‑
羟基蜕皮素。
[0017]
为此，本发明涉及至少一种植物性蜕皮素和/或植物性蜕皮素的至少一种半合成衍生物，其用于治疗呼吸功能受损。
[0018]
本发明优选地涉及包含至少一种植物性蜕皮素和/或植物性蜕皮素的至少一种半合成衍生物的组合物，其用于治疗呼吸功能受损。
[0019]
在一些特定实施方案中，本发明还响应于单独实施的或以其技术上可行的组合中的每一种而实施的以下特征。
[0020]
植物性蜕皮素及其衍生物被有利地纯化至药用级。
[0021]
根据本发明可用的植物性蜕皮素是例如20
‑
羟基蜕皮素，并且植物性蜕皮素的可用的半合成衍生物是例如20
‑
羟基蜕皮素的半合成衍生物。
[0022]
为此，根据一个实施方案，组合物包含20
‑
羟基蜕皮素和/或20
‑
羟基蜕皮素的至少一种半合成衍生物。
[0023]
20
‑
羟基蜕皮素及其衍生物被有利地纯化至药用级。
[0024]
使用的20
‑
羟基蜕皮素优选为以下形式：富含20
‑
羟基蜕皮素的植物提取物，或者包含20
‑
羟基蜕皮素作为活性成分的组合物。富含20
‑
羟基蜕皮素的植物提取物是例如鹿草(stemmacantha carthamoides)(也称为leuzea carthamoides)、蛛丝毛蓝耳草(cyanotis arachnoidea)和蓝耳草(cyanotis vaga)的提取物。
[0025]
获得的提取物优选地被纯化至药用级。
[0026]
在一个实施方案中，20
‑
羟基蜕皮素是以植物提取物或植物部分的形式，所述植物选自包含按所述植物的干重计至少0.5％的20
‑
羟基蜕皮素的植物，所述提取物包含至少95％，并且优选至少97％的20
‑
羟基蜕皮素。所述提取物优选地被纯化至药用级。
[0027]
在下文中，所述提取物被称为bio101。其特征在于其包含按提取物的干重计0至0.05％的杂质，例如可影响所述提取物的药物应用的安全性、可用性或效力的微量化合物。
[0028]
根据本发明的一个实施方案，杂质为具有19或21个碳原子的化合物，例如红苋甾酮(rubrost
é
rone)、二氢红苋甾酮(dihydrorubrost
é
rone)或坡斯特甾酮(postst
é
rone)。
[0029]
从中产生bio101的植物优选地选自鹿草(也称leuzea carthamoides)、蛛丝毛蓝耳草和蓝耳草。
[0030]
植物性蜕皮素衍生物，并且特别是20
‑
羟基蜕皮素衍生物通过半合成获得，并且可特别地以欧洲专利申请ep 15732785.9中描述的方式获得。
[0031]
根据一个优选实施方案，本发明涉及这样的组合物，其用于在哺乳动物中治疗呼吸功能受损，更特别地由获得性遗传神经肌肉病理状况，例如运动神经元和/或神经肌肉接头和/或横纹骨骼肌的神经肌肉病理状况导致的呼吸功能受损。
[0032]
根据一个特定实施方案，本发明涉及这样的组合物，其用于在哺乳动物中治疗与横纹肌和/或平滑肌的受损相关的呼吸功能受损。
[0033]
在一个特定实施方案中，本发明涉及这样的组合物，其用于在哺乳动物中治疗至少部分由平滑肌修饰导致的呼吸功能受损。
[0034]
根据一个特定实施方案，本发明涉及这样的组合物，其用于在哺乳动物中治疗与支气管高反应性相关的呼吸功能受损。
[0035]
在一个实施方案中，本发明涉及这样的组合物，其用于在哺乳动物中治疗其中支气管高反应性与支气管平滑肌功能相关的呼吸功能受损。
[0036]
在一个实施方案中，本发明涉及这样的组合物，其用于在哺乳动物中治疗与选自以下的至少一种呼吸参数的状况相关的呼吸功能受损：penh值、吸气流量峰值、呼气流量峰值、弛豫时间和呼吸频率。该组合物将有利地降低这些呼吸参数的状况。
[0037]
在一个实施方案中，本发明涉及这样的组合物，其用于在哺乳动物中治疗与肺组织的至少一种力学参数的状况相关的呼吸功能受损。肺组织的所述力学参数是肺的弹性、顺应性和阻力。
[0038]
在一个特定实施方案中，本发明涉及这样的组合物，其用于在哺乳动物中治疗与肺顺应性降低和/或肺阻力提高和/或肺弹性降低相关的呼吸功能受损。
[0039]
在一个特定实施方案中，本发明涉及这样的组合物，其用于在哺乳动物中治疗其中呼吸功能受损与肺泡的收缩和闭陷和/或纤维化发作相关的疾病。
[0040]
在一个特定实施方案中，植物性蜕皮素在人中以3至15毫克/千克/天的剂量施用。在此，植物性蜕皮素被理解为意指一般性的植物性蜕皮素以及其衍生物，20
‑
羟基蜕皮素(特别是以提取物的形式)及其衍生物二者。
[0041]
植物性蜕皮素优选地在成人中以200至1000mg/天的剂量以一次或更多次摄入来施用，以及在人儿童或婴儿中以5至350mg/天的剂量以一次或更多次摄入来施用。在此，植物性蜕皮素被理解为意指一般性的植物性蜕皮素以及其衍生物，20
‑
羟基蜕皮素(特别是以提取物的形式)及其衍生物二者。
[0042]
在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种被认为是植物性蜕皮素的衍生物的化合物，所述至少一种化合物具有通式(i)：
[0043]
[化学式1]
[0044][0045]
其中：
[0046]
v
‑
u是碳
‑
碳单键，并且y是羟基或氢原子，或者v
‑
u是乙烯键c＝c；
[0047]
x是氧原子，
[0048]
q是羰基；
[0049]
r1选自：(c1‑
c6)w(c1‑
c6)基团；(c1‑
c6)w(c1‑
c6)w(c1‑
c6)基团；(c1‑
c6)w(c1‑
c6)co2(c1‑
c6)基团；(c1‑
c6)a基团，a表示任选地被oh、meo、(c1‑
c6)、n(c1‑
c6)、co2(c1‑
c6)类型的基团取代的杂环；ch2br基团；
[0050]
w是选自以下的杂原子：n、o和s，优选o并且更优选s。
[0051]
在本发明的上下文中，“(c1‑
c6)”意指具有1至6个碳原子的任何直链或支链的烷基，特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和正己基。有利地，其包含甲基、乙基、异丙基或叔丁基，特别是甲基或乙基，更特别是甲基。
[0052]
在一个优选实施方案中，在式(i)中：
[0053]
y是羟基；
[0054]
r1选自：(c1‑
c6)w(c1‑
c6)基团；(c1‑
c6)w(c1‑
c6)w(c1‑
c6)基团；(c1‑
c6)w(c1‑
c6)co2(c1‑
c6)基团；(c1‑
c6)a基团，a表示任选地被oh、meo、(c1‑
c6)、n(c1‑
c6)、co2(c1‑
c6)类型的基团取代的杂环；
[0055]
w是选自以下的杂原子：n、o和s，优选o并且更优选s。
[0056]
在一些实施方案中，所述组合物包含选自以下化合物的至少一种化合物：
[0057]
no.1：(2s，3r，5r，10r，13r，14s，17s)
‑
2，3，14
‑
三羟基
‑
10，13
‑
二甲基
‑
17
‑
(2
‑
吗啉代乙酰基)
‑
2，3，4，5，9，11，12，15，16，17
‑
十氢
‑
1h
‑
环戊并[a]菲
‑6‑
酮；
[0058]
no.2：(2s，3r，5r，10r，13r，14s，17s)
‑
2，3，14
‑
三羟基
‑
17
‑
[2
‑
(3
‑
羟基吡咯烷
‑1‑
基)乙酰基]
‑
10，13
‑
二甲基
‑
2，3，4，5，9，11，12，15，16，17
‑
十氢
‑
1h
‑
环戊并[a]菲
‑6‑
酮；
[0059]
no.3：(2s，3r，5r，10r，13r，14s，17s)
‑
2，3，14
‑
三羟基
‑
17
‑
[2
‑
(4
‑
羟基
‑1‑
哌啶基)乙酰基]
‑
10，13
‑
二甲基
‑
2，3，4，5，9，11，12，15，16，17
‑
十氢
‑
1h
‑
环戊并[a]菲
‑6‑
酮；
[0060]
no.4：(2s，3r，5r，10r，13r，14s，17s)
‑
2，3，14
‑
三羟基
‑
17
‑
[2
‑
[4
‑
(2
‑
羟基乙基)
‑1‑
哌啶基]乙酰基]
‑
10，13
‑
二甲基
‑
2，3，4，5，9，11，12，15，16，17
‑
十氢
‑
1h
‑
环戊并[a]菲
‑6‑
酮；
[0061]
no.5：(2s，3r，5r，10r，13r，14s，17s)
‑
17
‑
[2
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基(甲基)氨基)乙酰基]
‑
2，3，14
‑
三羟基
‑
10，13
‑
二甲基
‑
2，3，4，5，9，11，12，15，16，17
‑
十氢
‑
1h
‑
环戊并[a]菲
‑6‑
酮；
[0062]
no.6：2
‑
[2
‑
氧代
‑2‑
[(2s，3r，5r，10r，13r，14s，17s)
‑
2，3，14
‑
三羟基
‑
10，13
‑
二甲基
‑6‑
氧代
‑
2，3，4，5，9，11，12，15，16，17
‑
十氢
‑
1h
‑
环戊并[a]菲
‑
17
‑
基]乙基]硫烷基乙酸乙酯；
[0063]
no.7：(2s，3r，5r，10r，13r，14s，17s)
‑
17
‑
(2
‑
乙基硫烷基乙酰基)
‑
2，3，14
‑
三羟基
‑
10，13
‑
二甲基
‑
2，3，4，5，9，11，12，15，16，17
‑
十氢
‑
1h
‑
环戊并[a]菲
‑6‑
酮；
[0064]
no.8：(2s，3r，5r，10r，13r，14s，17s)
‑
2，3，14
‑
三羟基
‑
17
‑
[2
‑
(2
‑
羟基乙基硫烷基)乙酰基]
‑
10，13
‑
二甲基
‑
2，3，4，5，9，11，12，15，16，17
‑
十氢
‑
1h
‑
环戊并[a]菲
‑6‑
酮。
[0065]
在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种被认为是植物性蜕皮素的衍生物的化合物，所述至少一种化合物具有通式(ii)：
[0066]
[化学式2]
[0067][0068]
式(ii)化合物在下文中被称为bio103。
[0069]
在一些实施方案中，所述组合物被并入在可经口施用的可药用配方中。
[0070]
在本发明的上下文中，“可药用”意指可用于制备药物组合物中并且通常是安全、无毒的并且对于兽医以及人药物用途是可接受的。
附图说明
[0071]
基于阅读通过非限制性实例给出的以下描述并参考附图，将更好地理解本发明，其中：
[0072]
图1a示出了响应于递增剂量的乙酰甲胆碱，通过体积描记测量的在接受处理之前(d0：第0天)健康对照小鼠c57black10(n＝12，白色圆圈)和mdx小鼠(n＝23，白色正方形)的在研究开始之前的penh值的曲线，其中**p＜0.001和***p＜0.0001。在描述的其余部分中，n对应于样本大小，并且p对应于用于量化结果的统计学显著性的“p值”，其中*：p＜0.05；**：p＜0.001；***p＜0.0001以及ns：不显著。
[0073]
图1b示出了响应于递增剂量的乙酰甲胆碱，通过体积描记测量的在接受处理之前(d0：第0天)健康对照小鼠c57black10(n＝12，白色圆圈)和mdx小鼠(n＝23，白色正方形)的在研究开始之前的吸气流量峰值的曲线，其中*p＜0.05，**p＜0.001；
[0074]
图1c示出了响应于递增剂量的乙酰甲胆碱，通过体积描记测量的在接受处理之前(d0：第0天)健康对照小鼠c57black10(n＝12，白色圆圈)和mdx小鼠(n＝23，白色正方形)的在研究开始之前的呼气流量峰值的曲线，其中**p＜0.001；
[0075]
图1d示出了响应于递增剂量的乙酰甲胆碱，通过体积描记测量的在接受处理之前(d0：第0天)健康对照小鼠c57black10(n＝12，白色圆圈)和mdx小鼠(n＝23，白色正方形)的在研究开始之前的弛豫时间的曲线，其中**p＜0.001和***p＜0.0001。
[0076]
图1e示出了响应于递增剂量的乙酰甲胆碱，通过体积描记测量的在接受处理之前(d0：第0天)健康对照小鼠c57black10(n＝12，白色圆圈)和mdx小鼠(n＝23，白色正方形)的在研究开始之前的呼吸频率的曲线，其中*p＜0.05和***p＜0.0001。
[0077]
图2a示出了在将动物随机化为三个不同组：健康对照小鼠c57black10(n＝12，白色圆圈)，将不接受处理的mdx小鼠(n＝11，白色正方形，“mdx”组)和将用bio101处理的mdx小鼠(n＝12，黑色正方形，“mdx bio101”组)之后，响应于递增剂量的乙酰甲胆碱通过体积描记测量的在研究开始之前(d0)的penh值的曲线，其中**p＜0.001和***p＜0.0001；
[0078]
图2b示出了在将动物随机化为三个不同组：健康对照小鼠c57black10(n＝12，白色圆圈)，将不接受处理的mdx小鼠(n＝11，白色正方形，“mdx”组)和将用bio101处理的mdx小鼠(n＝12，黑色正方形，“mdx bio101”组)之后，响应于递增剂量的乙酰甲胆碱通过体积描记测量的在研究开始之前(d0)的吸气流量峰值的曲线；
[0079]
图2c示出了在将动物随机化为三个不同组：健康对照小鼠c57black10(n＝12，白色圆圈)，将不接受处理的mdx小鼠(n＝11，白色正方形，“mdx”组)和将用bio101处理的mdx小鼠(n＝12，黑色正方形，“mdx bio101”组)之后，响应于递增剂量的乙酰甲胆碱通过体积描记测量的在研究开始之前(d0)的呼气流量峰值的曲线；
[0080]
图2d示出了在将动物随机化为三个不同组：健康对照小鼠c57black10(n＝12，白色圆圈)，将不接受处理的mdx小鼠(n＝11，白色正方形，“mdx”组)和将用bio101处理的mdx小鼠(n＝12，黑色正方形，“mdx bio101”组)之后，响应于递增剂量的乙酰甲胆碱通过体积描记测量的在研究开始之前(d0)的弛豫时间的曲线；
[0081]
图2e示出了在将动物随机化为三个不同组：健康对照小鼠c57black10(n＝12，白色圆圈)，将不接受处理的mdx小鼠(n＝11，白色正方形，“mdx”组)和将用bio101处理的mdx小鼠(n＝12，黑色正方形，“mdx bio101”组)之后，响应于递增剂量的乙酰甲胆碱通过体积
描记测量的在研究开始之前(d0)的呼吸频率的曲线；
[0082]
图3a示出了响应于递增剂量的乙酰甲胆碱通过体积描记测量的健康对照小鼠c57black10(n＝12，白色圆圈)、未经处理的mdx小鼠(n＝11，白色正方形，“mdx”组)和用bio101处理的mdx小鼠(n＝12，黑色正方形，“mdx bio101”组)的在处理30天之后的penh值的曲线，其中**p＜0.001：
[0083]
图3b示出了响应于递增剂量的乙酰甲胆碱通过体积描记测量的健康对照小鼠c57black10(n＝12，白色圆圈)、未经处理的mdx小鼠(n＝11，白色正方形，“mdx”组)和用bio101处理的mdx小鼠(n＝12，黑色正方形，“mdx bio101”组)的在处理30天之后的吸气流量峰值的曲线，其中*p＜0.05，**p＜0.001；
[0084]
图3c示出了响应于递增剂量的乙酰甲胆碱通过体积描记测量的健康对照小鼠c57black10(n＝12，白色圆圈)、未经处理的mdx小鼠(n＝11，白色正方形，“mdx”组)和用bio101处理的mdx小鼠(n＝12，黑色正方形，“mdx bio101”组)的在处理30天之后的呼气流量峰值的曲线，其中*p＜0.05；
[0085]
图3d示出了响应于递增剂量的乙酰甲胆碱通过体积描记测量的健康对照小鼠c57black10(n＝12，白色圆圈)、未经处理的mdx小鼠(n＝11，白色正方形，“mdx”组)和用bio101处理的mdx小鼠(n＝12，黑色正方形，“mdx bio101”组)的在处理30天之后的弛豫时间的曲线，其中*p＜0.05；
[0086]
图3e示出了响应于递增剂量的乙酰甲胆碱通过体积描记测量的健康对照小鼠c57black10(n＝12，白色圆圈)、未经处理的mdx小鼠(n＝11，白色正方形，“mdx”组)和用bio101处理的mdx小鼠(n＝12，黑色正方形，“mdx bio101”组)的在处理30天之后的呼吸频率的曲线；
[0087]
图4a示出了响应于递增剂量的乙酰甲胆碱通过体积描记测量的健康对照小鼠c57black10(n＝12，白色圆圈)、未经处理的mdx小鼠(n＝11，白色正方形，“mdx”组)和用bio101处理的mdx小鼠(n＝12，黑色正方形，“mdx bio101”组)的在处理60天之后的penh值的曲线，其中***p＜0.0001；
[0088]
图4b示出了响应于递增剂量的乙酰甲胆碱通过体积描记测量的健康对照小鼠c57black10(n＝12，白色圆圈)、未经处理的mdx小鼠(n＝11，白色正方形，“mdx”组)和用bio101处理的mdx小鼠(n＝12，黑色正方形，“mdx bio101”组)的在处理60天之后的吸气流量峰值的曲线，其中*p＜0.05cp；
[0089]
图4c示出了响应于递增剂量的乙酰甲胆碱通过体积描记测量的健康对照小鼠c57black10(n＝12，白色圆圈)、未经处理的mdx小鼠(n＝11，白色正方形，“mdx”组)和用bio101处理的mdx小鼠(n＝12，黑色正方形，“mdx bio101”组)的在处理60天之后的呼气流量峰值的曲线；
[0090]
图4d示出了响应于递增剂量的乙酰甲胆碱通过体积描记测量的健康对照小鼠c57black10(n＝12，白色圆圈)、未经处理的mdx小鼠(n＝11，白色正方形，“mdx”组)和用bio101处理的mdx小鼠(n＝12，黑色正方形，“mdx bio101”组)的在处理60天之后的弛豫时间的曲线；
[0091]
图4e示出了响应于递增剂量的乙酰甲胆碱通过体积描记测量的健康对照小鼠c57black10(n＝12，白色圆圈)、未经处理的mdx小鼠(n＝11，白色正方形，“mdx”组)和用
bio101处理的mdx小鼠(n＝12，黑色正方形，“mdx bio101”组)的在处理60天之后的呼吸频率的曲线；
[0092]
图5a示出了对于经受递增剂量的乙酰甲胆碱的健康小鼠c57black10在研究开始时(n＝12，黑色圆圈，d0)和在研究结束时(n＝12，白色圆圈，d60)通过体积描记测量的penh值变化的曲线；
[0093]
图5b示出了对于经受递增剂量的乙酰甲胆碱的未经处理的mdx小鼠在研究开始时(n＝23，黑色圆圈，d0)和在研究结束时(n＝12，白色圆圈，d60)通过体积描记测量的penh值变化的曲线，其中***p＜0.0001；
[0094]
图6a示出了在40mg/ml的乙酰甲胆碱剂量下通过体积描记测量的健康小鼠c57black10(n＝12)和未经处理的mdx小鼠(n＝23)的在研究开始时(d0)的penh值，其中***p＜0.0001；
[0095]
图6b示出了在40mg/ml的乙酰甲胆碱剂量下通过体积描记测量的健康小鼠c57black10(n＝12)、未经处理的mdx小鼠(n＝12)和用bio101处理的mdx小鼠(n＝12)的在研究60天(d60)之后的penh值，其中***p＜0.0001；
[0096]
图7a示出了在健康小鼠c57black10(n＝10)、未经处理的mdx小鼠(n＝10)和用bio101处理的mdx小鼠(n＝10)中在递增剂量的乙酰甲胆碱下通过活塞式呼吸机(flexivent
tm
)测量的肺阻力的变化，其中**p＜0.001和***p＜0.0001；
[0097]
图7b示出了在健康小鼠c57black10(n＝10)、未经处理的mdx小鼠(n＝10)和用bio101处理的mdx小鼠(n＝10)中在递增剂量的乙酰甲胆碱下通过活塞式呼吸机测量的肺顺应性的变化，其中***p＜0.0001；
[0098]
图7c示出了在健康小鼠c57black10(n＝10)、未经处理的mdx小鼠(n＝10)和用bio101处理的mdx小鼠(n＝10)中在递增剂量的乙酰甲胆碱下通过活塞式呼吸机测量的肺弹性的变化，其中***p＜0.0001；
[0099]
图8a示出了在20mg/ml的乙酰甲胆碱剂量下通过活塞式呼吸机测量的健康小鼠c57black10(n＝10)、未经处理的mdx小鼠(n＝10)和用bio101处理的mdx小鼠(n＝10)的在研究60天之后的肺阻力值，其中***p＜0.0001；
[0100]
图8b示出了在20mg/ml的乙酰甲胆碱剂量下通过活塞式呼吸机测量的健康小鼠c57black10(n＝10)、未经处理的mdx小鼠(n＝10)和用bio101处理的mdx小鼠(n＝10)的在研究60天之后的肺顺应性值，其中***p＜0.0001；
[0101]
图8c示出了在20mg/ml的乙酰甲胆碱剂量下通过活塞式呼吸机测量的健康小鼠c57black10(n＝10)、未经处理的mdx小鼠(n＝10)和用bio101处理的mdx小鼠(n＝10)的在研究60天之后的肺弹性值，其中*p＜0.05并且**p＜0.001；
具体实施方式
[0102]
下面将在本发明的一些优选的非限制性应用领域的特定背景中描述本发明。
[0103]
1.用于纯化bio101的方法
[0104]
bio101根据以下步骤从90％纯20
‑
羟基蜕皮素制备：
[0105]
i)将90％纯20
‑
羟基蜕皮素热溶解在甲醇中，过滤并部分浓缩，
[0106]
ii)添加3倍体积的丙酮，
[0107]
iii)在搅拌的同时冷却至0至5℃的温度，
[0108]
iv)过滤获得的沉淀物，
[0109]
v)用丙酮和水连续冲洗，以及
[0110]
vi)干燥。
[0111]
这种纯化采用适合该分子并且能够在工业规模上进行的再结晶过程。
[0112]
步骤i)的过滤使用0.2μm颗粒过滤器进行。
[0113]
步骤i)的部分浓缩有利地通过在存在meoh的情况下在约50℃的温度下真空蒸馏进行。
[0114]
干燥步骤vi)在约50℃的温度下在真空下进行。
[0115]
2.bio101的生物活性
[0116]
使用12周龄的雄性小鼠c57bl/10scsnj(健康小鼠，在图中表示为“c57black10”)和c57bl/10scsn
‑
dmdmdx/j(迪谢内肌营养不良鼠模型，在图中表示为“mdx”)。将小鼠分为三组，每组12只小鼠：健康对照小鼠c57black10的未经处理组、未经处理的mdx小鼠组(mdx)和用50mg/kg/天的剂量在饮用水中经口长期处理的小鼠组。
[0117]
在研究开始之前(d0)，然后在处理开始之后30天(d30)和60天(d60)通过全身体积描记评价所有小鼠的呼吸功能。在两个月处理之后，在仅处死动物之前，通过中央控制单元(通常称为“计算机”)控制的活塞式呼吸机对呼吸功能进行侵入性评价，所述呼吸机使用强迫振荡技术，例如称为flexivent
tm
的装置，以便更直接地确定呼吸系统的力学参数。
[0118]
a.通过体积描记进行的bio101对呼吸功能之作用的分析
[0119]
为了精确地监测处理过程中呼吸功能的变化，对健康对照小鼠c57black10、未经处理的mdx小鼠和用bio101处理的mdx小鼠进行全身体积描记分析(emka technologies，paris，france)。
[0120]
这种技术的优点在于其允许对在密闭的围场中自由活动的清醒动物进行监测，并且这是以非侵入性方式进行的事实。因此，由于可长时期重复测量，因此降低了由于处理动物而引起的应力。因此，气压体积描记频繁用于在小动物中测量支气管反应性(chong et al.，1998；djuric et al.，1998；hoffman et al.，1999)。
[0121]
相对于参考室测量的压力变化可限定多种呼吸参数，例如吸气和呼气压力的峰值和时间以及允许评价支气管收缩的称为penh(增强呼气间歇(enhanced pause))的无量纲量。更具体地，从室中的压力信号(pb)计算的penh是待获得的重要指标，因为penh的变化与呼吸阻力的变化同时发生，并因此其代表了呼吸系统的阻力特性变化的预测性参数。(hamelmann et al.，1997；bergren，2001；onclinx et al.，2003)。从经过滤的pb计算以下值：呼气期间pb的最大变化(pep：呼气压力峰值(peak expiratory pressure))、吸气期间pb的最大变化(pip：吸气压力峰值(peak inspiratory pressure))和时间间隔(tr)。penh值如下计算：
[0122]
[数1](pip/pep)
×
呼气间歇(pause)
[0123]
其中：
[0124]
[数2]呼气间歇＝(te
‑
tr)/te
[0125]
te是呼气时间(adler et al.，2004)。
[0126]
此外，还测量并示出了吸气流量峰值(peak inspiratory flow，pif)和呼气流量
峰值(peak expiratory flow，pef)、弛豫时间(le temps de relaxation，rt)和呼吸频率(bf)。
[0127]
在处理开始之前(d0)、在处理开始之后30天(d30)和在处理开始之后60天(d60)测量penh值。
[0128]
首先，在接受处理之前，将mdx小鼠整个组群(n＝24)与健康小鼠c57black10(n＝12)进行比较。将清醒小鼠暴露于由包含pbs中0至40mg/ml乙酰甲胆碱的雾化器产生的递增剂量的乙酰甲胆碱气雾剂。正如预期和已表明的那样，mdx小鼠表现出呼吸功能受损(huang et al.，2011；gosselin et al.，2003；gayraud et al.，2007；ishizaki et al.，2008)，其中与健康小鼠相比，响应于乙酰甲胆碱，penh显著提高(p＜0.001和p＜0.0001)(图1a)，其与吸气流量峰值和呼气流量峰值的显著降低(p＜0.05和p＜0.001)(图1b和1c)相关，特别是在支气管收缩剂剂量之前或在低支气管收缩剂剂量下。与对照小鼠相比，在mdx小鼠中，弛豫时间(rt)也极显著地更长(p＜0.001和p＜0.0001)(图1d)。在每个测量时间，在组之间，吸气时间(temps inspiratoire，ti)和呼气时间(temps expiratoire，te)的值维持相当(数据未示出)。与健康小鼠相比，mdx小鼠的呼吸频率也降低(p＜0.05和p＜0.0001)(图1e)。
[0129]
随后将mdx小鼠分成两个不同的组：不会接受任何处理的mdx小鼠(白色正方形)和将接受分子bio101的mdx小鼠(黑色正方形)。如图2a、2b、2c、2d和2e中所示，这两组其呼吸功能表现出相同的能力而测量的多种呼吸参数之间无显著差异，这表明在处理之前所有未经处理的mdx小鼠具有相同的呼吸谱。
[0130]
在处理30天之后，与d0时的mdx小鼠相比，用bio101处理的mdx小鼠表现出penh显著降低(p＜0.001)，其中响应于乙酰甲胆碱的penh曲线与健康小鼠c57black10的penh曲线相当(图3a)。penh的降低与吸气流量峰值的提高相关，特别是在平衡状态或在低乙酰甲胆碱剂量下(p＜0.05)(图3c)。此外，与未经处理的mdx小鼠相比，在用bio101处理的mdx小鼠中观察到弛豫时间的明显改善(p＜0.05)(图3d)。相比之下，吸气流量峰值和呼吸频率与d0时测量的吸气流量峰值和呼吸频率相比维持不变(图3b和3e)。
[0131]
在处理60天之后，bio101对mdx小鼠的呼吸功能维持其有益作用。具体地，结果证实了在处理30天之后所观察到的。与未经处理的mdx小鼠相比，用bio101处理的mdx小鼠显示出penh显著降低(p＜0.0001)，并且无论乙酰甲胆碱剂量如何，penh的变化谱均与对照的变化谱相似(图4a)。在吸气流量峰值中看到显著改善(p＜0.05)，同时弛豫时间趋向改善(图4b和4d)。相比之下，呼气流量峰值和呼吸频率维持不变(图4b和4e)。
[0132]
为了在mdx小鼠中纵向评价呼吸功能受损，在健康对照小鼠中在d0与d60之间以及在未经处理的mdx小鼠中在d0与d60之间比较了penh的变化。如预期地，在对照小鼠中，在d0与d60之间penh无变化(p＝ns)(图5a)。相比之下，与d0相比在d60时，在mdx小鼠中，呼吸功能显著降低，如响应于乙酰甲胆碱的penh提高所示(p＜0.0001)(图5b)。
[0133]
在40mg/ml的乙酰甲胆碱剂量下，在处理之前，健康对照小鼠(n＝12)中的penh平均值显著低于在mdx小鼠(n＝23)中发现的penh平均值(分别为penh＝0.72和1.42，其中p＜0.0001)(图6a)。在d60时，与健康对照小鼠(n＝12)相比，在未经处理的mdx小鼠(n＝12)中，penh值更高，其中值分别为1.04和4(p＜0.0001)(图6b)。令人感兴趣的是，与未经处理的mdx小鼠相比，用bio101处理显著降低了该值，其中penh值等于1.87(p＜0.0001)(图6b)。所
unreliable measure of airway responsiveness in balb/c and c57bl/6mice.j.appl.physiol.(1985).(2004)；97(1)：286
‑
92.
[0143]
baydur a，gilgoff i，prentice w，carlson m，fischer da.decline in respiratory function and experience with long
‑
term assisted ventilation in advanced duchenne’s muscular dystrophy.chest(1990)；97：884
‑
9.
[0144]
benditt jo and boitano lj.pulmonary lssues in patients with chronic neuromuscular disease，am.j.respir.crit.care med.(2013)；187(10)：1046
‑
55.
[0145]
bergren dr.chronic tobacco smoke exposure increases airway sensitivity to capsaicin in awake guinea pigs.j.appl.physiol.(2001)；90：695
‑
704.
[0146]
birnkrant dj，panitch hb，benditt jo，boitano lj，carter er，et al.american college of chest physicians consensus statement on the respiratory and related management of patients with duchenne muscular dystrophy undergoing anesthesia or sedation.chest(2007)；132：1977
‑
86.
[0147]
chong bt，agrawal dk，romero fa，townley rg.measurement of bronchoconstriction using whole
‑
body plethysmograph：comparison of freely moving versus restrained guinea pigs.j.pharmacol.toxicol.methods(t998)；39：163
‑
8.
[0148]
djuric vj，cox g，overstreet dh，smith i，dragomir a，steiner m.genetically transmitted cholinergic hyperresponsiveness predisposes to experimental asthma.brain behav.immun.(1998)；12：272
‑
84.
[0149]
finder jd，birnkrant d，carl j，farber hj，gozal d，et al.american thoracic society.respiratory care of the patient with duchenne muscular dystrophy：ats consensus statement.am.j.respir.crit.care med.(2004)；170：456
‑
65.
[0150]
gayraud j，matecki s，hnia k，mornet d，prefaut c，et al.ventilation during airbreathing and in response to hypercapnia in 5 and 16 month
‑
old mdx and c57 mice.j.muscle res.cell motil.(2007)；28(1)：29
‑
37.
[0151]
gosselin le，barkley je，spencer mj，mccormick km，farkas ga.ventilatory dysfunction in mdx mice：impact of tumor necrosis factor
‑
alpha deletion.muscle nerve(2003)；28：336
‑
43.
[0152]
hamelmann e，schwarze j，takeda k，oshiba a，larsen gl，irvin cg，gelfand ew.noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography.am.j.respir.crit.care med.(1997)；156：766
‑
75.
[0153]
hoffman am，dhupa n，cimetti l.airway reactivity measured by barometric whole
‑
body plethysmography in healthy cats.am.j.vet.res.，(1999)；60：1487
‑
92.
[0154]
huang p，cheng g，lu h，aronica m，ransohoff rm，zhou l.impaired respiratory function in mdx and mdx/utrn( /
‑
)mice.muscle nerve(2011)；43(2)：263
‑
7.
[0155]
inkley sr，oldenburg fc，vignos pj jr.pulmonary function in duchenne muscular dystrophy related to stage of disease.am.j.med.(1974)；56：297
‑
306.
[0156]
ishizaki m，suga t，kimura e，shiota t，kawano r，et al.mdx respiratory impairment following fibrosis of the diaphragm.neuromuscul.disord.(2008)；18(4)：342
‑
8.
[0157]
lo mauro a and aliverti a.physiology of respiratory disturbances in muscular dystrophies.breathe(2016)；12(4)：318
‑
27.
[0158]
matecki s，rivier f，hugon g，koechlin c，et al.the effect of respiratory muscle training with co
2 breathing on cellular adaptation of mdx mouse diaphragm.neuromuscul.disord.(2005)；15：427
‑
36.
[0159]
mayer oh，finkel rs，rummey c，benton mj，glanzman am，et al.characterization of pulmonary function in duchenne muscular dystrophy，pediatr.pulmonol.(2015)；50：487
‑
94.
[0160]
mckim da，road j，avendano m，abdool s，cote f，et al.canadian thoracic society home mechanical ventilation committee.home mechanical ventilation：a canadian thoracic society clinical practice guideline.can.respir.j.(2011)；18：197
‑
215.
[0161]
miller rg，jackson ce，kasarskis ej，england jd，forshew d，et al.quality standards subcommittee of the american academy of neurology.practice parameter update：the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis：drug，nutritional，and respiratory therapies(an evidence
‑
based review)：report of the quality standards subcommittee of the american academy of neurology.neurology(2009)；73：1218
‑
26.
[0162]
mosqueira m，baby sm，lahiri s，khurana ts.ventilatory chemosensory drive is blunted in the mdx mouse model of duchenne muscular dystrophy(dmd).plos one.(2013)；8(7)：e69567
[0163]
onclinx c.relation entre la r
é
sistance pulmonaire totale et la penh en fonction de la localisation anatomique de l’obstruction des voies a
é
riennes(m
é
moire
‑
d
’é
tude approfondie).universit
éꢀ
de li
è
ge，facult
éꢀ
de m
é
decine v
é
t
é
rinaire：li
è
ge，(2003)，24p.
[0164]
smith pe，calverley pm，edwards rh，evans ga，campbell ej.practical problems in the respiratory care of patients with muscular dystrophy.n.engl.j.med.(1987)；316：1197
‑
205.
[0165]
vianello a，bevilacqua m，salvador v，cardaioli c，vincenti e.long
‑
term nasal intermittent positive pressure ventilation in advanced duchenne’s muscular dystrophy.chest(1994)；105：445
‑
8.