表皮生长因子在治疗糖尿病性足溃疡中的用途的制作方法

本发明属于人类医学和制药工业的领域。特别地，本发明涉及表皮生长因子(EGF)在制备用于治疗糖尿病性足溃疡(DFU)的药物中的用途。该药物通过损伤内浸润到所述损伤的床体中来进行施用。

现有技术

糖尿病对于公共卫生服务来说是一个重大的问题并且是最常见的非传染性慢性疾病之一。国际糖尿病联合会提出，这种疾病具有8.3％的在成年人中的全球患病率。根据世界卫生组织的统计数据，到2045年预计糖尿病人口将超过6.29亿人(International Diabetes Federation.The global burden.In:International Diabetes Federation.IDF Diabetes Atlas.Geneva:IDF,2017p.9-50)。目前，糖尿病继续显示加速增长，这主要是由于不良的饮食习惯和缺乏锻炼的系统性实施而导致，这已使其成为一种具有世界大流行病规模的非传染性疾病。

糖尿病患者的治疗教育是其治疗的基础。不了解自我保健措施和缺乏定期门诊随访有利于并发症例如DFU的出现(Al-Wahbi AM.Vasc Health Risk Manag.2010,6:923-34；Dorresteijn J,Valk JD.Diabetes Metab Res Rev 2012,28(Suppl 1):101-6)。尽管已经制定了预防计划并且组织了卫生服务，但是截肢仍然是一个有待解决的重要问题(García García Y等人,Revista Cubana de Angiología y Cirugía Vascular 2016,17(1)36-43)。

糖尿病性足的概念难以准确界定(Apelqvist J等人,International Working Group on the Diabetic Foot Editorial Board.Diabetes Metab Res Rev 2008,24(Suppl 1):S181-7)。在2007年的糖尿病性足国际临床指南(International Consensus on the Diabetic Foot)的文献中，糖尿病性足被定义为“与在具有糖尿病的人的下肢中的神经病和/或外周动脉疾病相关联的深部组织的溃疡、感染或破坏”。当存在某些使足部变得易于发生溃疡的因素例如神经病、局部缺血、变形、胼胝和水肿时，就被认为是风险足(García Herrera AL,Febles Sanabria R,Moliner Cartaya M.Revista Cubana de Angiología y Cirugía Vascular 2016,17(1):13-24)。

对于DFU的治疗，在现有技术中存在有由国际共识批准并且在影响大的期刊杂志上发表的不同类型的治疗，例如尤其是英国国家健康与护理卓越研究所(National Institute for Health and Care Excellence of the United Kingdom；NICE)的。在这些之中，可以指出压力部位放电、真空疗法、高压给氧、具有各种特性的敷药(其根据损伤类型进行应用)和广谱抗微生物剂(单独的或相组合的)。还有不同类型的清创术，无论是机械的，还是生物学的，还是化学的。此外，在这些患者中应用皮肤替代品(https://nice.org.uk/guidance/ng19，发表日期：2015年8月)。尽管如此，这些治疗中没有一个已经能够降低每年由于DFU而施行的截肢术的高百分比。溃疡的愈合是对于患者来说最重大的事件。然而，在不对常规或标准治疗作出应答的损伤中，肉芽形成(作为对于损伤闭合来说中间且相关的事件)具有重要意义，因为它降低溃疡感染和患病肢截肢的风险。

自90年代开始起，在慢性伤口的治疗中评价了生长因子的施用。这些生长因子之一为EGF，其是一种自上世纪50年代以来就认识的低分子量蛋白质(Hardwicke J等人,Surgeon 2008,6:172-177)。在慢性伤口、静脉溃疡和DFU中的施用试验之中，通过局部途径反复地应用了该生长因子。

在糖尿病的慢性伤口中的微环境对于局部生长因子的稳定性、其化学完整性、其生物可利用性和其生理学作用(作为医治过程的主要推动者)是不友好的。在该环境内，受体的持续表达和其信号传导能力被损坏(Berlanga-Acosta J等人,Int Wound J 2013,10:232-236；Tsourdi E等人,Biomed Res Int 2013:385641)。

已知通过EGF的伤口愈合的改善在延长、持续和缓慢释放系统下得到促进，这使其受体不断地表达。根据现有技术，需要EGF不断地暴露于其受体。这意味着，如果受体被暴露并且不断地被占据至少8至12小时，那么与EGF有关的伤口医治特性就可以表现出来(Knauer DJ等人,J Biol Chem 1984,259:5623-5631；Buckley A等人,Proc Natl Acad Sci U S A 1985,82:7340-7344)。

另一方面，已证明需要延长的局部生物可利用性和受体的及时刺激，以在伤口闭合中产生由EGF介导的显著影响(Kasayama S,Ohba Y,Oka T,Proc Natl Acad Sci U S A 1989,86:7644-7648；Berlanga-Acosta J,Int Wound J 2011,8:612-620；Cama VF等人,J Diabetic Complications Med 2016,1:111)。

一种具有重组人EGF(rhEGF)作为活性成分的用于损伤内使用的冻干产品被注册为用于治疗DFU的药物。该药品的损伤内施加向溃疡的床体提供重组蛋白质(替代疗法)，因为损伤的微环境的细胞不能合成内源蛋白质，或者以低的比例合成。该缺乏干扰溃疡的愈合，这导致慢性化，并因此导致并发症的出现，例如局部感染和患病肢截肢。所提及的药物将截肢率降低70％或更多，在那些不太复杂的溃疡中有最大的降低百分比。rhEGF的损伤内施加显示出正面的受益特征谱。已经用通过该途径施用的可注射rhEGF治疗了几千名具有DFU的患者。

以每周三次和75μg因子/所施用的药物剂量的治疗方案来进行在DFU的底部和边缘处的rhEGF浸润。从该施加开始，衰老细胞(尤其是成纤维细胞和角质形成细胞)被唤醒，这起始了在溃疡区域中从慢性促炎环境向生理学修复环境的变化。这保证了正确的肉芽形成或有用的活组织，和随后损伤闭合。该肉芽形成过程允许超过80％的与损伤闭合的相关性。尽管在肉芽形成和闭合之间存在高的相关性，但是当将具有DFU患病肢的中度局部缺血的患者纳入治疗时，这些百分比可以变化。每周三次和75μg/所施加的剂量的可注射rhEGF的施用方案具有频繁出现不良事件和治疗费用高昂以及患者不适(这可能导致其退出该疗法)这样的缺点。

因此，需要鉴定出新的可注射rhEGF的施用方案，其允许罹患糖尿病性足的患者的正确的肉芽形成和有效的损伤闭合，同时提高个体的舒适和其对治疗的依从性。

发明详述

本发明通过揭示表皮生长因子(EGF)在制备可注射药物中的用途而解决了上面所提出的问题，所述可注射药物用于在评价之时不具备患病肢截肢标准的患者中治疗DFU，其中每周一次通过损伤内浸润到所述溃疡的床体中来施用所述包含EGF的药物。在本发明的一个实施方案中，每一个向所述患者施用的药物剂量中的EGF量为2至80μg。

为了实施本发明，可以在开始时(即当进行初始诊断时)或者在治疗过程期间在患者中进行DFU的评价，以避免溃疡患病肢的截肢。当认为截肢标准不存在时，可以每周一次通过损伤内浸润到所述溃疡的床体中来施加所述包含EGF的药物。在本发明中，用由医学权威机构制定的常规疗法来治疗患者，同时患者接受每周一次用EGF损伤内浸润到DFU的床体中。

在本发明的一个实施方案中，所述患者先前已经接受了治疗以避免溃疡患病肢的截肢。该先前的治疗在于通过损伤内途径每周三次施用EGF。一旦评价了DFU并且证实不存在患病肢截肢标准，就转至每周一次通过用EGF损伤内浸润到所述溃疡的床体中来进行的治疗。

迄今为止，已在考虑每周三次施加药品的治疗中向几千名DFU患者通过损伤内途径施用了EGF。然而，还不存在其中每周一次施用EGF的施用制度的功效的先例，不论是在治疗期的一部分期间还是在整个治疗过程期间。用具有较低的EGF施加频次的该新的疗法制度来实现DFU有效闭合的结果无法从在先前文献中所描述的来预知，因为对于在糖尿病患者中的愈合机制了解得很少，其与在非糖尿病个体中所发生的相距甚远。

另一方面，如前面所提出的，已知通过EGF的伤口愈合的改善在延长、持续和缓慢释放系统下得到促进，并且为此需要延长的局部生物可利用性和受体的及时刺激。对于所有这些在该技术领域的文献中所报道的先前知识，没有预期到在DFU中减少EGF的施加频次后，取得与用更频繁的施加所达到的相似的结果，甚至在不具备患病肢截肢标准的患者中亦如此，如本发明的情况。更确切地说，预期像每周一次那样进行间隔的治疗将会诱导EGF受体的表达的下降，和因此对于用该生长因子的疗法的阴性应答。由于这个原因，试图减少施加频次的初期试验以三倍剂量的EGF(225μg)来进行，其力求在溃疡中保持足够量的该生长因子更长的时间。令人惊讶地，检测到在溃疡中rhEGF的残留量与用常规剂量是相同的，并且保持相同的治疗效果。更加令人惊讶的是，在该类型的溃疡中用常规剂量和用仅每周一次施加获得了相同的令人满意的结果。

在本发明的情景下，表皮生长因子是指保持其生物学活性的EGF分子的任何变体；例如在C-末端处截短的分子(Calnan等人,Gut 2000,47:622-627)，或在N-末端处截短的分子(Shin等人,Peptides 1995,16:205-210)。人EGF可以通过在本技术领域专业人员已知的宿主中的重组脱氧核糖核酸技术来获得(rhEGF)。并不是限制本发明的范围，在这些宿主之中包括酵母，例如糖酵母属(Saccharomyces)或毕赤酵母属(Pichia)；或者细菌，例如大肠杆菌(Escherichia coli)。该多肽也可以通过化学合成来获得。

为了本发明的目的，认为当组织具有下列状况时，DFU患肢不具备截肢标准：呈现出轻微的或不引人注目地中等的局部缺血程度；未呈现出由分泌物引起的局部感染、恶臭、骨累及(例如骨髓炎)的征候；未呈现出影响患者的总体状态的炎性征候，例如在溃疡区域中的水肿、发热、发红、疼痛和功能性丧失，即患者不具有全身性脓毒症的征候和症状；未呈现出广泛的肌肉坏死；呈现出具有良好张力的底部，在医治过程期间容易出血；具有尽可能保留的敏感性，即患者在医治过程期间表现出不适。

术语“DFU的评价”是本领域技术人员熟知的，并且出现在由医学院校和权威机构所制定的治疗指南中。另一方面，为了本发明的目的，术语“EGF的浸润”是指在DFU的床体的各个点处的注射。

在另一个方面，本发明提供了用于在评价之时不具备患病肢截肢标准的患者中治疗DFU的药用组合物，其包含EGF和在药学上可接受的赋形剂。该组合物每周一次进行施用。在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含这样的EGF量，其为2至80μg/向所述患者施用的剂量。并不是限制本发明的范围，对于所述药用组合物，将EGF与赋形剂和载料(其可以为例如稳定剂、缓冲液和允许冻干而不影响所述生长因子的生物学活性的化合物)一起进行配制。

本发明还考虑了用于在评价之时不具备患病肢截肢标准的患者中治疗DFU的方法，其包括每周一次通过损伤内浸润到所述溃疡的床体中来向所述患者施用治疗有效量的EGF。本发明的方法允许在同一治疗过程期间用常规疗法治疗所述患者。

在本发明的方法的一个实施方案中，每一个向所述患者施用的剂量中的EGF量为2至80μg。在本发明的方法中，可以在开始时(即在初始诊断之时)或者在治疗过程期间进行DFU的评价，以避免DFU患病肢的截肢。

在本发明的方法的一个特别的实施方案中，在以每周一次的制度接受EGF的损伤内浸润之前，用通过相同途径施用在所述溃疡的床体中的EGF每周三次治疗所述患者。该组合治疗方案，在患者中是有效的同时，还允许通过经由该途径将患者暴露于更少的总剂量的rhEGF来降低这些患者遭受损伤内施加rhEGF的最常见的不良事件(例如，疼痛和烧灼、颤抖和寒战)的可能性。

如在本发明中所看到的，令人惊讶地，在接受相当的rhEGF量/剂量的患者中，相比于在8周期间每周三次的已建立的施加方案而言，用所建议的新的治疗方案获得了相似的肉芽形成结果。

实施方案详述/实施例

实施例1.在DFU患者的三种治疗制度中损伤内施用rhEGF

所牵涉的DFU患者及其损伤的特征见于表1。可以看出，平均年龄在60岁以上，在24和87岁之间变动。患者的性别之间没有差异。2型糖尿病占优势。糖尿病的演化时间超过16年，并且损伤大多数是是3级(根据瓦格纳(Wagner)分类)。给患者分配三种治疗制度之一，根据方案和所施用的rhEGF的剂量。在这三个组中损伤面积大于20cm²。

向组1和2中的患者分别按照75μg/剂或25μg/剂通过损伤内途径每周三次施用rhEGF，以便影响损伤的边缘和底部。为此，用5mL注射用水进行包含该药品的小瓶的重构和稀释。进行施用直至获得100％的损伤的肉芽形成、通过移植的损伤闭合，或者达到最大8周的治疗。

向属于组3的患者通过损伤内途径在第一周期间每周三次施用该药品(75μg/剂)。从第二周开始，以225μg的剂量每周一次继续进行施用。治疗期为8周，虽然如果提前出现损伤的完全闭合，或者如果溃疡达到小于1cm²的大小，那么其可以更短。

表1.所研究的患者的人口统计学数据

^aSD：标准偏差；^bQR：四分位距

在所有组中使用从重组酵母获得和纯化的rhEGF。将经配制的产品在包含25μg或75μg的活性药学成分的小瓶中冻干。所述组合物还包含在药学上可接受的赋形剂，例如稳定剂和pH调节剂。

三个组中的患者继续接受常规疗法，其按照由古巴国家脉管学集团(National Angiology Group of Cuba)制定的用于DFU的治疗标准来进行。这包括：对损伤部位进行卸载，用胰岛素(其代替口服降血糖剂)进行基础疾病的代谢控制，用盐水溶液和皂性物质洗涤损伤，进行清创，施加具有纱布绷带的无菌敷料，和抗微生物剂，根据在损伤中存在的感染性病菌的类型。

DFU的面积和肉芽形成的百分比通过为了这些目的而创建的商业系统(Visitrak^TM,Smith&Nephew)来进行测量，所述商业系统包括栅格透明醋酸纤维和用于通过面积法来测量损伤的装置。该系统先前已进行了验证(Sugama J等人,J Clin Nurs 2007,16(7):1265-1269)。通过使用永久性标记，在醋酸纤维上描画损伤的轮廓和肉芽形成的区域。在具有高的患病肢截肢风险的患者中通过损伤内途径施加该药品后所获得的结果可在表2中看到。

表2.在用rhEGF进行损伤内治疗后肉芽形成和损伤闭合和截肢的应答

CR*：在3周时完全的肉芽形成应答(≥75％的被有用的肉芽形成组织覆盖的损伤面积)。PR^*：在3周时部分的肉芽形成应答(>50％且<75％的被有用的肉芽形成组织覆盖的损伤面积)。CR：在结束治疗时完全的肉芽形成应答(100％的被有用的肉芽形成组织覆盖的损伤面积)。

关于在整个治疗期间向其施加75μg的剂量(每周三次)的患者中，以及在接受75μg的初始剂量(一周内三次)和随后为225μg的周剂量的患者中，在第3周结束时的肉芽形成，结果是优异的。在该最后一组中所达到的值是令人惊讶的。在溃疡的相同测量点处，在用25μg的剂量(每周三次)进行治疗的患者组中看到64％的肉芽形成。同样地，获得了大于70％的损伤闭合和截肢风险(其在组1和3中低于15％)降低的重要结果；即损伤大多数从截肢情形转至非截肢情形。

实施例2.测定在通过损伤内途径进行治疗的DFU患者的血浆中的rhEGF水平

从对31名患者进行血液抽取开始，进行药物代谢动力学研究。该设计旨在测定在DFU中在损伤内施加rhEGF后的动力学参数。所评价的最重要的参数尤其为曲线下面积(AUC)和半寿期(t1/2)。用以下列水平包含rhEGF的药品每周三次来治疗患者：25μg/剂、75μg/剂和225μg/剂。治疗进行8周，或者更短的时间，如果溃疡的面积达到小于或等于1cm²的大小。

患者的人口统计学特征见于表3。56.2％的患者为男性。平均年龄为63岁。81.2％的患者为2型糖尿病，其中具有宽的糖尿病演化时间的可变性范围，在8和41年之间变动。

表3.参与该研究的患者的人口统计学特征

^aSD：标准偏差；^bQR：四分位距

作为该药品的活性成分的蛋白质(rhEGF)的测量在刚好首次施加之前(t0)、在首次施加后立即(t1)和在首次施用后不同时间之时进行。通过商业ELISA试剂盒(R&D)，以<0.7pg/ml的灵敏度，在患者的血浆样品中测定rhEGF的浓度。对于该生长因子的测定，遵循试剂盒制造商的说明书。

两小时的样品收集足以表征药物代谢动力学特性谱。一旦该时间结束，rhEGF的值就以独立于所接受的剂量的方式返回至基础水平，而不存在以后的增加。

在表4中可以观察到，在75μg和225μg的剂量下检测到较高的AUC值，相比于用25μg的剂量所达到的值而言。接受该较低剂量的患者具有相对于75μg和225μg的剂量而言更低的t1/2值。

表4.对于不同的施加给DFU患者的rhEGF剂量所评估的药物代谢动力学参数

通过所进行的生物可利用性分析，可以观察到，当施加25μg和75μg的剂量时，一小部分蛋白质进入血液。分别大约19μg和58μg停留在溃疡区域中。另一方面，对于225μg的剂量，最大量的rhEGF立即进入血液中，并且仅一小部分停留在溃疡区域中。该部分为大约63μg。也就是说，所施用的该生长因子的剂量的增加并不造成组织中的更大的浓度。这些结果与EGF剂量的增加不导致更大的效应这一事实相一致。

实施例3.在以不同的剂量和施加方案损伤内施用rhEGF后DFU的愈合

通过考虑在实施例1和2中所获得的结果，设计了在具备患病肢截肢标准的DFU患者中的研究，其中探究了不同的rhEGF剂量和施用方案，其中包括一旦患者不再具备所述肢的截肢标准时rhEGF的每周施用频次。

一方面，治疗48名患者，向其每周三次应用采用rhEGF的治疗，直至通过进行评价而确认不再具备患病肢截肢标准。在一周内重复进行施加的该时期通常与用可注射rhEGF的疗法的头三周同时进行。然后，继续每周一次用该生长因子进行治疗。施用途径始终是损伤内途径。完全的治疗进行8周，或者更短的时间，如果在这8周之前溃疡的床体已经被100％的有用的肉芽形成组织所覆盖，或者如果损伤已达到≤1cm²的面积。每组所施用的剂量为2.5μg、25μg、50μg和75μg。7名患者被纳入接受2.5μg的组中；10名患者被纳入接受25μg的剂量的组中；13名患者被纳入接受50μg的组中；和18名患者被纳入75μg的组中。

另一方面，存在有一个具有93名患者的组，其在整个该时期期间每周三次用75μg的剂量进行治疗。治疗时间为8周。在研究结束时，将该患者组的结果用作对照，相比于其余的接受在前一段落中所描述的治疗方案的组而言。

在患者中，男性占优势。平均年龄为64岁，占优势的糖尿病类型为2型。溃疡大小为22至27cm²，并且在大多数患者中损伤被归类为瓦格纳分类的3和4级。所有组中的患者继续接受常规疗法，其按照由古巴国家脉管学集团制定的用于DFU的治疗标准来进行，如在实施例1中所概述的。

所获得的结果展示在表5中。重要的是强调，在接受相同的rhEGF量/剂量的那些患者中，用所建议的新的治疗方案获得了相似的肉芽形成结果，相比于所制定的在8周期间每周三次的施加方案而言。

表5.在用不同的剂量和施加方案进行治疗的患者中损伤内施加rhEGF的结果

客观的肉芽形成应答：在3周时，≥75％的被有用的肉芽形成组织覆盖的损伤面积。完全的肉芽形成应答：在8周时，100％的被有用的肉芽形成组织覆盖的损伤面积。

在随访期间，在接受每周三次施加和随后每周一次施加的组合方案的组中，在2.5μg的组的4名患者(57％)，25μg的组的5名患者(50％)，50μg的组的9名患者(69％)，和75μg的组的13名患者(72％)中获得了损伤闭合。在其中患者接受rhEGF(75μg)的每周三次施加的充当对照的治疗组中，在81％的个体中获得了损伤闭合。相似地，在四个在rhEGF剂量方面不同的组中和在充当对照的组中，截肢低于12％。令人惊讶地，在此所建议的新的治疗方案，与常规疗法一起，导致以大于80％的程度降低了截肢风险。

该组合治疗方案，在患者中是有效的同时，还允许降低这些患者遭受损伤内施加rhEGF的最明显的不良事件(例如，疼痛和烧灼、颤抖和寒战)的可能性，这通过使患者更少次地暴露于经由该途径的rhEGF施用来实现。

实施例4.在每周一次损伤内施用rhEGF后DFU的愈合

治疗一系列的向其应用了常规疗法的病例，如在实施例1中所描述的那样，加上剂量为2.5μg(10名患者)、25μg(15名患者)、50μg(15名患者)或75μg(20名患者)的rhEGF。每周一次进行用该生长因子的损伤内治疗，持续8周，或更短的时间，如果产生了损伤闭合，直至等于或小于1cm²的尺寸。另一组患者仅接受常规疗法，不同之处在于该行为以每周三次进行，直至达到损伤的完全闭合。

在该系列病例中的患者在初始评价之时不具备DFU患病肢截肢标准。通常，对于所有组，较大百分比的患者是女性，不论是在开具了rhEGF的那些患者中，还是在未指明该药物的那些患者中。占优势的糖尿病类型为2型，其中演化中值为15年。溃疡大小在2cm²和大于20cm²之间变动。如所评述的，在所有患者中的常规疗法都是按照由古巴国家脉管学集团制定的用于DFU的治疗标准来进行的。

在表6中显示了关于在治疗开始后8至12周之间损伤闭合的结果。当比较包括每周一次施加的损伤内rhEGF的治疗程序与仅常规疗法时，令人惊讶地观察到更优异的结果，这支持在所述四组患者中施用所述生长因子。在所有用rhEGF进行治疗的组中损伤闭合都为60％至80％，而在仅接受常规疗法的组中在45％的个体中观察到损伤闭合。

表6.在与常规疗法相组合地损伤内施用rhEGF或者仅施加常规疗法之后损伤闭合的百分比

实施例5.在诊断为没有患病下肢截肢的DFU患者中每周一次施用可注射rhEGF的效应

为了确证每周一次施加的可注射rhEGF的损伤内施用对于DFU愈合所具有的效果，治疗在初始评价或诊断之时不具备患病下肢截肢标准的患者。

患者A：具有15年的糖尿病演化的62岁的男性糖尿病患者，其表现出具有下列特征的DFU：未达到足的深部层面的浅表损伤并且没有感染征候，其在体格检查时以及通过血液动力学参数和经皮氧压力(TcPO2)不具有中度或危急的局部缺血。在医治后损伤的大小为10cm²。以每周一次的频次，以75μg的剂量，向患者施加rhEGF两周，并且在该时间过后观察到损伤的完全闭合。

患者B：具有10年的糖尿病演化的54岁的男性糖尿病患者，其表现出具有下列特征的DFU：影响关节囊和韧带的深部损伤，但是没有感染也没有相关的骨髓炎，其在体格检查时以及通过血液动力学参数和TcPO2不具有中度或危急的局部缺血。溃疡的床体被大于75％的有用的肉芽形成组织覆盖。溃疡的大小为7cm²。每周一次以75μg的剂量施加rhEGF两周。在该时间结束时获得完全的肉芽形成应答，和在首次施加后9周时获得损伤闭合。

患者C：具有18年的糖尿病演化的68岁的女性糖尿病患者，其表现出具有下列特征的DFU：影响关节囊和韧带的深部损伤，但是没有感染和相关的骨髓炎，其在体格检查时以及通过血液动力学参数和TcPO2不具有中度或危急的局部缺血。溃疡的大小为7cm²。未向该患者施加rhEGF，但是用常规疗法进行治疗。对患者保持随访。在不存在用所述药品的治疗下，在14周时获得了完全的肉芽形成应答，和在20周时还未获得DFU的闭合。