本发明提供用于治疗癌症的用途、方法和组合物。
背景技术
一些凝集素是非免疫来源的糖蛋白，表现出诱导恶性细胞凋亡的能力，因此表现出抗癌特性。这种现象部分是通过这些凝集素与免疫细胞上特定聚糖受体的相互作用而发生的(Yau等，2015)。
一种这样的凝集素是来自槲寄生的槲寄生素(Viscumin)，它是一种与细胞受体结合的毒素，其中所述细胞受体被α2,6唾液酸乳糖糖基化(Müthing等，2002)。槲寄生素是57kDa的异源二聚体，包含两个亚基A和B。A亚基通过使核糖体失去功能来发挥其毒性作用，从而中断蛋白质的产生，而B亚基表现出聚糖结合功能。凝集素在体外和体内均显示出皮摩尔级的细胞毒性，并且临床试验受试者的推荐剂量上限为6μg/kg(半衰期为13分钟)(Zwierzina等，2011)。
另一种已证明能够阻止细胞迁移和生长(因此具有抗癌特性)的植物凝集素是山槐(Maackia amurensis)种子凝集素或MASL(Ochoa-Alvarez等人，2012年；Astarita等人，2012年)。这种凝集素还具有展示纳摩尔级效力(～300nM)的细胞毒性，并通过与平足蛋白(podoplanin)的结合而发挥其作用，平足蛋白是一种α2,3唾液酸化粘蛋白型跨膜糖蛋白，在多种人类癌症中过表达(Kato等人，2005年)；Schacht等人，2005年；Shibahara等人，2006)。
WO2018/055373描述了唾液酸结合分子(包括碳水化合物结合模块)在调节细胞生长的方法中和在治疗和/或预防细胞增殖和/或分化障碍中的用途。
细胞增殖和分化障碍(包括例如癌症)的治疗需要提供在宿主中耐受良好并具有治疗潜力的额外分子。
发明概述
本公开基于以下发现：一类称为碳水化合物结合模块(CBM)的糖(碳水化合物)结合蛋白可以调节细胞生长和/或细胞活性的各个方面。
因此，本公开提供了多种用途，包括包含本文所述CBM的分子的医学用途。
CBM通常作为较大酶(例如，碳水化合物活性酶，如糖苷酶)的一部分被发现，其中它们的作用是结合碳水化合物配体并将酶的催化结构域导向其底物。
本公开具体涉及属于以下组的那些CBM：
(i)碳水化合物结合模块家族32(CBM32)；
(ii)碳水化合物结合模块家族47(CBM47)
(iii)碳水化合物结合模块家族67(CBM67)
(iv)碳水化合物结合模块家族70(CBM70)
在这方面，本公开内容涉及来自上述所有CBM家族(CBM家族(i)-(iv))的CBM调节细胞生长和/或细胞活性的方面的发现。
如本文所用，术语“CBM32”、“CBM47”、“CBM67”和“CBM70”可以指包含一种或多种碳水化合物结合模块并且被归类为属于碳水化合物结合模块家族32、47、67和/或70的化合物、组合物或分子。本文使用的术语“CBM32”可以包括和/或包含在碳水化合物活性酶数据库(可在互联网上免费访问：http://www.cazy.org/)中被指定为属于CBM32家族的那些碳水化合物结合模块。此外，本文所用的术语“CBM47”、“CBM67”和“CBM70”可包括和/或包含在碳水化合物活性酶数据库(可在互联网上免费访问：http://www.cazy.org/)中被指定为属于CBM47、CBM67和CBM70家族的那些碳水化合物结合模块。
本公开可以包括分子例如包含CBM(例如CBM32、CBM47、CBM67和CBM70)的较大分子的用途。通过(非限制性)实例，本公开的分子不仅可以表现出结合唾液酸的能力，而且还可以具有一种或多种其他功能。例如，分子可具有酶活性。
在一些情况下，用于本文描述的各种用途的CBM可能不作为具有酶(例如唾液酸酶)活性的分子(例如融合蛋白)的一部分提供或包含在其中。
应当注意，贯穿本说明书，术语“包括(comprise)”、“包括(comprising)”和/或“包括(comprises)”用于表示本发明的方面和实施方案“包括”一个或多个特定特征。应当理解，这个/这些术语还可以涵盖“基本上由相关特征组成”或“由相关特征组成”的方面和/或实施方案。
因此，在本公开内容的上下文中，“CBM32”、“CBM47”、“CBM67”和/或“CBM70”可以包含归类为属于碳水化合物结合模块家族32、47、67和/或70的一个或多个分子，基本上由其组成，或由其组成。术语“CBM32”、“CBM47”、“CBM67”和/或“CBM70”可包括天然、野生型或参考CBM32s、CBM47s、CBM67s和/或CBM70s的片段或部分，任何此类片段或部分都应该是有功能的，也就是说，它们保留了它们所源自的天然、野生型或参考CBM32、CBM47、CBM67和/或CBM70的碳水化合物结合能力。
有用的CBM32可以来自任何合适的来源。例如，使用的CBM32可以从微生物获得，包括例如纤维弧菌属(Cellvibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、小单孢菌属(Micromonospora)、链球菌属(Streptococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacteria)和梭菌属(Clostridium)的细菌。例如，有用的CBM32可以从例如混合纤维弧菌(Cellvibrio mixtus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterolitica)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)和产绿小单胞菌(Micromonospora viridifaciens)获得或衍生。关于CBM32家族的来源、结构和功能的更多细节可以在碳水化合物活性酶数据库中找到(可在互联网上免费获得：http://www.cazy.org/CBM32.html)。
示例性CBM32序列由以下SEQ ID NO:1提供：
SEQ ID NO:1
因此，供使用的CBM可以包含具有SEQ ID NO：1的序列的CBM或其碳水化合物结合部分，基本上由其组成，或由其组成。
SEQ ID NO:1的碳水化合物结合片段可包含来自SEQ ID NO:1的约5、6、7、8、9或10个(连贯或连续)氨基酸至约138个(连贯或连续)氨基酸之间的任何位置。合适的片段可包含来自SEQ ID NO:1的约11、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130或约135个(连贯或连续)氨基酸。
CBM32或包含SEQ ID NO：1、基本上由SEQ ID NO：1组成或由SEQ ID NO：1组成的蛋白质可以结合例如半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和/或乳糖。因此，供使用的任何片段也可以结合半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和/或乳糖。本领域技术人员将理解，任何给定CBM32分子的结合亲和力可能取决于精确的CBM32亚型；作为进一步的实例，一些CBM32显示出对多种配体的亲和力(实例包括II型血型H-三糖(Fuca1-2Galb1-4GlcNAc)、N-乙酰基-D-乳糖胺(LacNAc)、半乳糖、乳糖-N-二糖、二糖GlcNAc-α-1,4-Gal(可称为其中α1,4连接到半乳糖的N-乙酰葡糖胺)和/或GlcNAc)。还应注意的是，多个CBM32亚型可能源自单个生物体；这些不同的CBM亚型可能表现出相同、相似或不同的结合特异性。例如，产气荚膜梭菌含有两种唾液酸酶NanJ和NanH；NanJ含有一种半乳糖特异性CBM32；NanH包含四个具有不同结合选择性的假定CBM32，例如，由NanH编码的CBM32结合GlcNAc。如本文所用，术语CBM32包括所有CBM32变体、衍生物和亚型。
SEQ ID NO:1源自以保藏在UniProt数据库中的如下ID号的序列：
A0A2X2YJF2。该序列被复制为下面的SEQ ID NO:2(SEQ ID NO:1显示为残基42-180，在下面的序列中加阴影)：
SEQ ID NO:2
SEQ ID NO 1和2源自产气荚膜梭菌。
用于本公开的各个方面的CBM可以包括一个、两个、三个、四个或更多个CBM32。
供使用的CBM可以包含一种、两种、三种、四种或更多种含有SEQ ID NO:1或其碳水化合物结合片段的蛋白质。
本领域技术人员将理解，有用的CBM32可包含与SEQ ID NO:1和2的CBM32序列表现出某种程度(例如，99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％或60％)的序列同一性或同源性的序列。所有此类变体或发散序列均包含在本公开内容的范围内并被术语“CBM32”所包含。相同和/或同源的CBM32序列可具有碳水化合物结合功能。
CBM47可以源自任何合适的来源。例如，供使用的CBM47可以从微生物获得，包括例如不动杆菌属(Acinetobacter)、贻贝属(Bathymodiolus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、浮霉菌属(Planctomycetes)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)的细菌。例如，有用的CBM47可以获得自或源自例如轻链球菌(Streptococcus mitis)或肺炎链球菌。关于CBM47家族的潜在来源和结构和功能的更多详细信息可以在碳水化合物活性酶数据库(可在互联网上免费获得：http://www.cazy.org/CBM47.html)中找到。
示例性CBM47序列由以下SEQ ID NO:3提供：
SEQ ID NO:3
因此，供使用的CBM可以包含具有SEQ ID NO：3的序列的CBM或其碳水化合物结合部分，基本上由其组成，或由其组成。
SEQ ID NO:3的碳水化合物结合片段可包含来自SEQ ID NO:3的约5、6、7、8、9或10个(连贯或连续)氨基酸至约144个(连贯或连续)氨基酸之间的任何位置。合适的片段可包含来自SEQ ID NO:3的约11、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130或约135、约140或约143个(连贯或连续)氨基酸。
CBM47或包含SEQ ID NO:3、基本上由SEQ ID NO:3组成或由SEQ ID NO:3组成的蛋白质可以结合L-岩藻糖、岩藻糖基乳糖、H-三糖和/或Lewisy抗原。因此，供使用的任何片段也可以结合L-岩藻糖、岩藻糖基乳糖、H-三糖和/或Lewisy抗原。
SEQ ID NO:3源自以保藏在UniProt数据库中的如下ID号的序列：
A0A1Q2T229。该序列被复制为下面的SEQ ID NO:4(SEQ ID NO:3显示为残基601-745，在下面的序列中加阴影)：
SEQ ID NO:4
SEQ ID NO 3和4源自肺炎链球菌。
用于本公开的各个方面的CBM可以包括一个、两个、三个、四个或更多个CBM47。
供使用的CBM可以包含一种、两种、三种、四种或更多种含有SEQ ID NO:3或其碳水化合物结合片段的蛋白质。
本领域技术人员将理解，有用的CBM47可包含与SEQ ID NO:3和4的CBM47序列表现出某种程度(例如，99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％或60％)的序列同一性或同源性的序列。所有此类变体或发散序列均包含在本公开内容的范围内并被术语“CBM47”所包含。相同和/或同源的CBM47序列可具有碳水化合物结合功能。
CBM67可以源自任何合适的来源。例如，供使用的CBM67可以从微生物获得，包括例如芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、浮霉菌属(Planctomycetes)和链霉菌属的细菌。例如，有用的CBM47可以获得自或源自例如除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)。关于CBM67家族的潜在来源和结构和功能的进一步详细信息可以在碳水化合物活性酶数据库(可在互联网上免费获得：http://www.cazy.org/CBM67.html)中找到。
示例性CBM67序列由以下SEQ ID NO:5提供：
SEQ ID NO:5
因此，供使用的CBM可以包含具有SEQ ID NO：5的序列的CBM或其碳水化合物结合部分，基本上由其组成，或由其组成。
SEQ ID NO:5的碳水化合物结合片段可包含来自SEQ ID NO:5的约5、6、7、8、9或10个(连贯或连续)氨基酸至约164个(连贯或连续)氨基酸之间的任何位置。合适的片段可包含来自SEQ ID NO:5的约11、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130、约135、约140、约145、约150、约155、约160或约163个(连贯或连续)氨基酸。
CBM67或包含SEQ ID NO:5、基本上由SEQ ID NO:5组成或由SEQ ID NO:5组成的蛋白质可以结合L-鼠李糖。因此，供使用的任何片段也可以结合L-鼠李糖。
SEQ ID NO:5源自以保藏在UniProt数据库中的如下ID号的序列：
Q82PP4。该序列被复制为下面的SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:5显示为残基132-296，在下面的序列中加阴影)：
SEQ ID NO:6
SEQ ID NO 5和6源自除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)。
用于本公开的各个方面的CBM可以包括一个、两个、三个、四个或更多个CBM67。
供使用的CBM可以包含一种、两种、三种、四种或更多种含有SEQ ID NO:5或其碳水化合物结合片段的蛋白质。
本领域技术人员将理解，有用的CBM67可包含与SEQ ID NO:5和6的CBM67序列表现出某种程度(例如，99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％或60％)的序列同一性或同源性的序列。所有此类变体或发散序列均包含在本公开内容的范围内并被术语“CBM67”所包含。相同和/或同源的CBM67序列可具有碳水化合物结合功能。
CBM70可以源自任何合适的来源。例如，供使用的CBM70可以从微生物获得，包括例如芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、浮霉菌属和链球菌属的细菌。例如，有用的CBM70可以获得自或源自例如肺炎链球菌。关于CBM70家族的潜在来源和结构和功能的进一步详细信息可以在碳水化合物活性酶数据库(可在互联网上免费获得：http://www.cazy.org/CBM70.html)中找到。
示例性CBM70序列由以下SEQ ID NO:7提供：
SEQ ID NO:7
因此，供使用的CBM可以包含具有SEQ ID NO：7的序列的CBM或其碳水化合物结合部分，基本上由其组成，或由其组成。
SEQ ID NO:7的碳水化合物结合片段可包含来自SEQ ID NO:7的约5、6、7、8、9或10个(连贯或连续)氨基酸至约158个(连贯或连续)氨基酸之间的任何位置。合适的片段可包含来自SEQ ID NO:7的约11、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130、约135、约140、约145、约150、约155或约157个(连贯或连续)氨基酸。
CBM70或包含SEQ ID NO:7、基本上由SEQ ID NO:7组成或由SEQ ID NO:7组成的蛋白质可以结合透明质酸。因此，供使用的任何片段也可以结合透明质酸。
SEQ ID NO:7源自以保藏在UniProt数据库中的如下ID号的序列：
Q54873。该序列被复制为下面的SEQ ID NO:8(SEQ ID NO:7显示为残基54-212，在下面的序列中加阴影)：
SEQ ID NO:8
SEQ ID NO 7和8源自肺炎链球菌。
用于本公开的各个方面的CBM可以包括一个、两个、三个、四个或更多个CBM70。
供使用的CBM可以包含一种、两种、三种、四种或更多种含有SEQ ID NO:7或其碳水化合物结合片段的蛋白质。
本领域技术人员将理解，有用的CBM70可包含与SEQ ID NO:7和8的CBM70序列表现出某种程度(例如，99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％或60％)的序列同一性或同源性的序列。所有此类变体或发散序列均包含在本公开内容的范围内并被术语“CBM70”所包含。相同和/或同源的CBM70序列可具有碳水化合物结合功能。
总之，用于本公开的各个方面和实施方案的分子可包含一个或多个CBM，例如一个或多个CBM32、一个或多个CBM47、一个或多个CBM67和/或一个或多个CBM70。
供使用的分子可以包含选自由以下各项组成的组的单一CBM：
单一CBM32；
单一CBM47；
单一CBM67；和
单一CBM70。
供使用的分子可以包含选自由以下各项组成的组的单一CBM：
单一CpCBM32；
单一SpCBM47；
单一SaCBM67；和
单一SpCBM70。
其中“Cp”是指产气荚膜梭菌，因此“CpCBM32”表示源自产气荚膜梭菌的CBM32部分；“Sp”表示肺炎链球菌，因此“SpCBM47”和“SpCBM70”表示源自肺炎链球菌的CBM47和/或CBM70部分；和“SaCBM67”表示源自除虫链霉菌的CBM67部分。
供使用的CBM可以包括多个或多个(即，两个或更多个)CBM。包含多个CBM的分子可称为“多价CBM”。多价CBM可以例如包含如上所述的两个或更多个CpCBM、两个或更多个SpCBM、两个或更多个SaCBM。多价CBM可包含不同CBM的混合物，例如一个或多个CpCBM与一个或多个Sp/SaCBM。
多价CBM分子(例如，包含两个或更多个CpCBM32部分的分子)可以制备为包含通过氨基酸/肽接头连接的多个CBM的构建体。每个CBM可以通过例如包含5、10或15个氨基酸的肽与另一个CBM连接。举例来说，以下肽中的任何一个或多个可用于连接两个或多个CBM以产生多价CBM：
(i)5个氨基酸的接头：
ALNGS(SEQ ID NO:9)
LQALG(SEQ ID NO:10)
GGNSG(SEQ ID NO:11)
GGGSG(SEQ ID NO:12)
GGSLG(SEQ ID NO:13)
GGGSA(SEQ ID NO:14)
(ii)10个氨基酸的接头：
ALNGSGGGSG(SEQ ID NO:15)
LQALGGGGSL(SEQ ID NO:16)
(iii)15个氨基酸的接头：
ALNGSGGGSGGGGSG(SEQ ID NO:17)
因此，本公开的各个方面和实施方案(用途、供使用的CBM、方法和药物)可以利用包含选自由以下各项组成的组的CBM(由其组成或基本上由其组成)的分子：
(i)一个或多个CpCBM32；
(ii)一个或多个SpCBM47；
(iii)一个或多个SaCBM67；和
(iv)一个或多个SpCBM70。
供使用的分子可进一步包含寡聚化结构域。合适的寡聚化结构域可表现出自缔合形成多聚体结构例如三聚体的能力。供使用的寡聚化结构域可以包含具有上述寡聚化特性的任何分子或其任何功能片段。例如，一个或多个(例如两个)CBM分子可以结合至、偶联至或融合至寡聚化结构域，然后所得的CBM分子::寡聚化结构域“融合”(具有一个或多个其他这样的“融合”)可用作用于调节细胞生长和/或活性和/或用于治疗或预防本文公开的任何疾病和/或病况的分子。
合适的寡聚化结构域可以源自例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)假胺酶(pseudaminidase)。示例性铜绿假单胞菌假胺酶序列氨基酸序列已以保藏号PAO579保藏，并在下文复制为SEQ ID NO：18(438个氨基酸)。
SEQ ID NO:18的寡聚化结构域是从氨基酸残基333到438(灰色突出显示)，该序列是SEQ ID NO:19。
因此，供使用的寡聚化结构域可包含由SEQ ID NO:18提供的铜绿假单胞菌假胺酶三聚化结构域(PaTD)的从约残基250、275、300、310、320、333、340至350(即约残基250至约残基350，包括其间的约任何残基)至约残基400、410、420、430或438(即从约残基400到残基438的约任何残基，包括至其间的约任何残基)。例如，有用的分子可以利用包含SEQ ID NO:18的残基333至438的寡聚化结构域。
下面描述了用于本公开的各个方面和实施方案中的其他分子。
一种供使用的分子被命名为“Cp2CBM32TD”，该构建体包含Cp2CBM32单元，该单元本身包含2个源自产气荚膜梭菌的CBM32分子(灰色突出显示)，其中2个CBM32拷贝通过短肽接头分子(虚线下划线)串联连接。该构建体进一步包含三聚化结构域(TD：下划线)，其自身通过另一个短接头部分(粗下划线)与两个CBM32之一融合。示例性Cp2CBM32TD的序列在下面提供为SEQ ID NO:19。
SEQ ID NO:19
一种供使用的分子被命名为“Sp2CBM47TD”，该构建体是Sp2CBM47单元，该单元本身包含2个源自肺炎链球菌的CBM47分子(灰色突出显示)，其中2个CBM47拷贝通过短肽接头分子(虚线下划线)串联连接。该构建体进一步包含三聚化结构域(TD：下划线)，其自身通过另一个短接头部分(粗下划线)与两个CBM47之一融合。示例性Sp2CBM47TD的序列在下面提供为SEQ ID NO:20。
SEQ ID NO:20
一种供使用的分子被命名为“Sa2CBM67TD”，该构建体包含Sa2CBM67单元，该单元本身包含2个源自除虫链球菌的CBM67分子(灰色突出显示)，其中2个CBM67拷贝通过短肽接头分子(虚线下划线)串联连接。该构建体进一步包含三聚化结构域(TD：下划线)，其自身通过另一个短接头部分(粗下划线)与两个CBM67之一融合。示例性Sa2CBM67TD的序列在下面提供为SEQ ID NO:21。
SEQ ID NO:21
一种供使用的分子被命名为“Sp2CBM70TD”，该构建体包含Sp2CBM70单元，该单元本身包含2个源自肺炎链球菌的CBM70分子(灰色突出显示)，其中2个拷贝的CBM70通过短肽接头分子(虚线下划线)串联连接。该构建体进一步包含三聚化结构域(TD：下划线)，其自身通过另一个短接头部分(粗下划线)与两个CBM70之一融合。示例性Sp2CBM70TD的序列在下面提供为SEQ ID NO:22。
SEQ ID NO:22
在第一方面，本文公开的各种分子可用于治疗。进一步地，本文公开的各种分子可用作药物。在这方面的上下文中，读者应当理解，“本文公开的分子”至少包括以下内容：
(i)包含一个或多个CBM32的分子；
(ii)包含一个或多个CBM47的分子；
(iii)包含一个或多个CBM67的分子；
(iv)包含一个或多个CBM70的分子；
(v)包含Cp2CBM32TD的分子；
(vi)包含Sp2CBM47TD的分子；
(vii)包含Sa2CBM67TD的分子；和
(viii)包含Sp2CBM70TD的分子；
一方面，提供了用于调节细胞生长和/或细胞活性的方法中的包含CBM32的分子。包含CBM32的分子可以包含Cp2CBM32TD或者是Cp2CBM32TD。
在另一方面，提供了用于调节细胞生长和/或细胞活性的方法中的包含CBM47的分子。包含CBM47的分子可以包含Sp2CBM47TD或者是Sp2CBM47TD。
在进一步的方面，提供了用于调节细胞生长和/或细胞活性的方法中的包含CBM67的分子。包含CBM67的分子可以包含Sa2CBM67TD或者是Sa2CBM67TD。
另外，提供了用于调节细胞生长和/或细胞活性的方法中的包含CBM70的分子。包含CBM70的分子可以包含Sp2CBM70TD或者是Sp2CBM70TD。
另一方面，提供了调节细胞生长和/或活性的方法，所述方法包括将细胞与包含CBM32的分子接触。该方法可以是体外方法。包含CBM32的分子可以包含Cp2CBM32TD或者是Cp2CBM32TD。
另外的方面提供了调节细胞生长和/或活性的方法，所述方法包括将细胞与包含CBM47的分子接触。该方法可以是体外方法。包含CBM47的分子可以包含Sp2CBM47TD或者是Sp2CBM47TD。
进一步的方面提供了调节细胞生长和/或活性的方法，所述方法包括将细胞与包含CBM67的分子接触。该方法可以是体外方法。包含CBM67的分子可以包含Sa2CBM67TD或者是Sa2CBM67TD。
另一方面提供了调节细胞生长和/或活性的方法，所述方法包括将细胞与包含CBM70的分子接触。该方法可以是体外方法。包含CBM70的分子可以包含Sp2CBM70TD或者是Sp2CBM70TD。
如上所述，“包含CBM32的分子”、“包含CBM47的分子”、“包含CBM67的分子”和/或“包含CBM70的分子”可基本上由各自的CBM32、CBM47、CBM67或CBM70组成，或可由各自的CBM32、CBM47、CBM67或CBM70组成。
上述方面中提及的分子的CBM32、CBM47、CBM67或CBM70组分可包含完整的野生型CBM32、CBM47、CBM67或CBM70序列(如以上SEQ ID NO:1-8中的每一个所提供的)。另外地或备选地，本公开的各个方面可以利用本文公开的任何CBM32、47、67或70序列(包括SEQ ID NO:1-8的序列)的碳水化合物结合片段。
应当注意，术语CBM32、CBM47、CBM67或CBM70进一步包括从参考CBM32、CBM47、CBM67或CBM70序列(包括SEQ ID NO:1-8)生成的重组分子。同样，这些重组分子可包含全长CBM32、CBM47、CBM67或CBM70序列或其碳水化合物结合片段。
为方便起见，术语CBM32/47/67/70将用于指所有上述CBM分子(这些分子包含一个或多个CBM32，一个或多个CBM47，一个或多个CBM67或一个或多个CBM70，或任何这些的碳水化合物结合片段，基本上由其组成，或由其组成。
术语“调节”可包括细胞生长和/或活性的一个或多个方面的任何增加或减少。换言之，本文所述的分子(例如，包含一个或多个种CBM32/47/67/70的分子)可以抑制细胞生长和/或活性的某些方面，或者可以诱导或刺激细胞生长和/或活性的其他方面。
应用于细胞的术语“生长”和“活性”可以包括与细胞增殖、细胞成活力、细胞迁移、细胞代谢、细胞分化和/或细胞形态/表型中的一种或多种相关的过程和/或现象。术语“生长”和/或“活性”可进一步包括细胞对某些外源性和/或内源性因素或刺激的反应，包括例如对免疫系统的某些化合物、细胞因子、趋化因子和一种或多种环境因素(光、温度、压力、机械应力等)的反应。因此，本文公开的CBM32/47/67/70分子可用于调节(抑制、降低或增加)细胞反应性水平。
鉴于CBM32/47/67/70已显示调节细胞生长和活性(如上所述)，应理解这些分子可用于许多相关的医学和兽医应用和用途。
例如，包含一个或多个CBM32/47/67/70的分子可用于治疗和/或预防异常细胞生长和/或异常细胞活性是其中的因素的疾病或病况。
本文公开了一种包含CBM32/47/67/70的分子，用于治疗和/或预防由异常细胞生长和/或活性引起、促成和/或表征的疾病和/或病况。包含CBM32/47/67/70的分子可选自由以下各项组成的组：
(i)包含一个或多个CpCBM32的分子；
(ii)包含一个或多个SpCBM47的分子；
(iii)包含一个或多个SaCBM67的分子；
(iv)包含一个或多个SpCBM70的分子；
(v)包含Cp2CBM32TD的分子；
(vi)包含Sp2CBM47TD的分子；
(vii)包含Sa2CBM67TD的分子；和
(viii)包含Sp2CBM70TD的分子。
此外，公开了包含CBM32/47/67/70的分子在制备用于治疗和/或预防由异常细胞生长和/或活性引起、促成和/或表征的疾病和/或病况的药物中的用途。
包含CBM32/47/67/70的分子可选自由以下各项组成的组：
(i)包含一个或多个CpCBM32的分子；
(ii)包含一个或多个SpCBM47的分子；
(iii)包含一个或多个SaCBM67的分子；
(iv)包含一个或多个SpCBM70的分子；
(v)包含Cp2CBM32TD的分子；
(vi)包含Sp2CBM47TD的分子；
(vii)包含Sa2CBM67TD的分子；和
(viii)包含Sp2CBM70TD的分子。
本公开还提供了治疗和/或预防由异常细胞生长和/或活性引起、促成和/或表征的疾病和/或病况的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含CBM32/47/67/70的分子的步骤。包含CBM32/47/67/70的分子可选自由以下各项组成的组：
(i)包含一个或多个CpCBM32的分子；
(ii)包含一个或多个SpCBM47的分子；
(iii)包含一个或多个SaCBM67的分子；
(iv)包含一个或多个SpCBM70的分子；
(v)包含Cp2CBM32TD的分子；
(vi)包含Sp2CBM47TD的分子；
(vii)包含Sa2CBM67TD的分子；和
(viii)包含Sp2CBM70TD的分子。
由异常细胞生长和/或活性引起、促成或表征的疾病可以包括例如细胞增殖病症，包括被称为或归类为良性或恶性病况的那些。例如，术语“细胞增殖病症”可以包括统称为“癌症”的那些疾病和/或病况。术语“癌症”可以包括但不限于被称为乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、胶质瘤和黑色素瘤的那些癌症。特别地，术语癌症(或细胞增殖病症)可能涉及结肠癌、肺癌和卵巢癌。
术语“癌症”还可包括统称为“白血病”(慢性和急性)的那些疾病和/或病况以及影响粘膜/粘膜相关表面或组织的任何癌症。
因此，本文所述的包含CBM32/47/67/70的分子可用于治疗和/或预防癌症。包含CBM32/47/67/70的分子可选自由以下各项组成的组：
(i)包含一个或多个CpCBM32的分子；
(ii)包含一个或多个SpCBM47的分子；
(iii)包含一个或多个SaCBM67的分子；
(iv)包含一个或多个SpCBM70的分子；
(v)包含Cp2CBM32TD的分子；
(vi)包含Sp2CBM47TD的分子；
(vii)包含Sa2CBM67TD的分子；和
(viii)包含Sp2CBM70TD的分子。
因此，提供了用于治疗和/或预防癌症的包含CBM32/47/67/70的分子。包含CBM32/47/67/70的分子可选自由以下各项组成的组：
(i)包含一个或多个CpCBM32的分子；
(ii)包含一个或多个SpCBM47的分子；
(iii)包含一个或多个SaCBM67的分子；
(iv)包含一个或多个SpCBM70的分子；
(v)包含Cp2CBM32TD的分子；
(vi)包含Sp2CBM47TD的分子；
(vii)包含Sa2CBM67TD的分子；和
(viii)包含Sp2CBM70TD的分子。
此外，提供了包含CBM32/47/67/70的分子在制备用于治疗和/或预防癌症的药物中的用途。包含CBM32/47/67/70的分子可选自由以下各项组成的组：
(i)包含一个或多个CpCBM32的分子；
(ii)包含一个或多个SpCBM47的分子；
(iii)包含一个或多个SaCBM67的分子；
(iv)包含一个或多个SpCBM70的分子；
(v)包含Cp2CBM32TD的分子；
(vi)包含Sp2CBM47TD的分子；
(vii)包含Sa2CBM67TD的分子；和
(viii)包含Sp2CBM70TD的分子。
还提供了治疗和/或预防癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含CBM32/47/67/70的分子的步骤。包含CBM32/47/67/70的分子可选自由以下各项组成的组：
(i)包含一个或多个CpCBM32的分子；
(ii)包含一个或多个SpCBM47的分子；
(iii)包含一个或多个SaCBM67的分子；
(iv)包含一个或多个SpCBM70的分子；
(v)包含Cp2CBM32TD的分子；
(vi)包含Sp2CBM47TD的分子；
(vii)包含Sa2CBM67TD的分子；和
(viii)包含Sp2CBM70TD的分子。
除了包含CBM32/47/67/70的分子可用于治疗和/或预防癌症的普遍发现之外，包含一个或多个CBM32的分子可特别应用于治疗和/或预防一些特定的癌症。
因此，本公开内容进一步提供了包含一个或多个CBM32的分子，其用于治疗和/或预防选自由以下各项组成的组的癌症：
(a)卵巢癌；
(b)肺癌；
(c)结肠癌；和
(d)乳腺癌。
鉴于以上，本公开提供：
(i)包含一个或多个CBM32的分子，其用于治疗和/或预防癌症；
(ii)包含一个或多个CBM32的分子在制备用于治疗和/或预防癌症的药物中的用途；和
(iii)通过向有需要的受试者施用治疗有效量的包含一个或多个CBM32的分子来治疗和/或预防癌症的方法，
其中对于(i)、(ii)和(iii)中的每一个，癌症是选自由以下各项组成的组中的一种或多种：
(a)卵巢癌；
(b)肺癌；
(c)结肠癌；和
(d)乳腺癌。
换句话说，除了可用于治疗和/或预防这些单独癌症中的每一种之外，本文公开的每个CBM32还可用于治疗和/或预防癌症(a)至(d)的两种、三种或所有四种。
用于治疗和/或预防癌症(a)至(d)中的任何一种、两种、三种或所有四种的合适的CBM32可以包括任何本文公开的那些CBM32。仅举例来说，在一些情况下，用于此类方法的分子可选自由以下各项组成的组：
(i)包含一个、两个或多个CBM32的分子；
(ii)包含一个、两个或多个CpCBM32的分子；
(iii)包含一个、两个或更多个含有SEQ ID NO:1、2的序列的肽，或其碳水化合物结合部分的分子；和
(iv)包含CpCBM32TD的分子。
虽然本发明人已鉴定CBM32具有针对广泛范围的癌症的普遍功效，但在一些情况下，包含一个或多个CBM32的分子可能不会表现出针对某些特定癌症类型的相同水平的功效。因此，对于包含一个或多个CBM32的分子，癌症的治疗和/或预防可以排除对选自黑色素瘤、胰腺癌和胶质瘤的一种或多种癌症的治疗。
本公开还提供了包含CBM32和/或CBM40的分子，其用于治疗和/或预防难治性(或抗性)癌症。
除了本文已经描述的CBM32之外，供使用的示例性CBM40可以包含霍乱弧菌(Vibrio cholerae)NanH唾液酸酶的唾液酸结合结构域(VcCBM:一种CBM40)和/或来自肺炎链球菌NanA唾液酸酶的等效(或同源)结构域(SpCBM:也是CBM40)。当然，存在于其他生物体中的类似或同源的唾液酸结合模块也包含在术语“CBM”和“CBM40”的范围内。示例性霍乱弧菌NanH唾液酸酶氨基酸序列以保藏号A5F7A4保藏，并在下面复制为SEQ ID NO:23(781个氨基酸)。
SEQ ID NO:23的CBM区是从氨基酸残基25到216，这个序列可以是SEQ ID NO:24。
示例性肺炎链球菌NanA唾液酸酶氨基酸序列已以保藏号P62575保藏，并在下面复制为SEQ ID NO:25(1035个氨基酸)。
SEQ ID NO:25的CBM区是从氨基酸残基121至305，这个序列可以是SEQ ID NO:26。
因此，用于治疗难治性癌症的分子可包含具有SEQ ID NO：23或24的序列的蛋白质或肽或其唾液酸结合片段。例如，有用的唾液酸结合分子可以包含由霍乱弧菌的nanH基因(编码唾液酸酶)的唾液酸结合结构域编码的蛋白质部分(如SEQ ID NO：23提供)或存在于另一生物体中的等效或同源基因(例如，肺炎链球菌的等效/同源nanA唾液酸酶基因：参见SEQ ID NO:25)。用于治疗难治性癌症的CBM40可包含SEQ ID NO:23或24的霍乱弧菌唾液酸酶分子的自约残基1、5、10、15、25或30(即，自1-30或自其间的任何氨基酸残基)至约残基150、175、200、210、216、220-781(至自150至781的任何残基，包括其间的任何残基)。例如，用于治疗难治性癌症的CBM40可包含具有对应于上述SEQ ID NO：23的残基25至约216残基的序列的肽。
用于治疗难治性癌症的进一步的合适的CBM40可包含具有SEQ ID NO：25或26的序列的蛋白质或肽或其唾液酸结合片段。例如，有用的可包含由肺炎链球菌nanA基因(编码唾液酸酶)的唾液酸结合结构域编码的蛋白质部分。用于治疗癌症的CBM40可包含SEQ ID NO:25和26的肺炎链球菌唾液酸酶分子的自约残基80、90、100、110、120、121至130(即自任何约残基80至130，包括其间的任何残基)至约残基250、275、300、305、310、320-1035(即至自约250-1035的任何残基，包括至其间的约任何残基)。例如，供使用的CBM40可以包含具有对应于上述SEQ ID NO：25的残基121至约305残基的序列的肽。
本领域技术人员将理解，有用的CBM40可包含与SEQ ID NO：23、24、25和26的CBM40序列表现出某种程度(例如，99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％或60％)的序列同一性或同源性的序列。所有此类变体或发散序列均包含在本公开内容的范围内并被术语“CBM40”所包含。相同和/或同源的CBM40序列可具有碳水化合物结合功能。
用于治疗难治性癌症的分子可包含一个或多个CBM40。分子可以包含单一或单个CBM40，例如单一VcCBM40或单一SpCBM40。或者，共使用的分子可包含多个或多个(即两个或多个)CBM40。包含多个CBM的分子可称为“多价”分子或CBMs。多价CBM可以例如包含两个或更多个VcCBM40或两个或更多个SpCBM40。多价CBM可包含不同CBM的混合物，例如一个或多个VcCBM与一个或多个SpCBM。
用于治疗难治性(或抗性)癌症的包含CBM32和/或CBM40的分子可以选自由以下各项组成的组：
(i)包含一个或多个CpCBM32的分子；
(ii)包含Cp2CBM32TD的分子；
(iii)包含Vc2CBM40TD的分子；和
(iv)包含Sp2CBM40TD的分子。
此外，本公开提供了包含CBM32和/或CBM40的分子在制备用于治疗难治性(或抗性)癌症的药物中的用途。包含CBM32和/或CBM40的分子可以选自由以下各项组成的组：
(i)包含一个或多个CpCBM32的分子；
(ii)包含Cp2CBM32TD的分子；
(iii)包含Vc2CBM40TD的分子；和
(iv)包含Sp2CBM40TD的分子。
还公开了治疗难治性(或抗性)癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含CBM32和/或CBM40的分子。包含CBM32和/或CBM40的分子可以选自由以下各项组成的组：
(i)包含一个或多个CpCBM32的分子；
(ii)包含Cp2CBM32TD的分子；
(iii)包含Vc2CBM40TD的分子；和
(iv)包含Sp2CBM40TD的分子。
有需要的受试者或实际上要施用本文公开的分子或包含该分子的药物的受试者可以是患有(或怀疑患有)以下疾病的任何受试者：(i)细胞增殖病症，(ii)癌症，(iii)本文所述的任何其他疾病和/或病况；(iv)由异常细胞生长和/或活性引起、促成或表征的疾病或病况；(v)一种或多种选自由(a)乳腺癌、(b)结肠癌、(c)肺癌、(d)卵巢癌、(e)胶质瘤和(f)黑色素瘤的癌症组成的组的癌症；(vi)一种或多种选自由(a)肺癌、(b)结肠癌和(c)卵巢癌；和/或(v)难治性(或抗性)癌症组成的组的癌症。
另外或备选地，任何受试者可以是倾向于患有或易患有以下疾病的受试者：(i)细胞增殖病症，(ii)癌症，(iii)本文所述的任何其他疾病和/或病况；(iv)由异常细胞生长和/或活性引起、促成或表征的疾病或病症；(v)一种或多种选自由(a)乳腺癌；(b)结肠癌；(c)肺癌；(d)卵巢癌；(e)胶质瘤和(f)黑色素瘤组成的组的癌症：或(vi)一种或多种选自由(a)肺癌，(b)结肠癌的癌症；和(c)卵巢癌组成的组的癌症。
难治性或抗性癌症可包括对一线或优选药物(包括标准或优选化疗或放疗选择)无反应的癌症。难治性或抗性癌症可包括对顺铂有抗性(或无反应)的那些癌症。术语难治性癌症或抗性癌症可包括难治性或抗性卵巢癌。术语难治性(卵巢)癌和抗性(卵巢)癌可包括对顺铂具有抗性的卵巢癌。
因此，本公开提供(i)包含一个或多个CpCBM32的分子；(ii)包含Cp2CBM32TD的分子；(iii)包含Vc2CBM40TD的分子；和/或(iv)包含Sp2CBM40TD的分子，其用于治疗难治性(或抗性)卵巢癌。
应当理解，本文所述的任何治疗可涉及使用本公开的一种或多种分子来治疗、改善或减轻本文所述的各种疾病和病症的一种或多种症状。举例来说，诸如癌症的疾病的症状可以包括例如肿瘤和/或细胞团块的存在。因此，本文所述的分子可用于调节(例如停止、延迟、抑制或减少)肿瘤形成和/或其转移。这些分子还可用于减小肿瘤的整体大小。某些肿瘤，包括那些大的和/或侵袭性的，如果它们首先减小了尺寸，通常更容易通过手术切除。通常，基于化学和/或放射疗法的治疗可用于减小肿瘤的大小，但此类治疗可被基于使用包含CBM32/47/67/70的分子的治疗替代和/或补充。如上所述，包含CBM32/47/67/70的分子表现出调节细胞生长和/或活性的能力，因此，不希望受理论束缚，支持任何一种公开分子影响肿瘤大小的能力的机制可能源于该分子的细胞增殖、分化和/或代谢调节作用。
鉴于上述情况，因此肿瘤的成功治疗的特征在于肿瘤大小的减小，肿瘤转移、致瘤组织内的血管生成和/或组织侵袭的观察的或可检测/检测水平的降低。
本公开的分子可用于在有需要的受试者中调节(例如抑制、限制或减少)肿瘤生长、发展和/或转移的方法中。本文所述的分子可以配制为用于调节肿瘤生长、发展和/或转移的组合物，或用于制造药物以实现这些目的。本公开还提供了用于治疗肿瘤的包含CBM32/47/67/70的分子。此外，描述了包含CBM32/47/67/70的分子在制造用于治疗肿瘤的药物中的用途。此外，本公开提供了治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者(或致瘤组织)施用包含CBM32/47/67/70的分子。
如前所述，术语“有需要的受试者”可以包括怀疑患有肿瘤或被诊断患有肿瘤的任何受试者和/或被鉴定为倾向于患有肿瘤和/或易于患有肿瘤的受试者。术语“肿瘤”可包括难治性或抗性肿瘤。术语肿瘤可包括难治性或抗性卵巢癌肿瘤。
因此，本公开提供了包含CBM32/47/67/70并且已被鉴定为细胞生长和/或活性调节剂的分子的各种应用。任何给定的分子(包括CBM32/47/67/70)都可以通过本专利申请的实施例部分中描述的各种实验和测定法被鉴定为细胞生长和/或活性的调节剂。例如，细胞伤口划痕测定是可适用于确定任何给定的“测试”分子是否表现出调节细胞生长、细胞迁移和/或活性的必要能力的测定法的一个实例。另外或备选地，BrdU细胞增殖测定可用于确定测试试剂(例如，包含CBM32/47/67/70的分子)对细胞增殖、生长和/或活性的任何影响。简而言之，细胞可以在补充有BrdU的培养基中培养，随着细胞的生长和增殖，BrdU被掺入到从头合成的DNA中，作为胸苷的替代品。这将标记子代细胞，并且BrdU掺入量可用作细胞增殖/生长的量度或指标。BrdU检测可以通过使用对BrdU具有特异性或亲和力的抗体来实现。
在其他情况下，基于代谢的测定，例如2.0Assay(2.0)可用于确定测试试剂(例如，包含CBM32/47/67/70的分子)对细胞增殖、生长和/或活性的任何影响。在此类测定中，可评估ATP(三磷酸腺苷)的量以确定代谢活性细胞的数量(并且因此可提供活细胞的量度)。用测试试剂处理后的活细胞数可用作细胞增殖/生长的量度或指标。
备选地或另外地，基于DNA染色的测定例如直接细胞增殖测定可用于确定测试试剂(例如，包含CBM32/47/67/70的分子)对细胞增殖、生长和/或活性的任何影响。在这样的测定中，活细胞的数量可以使用DNA染色(例如，细胞可渗透的DNA结合染料)来确定。再次，用测试试剂处理后的活细胞数可用作细胞增殖/生长的量度或指标。
因此，本公开可以涉及那些通过细胞活性调节测定(例如，细胞伤口划痕测定)表现出调节细胞生长和/或活性的能力的分子。为此，本公开内容进一步提供了鉴定用于调节细胞生长和/或活性的方法中或用于本文所述的各种医学和/或兽医应用的分子(包括含有CBM32/47/67/70的分子)的方法，所述方法包括使测试化合物经受能够报告测试化合物对细胞生长和/或活性的影响的测定，其中所述测试化合物是包含CBM32/47/67/70的分子，并且如果该测定报告该化合物具有对细胞生长和/或活性的任何方面的影响，则该化合物可用于治疗和/或预防本文所述类型的疾病和/或病况。能够报告测试化合物对细胞生长和/或活性的影响的测定可以是细胞伤口划痕测定、BrdU型、2.0型和/或直接细胞增殖测定，如本文所述。
包含CBM32/47/67/70的分子可以进一步用作分子，这些分子可以与其他实体缀合、结合或连接或缔合，目的是将该实体靶向或递送至一些组织或细胞。
这种类型的分子可以另外称为“治疗弹头”或“缀合物”。不希望受理论束缚，在某些细胞受体和膜结合分子中的可包含在本公开分子(例如CBM32、CBM47、CBM67和/或CBM70)内的各种CBM的配体的存在，可以允许本文所述的各种分子被用作将缀合的异源分子(即，不同于包含CBM32/47/67/70的分子的分子)递送至所述细胞或包含所述细胞的组织的手段。这样的缀合分子可用于治疗癌症，其中本文所述的分子(这些分子表现出对在细胞表面上表达的碳水化合物的亲和力)可用于将治疗性和/或细胞毒性部分引导到其上。
例如，本文所述的分子(包括任何CBM32/47/67/70分子)可以与一个或多个(例如，两个、三个、四个或更多个)部分(例如，治疗性和/或细胞毒性)缀合。因此，本公开内容涉及CBM32/47/67/70分子缀合物。
CBM32/47/67/70分子缀合物可包含与异源部分缀合(连接、结合或以其他方式缔合)的本公开内容的CBM32/47/67/70分子。异源部分可包含治疗性和/或细胞毒性部分，其可缀合至CBM32/47/67/70分子的某些部分。
例如，异源部分可以与CBM32/47/67/70分子的一端或两端缀合。异源部分可以额外地或备选地缀合(或甚至融合)至CBM32/47/67/70分子的内部部分。应理解的是，然而异源部分与CBM32/47/67/70分子缀合，该分子(或其缀合)不应(基本上)干扰或消融或降低CBM32/47/67/70分子的碳水化合物结合特性。
如上所述，异源部分可以是用于治疗影响表达受体的细胞或组织的疾病的药物，所述受体包含CBM32、CBM47、CBM67或CBM70分子中任一种的配体。例如，药物可以是用于治疗癌症的化疗药物等。异源部分可以是能够杀死细胞或诱导细胞凋亡的细胞毒性部分。异源部分可以包含能够将特定细胞募集到特定组织或募集到特定组织内的分子。例如，异源部分可以是例如T细胞受体(TCR)，其可以用作将T细胞募集到例如肿瘤或癌组织的手段。
本公开可提供用于本文所述的各种用途、药物和方法的组合物。因此，可以配制本文所述的包含CBM32/47/67/70的任何分子以供使用。
为方便起见，并参考以下描述组合物、制剂等的部分，应注意本文所述的包含CBM32/47/67/10的分子和包含其的任何缀合物(例如，CBM32/47/67/70::药物缀合物/融合物)均应包括在通用术语“包含CBM32/47/67/70的分子”下。
可以配制包含CBM32/47/67/70的分子以供使用和作为治疗性组合物或药物组合物。各种组合物可包含一种或多种本文所述的分子，并且任何给定的治疗可能需要(一起、同时或分别)施用一种或多种这些组合物。应当注意，根据本公开的组合物可进一步包含一种或多种其他治疗部分(例如，可用于治疗一种或多种疾病和/或病况的分子、小分子、抗体、寡核苷酸等)。此外或备选地，包含CBM32/47/67/70的分子可以与一种或多种其他(不同)治疗实体一起施用，其中所述一种或多种其他(不同)治疗实体可以用于治疗相同或不同的疾病。术语“一起施用”包括在施用一种或多种其他治疗实体之前、之后和/或同时施用CBM32/47/67/70。
本文所述的分子可以配制用于肠内(包括口服)、肠胃外和/或局部给药，并且本领域技术人员将理解精确的制剂可以根据给药途径而变化。
本发明的药物组合物可以常规制备，其包含在药物中通常使用的和描述于例如Remington’s The Sciences and Practice of Pharmacy,第22版(Pharmaceutical Press 2012)and/or Handbook of Pharmaceutical Excipients,第7版(由Rowe等人编译,Pharmaceutical Press,2012)(所有这些文件和参考文献的全部内容通过引用纳入本文)中的物质。
本公开的治疗或药物组合物(即包含含有CBM32/47/67/70的分子并用于本文所述的任何药物或方法(包括用于调节细胞生长和/或活性和/或治疗癌症的方法或药物)的组合物)可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体、佐剂和缓冲剂一起配制。组合物可以被施用，例如通过口服(包括粘膜)、肠胃外、腹膜内、肠内、肌肉内、皮下、静脉内或通过任何其他用于实现预期效果的途径(在这种情况下，效果包括调节细胞生长/活性，治疗或预防与细胞生长/活性相关的疾病/病况和/或癌症和/或调节肿瘤生长)。如上所述，根据所选择的施用途径，制剂的确切组成可能会有所不同。
包含含有CBM32/47/67/70的分子并用于施用于受试者的治疗制剂或药物制剂可以被包被、胶囊化或封装在保护分子免受可能会使化合物和/或其碳水化合物结合特性失活或变性的酶、酸和其他天然化合物/条件(包括，例如，化合物(包括抗体)、免疫系统的细胞和过程)作用的材料中。
在可用于包含本文所述分子的组合物中的各种标准和常规赋形剂中，有那些药学上可接受的有机或无机载体物质，它们适用于肠胃外、肠内、口服(包括粘膜)和其他施用途径，不会与包含CBM32/47/67/70的分子发生有害反应。
当包含CBM32/47/67/70的分子被配制用于肠胃外施用时，组合物可以是无菌的。
该组合物可包含油基或水溶液、悬浮液和/或乳液。
在其他实施方案中，组合物可以采用植入物的形式，例如(可溶解的或可生物降解的)薄膜、子宫托或植入物(包括栓剂)。
包含本文所述分子的药物制剂可以与稳定剂、润湿剂、乳化剂、盐(用于影响渗透压)、缓冲剂和/或不与活性化合物发生有害反应的其他物质混合。
一种或多种本文所述的分子可以被配制用于口服并口服施用。如上所述，口服施用包括粘膜施用，粘膜施用本身包括鼻内施用和/或吸入施用。
供使用的组合物可包括适合口服施用的固体剂型。这些可以包括例如胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在任何给定的固体剂型中，包含CBM32/47/67/70的分子(或包含其的任何缀合物)可以与至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂混合。合适的赋形剂的实例是本领域技术人员已知的，但可以包括例如填充剂或延伸剂(extender)、湿润剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、溶液阻滞剂、吸收促进剂、吸附剂、润滑剂或它们的混合物。片剂、丸剂或胶囊还可包含缓冲剂。固体剂型例如片剂、糖衣丸、胶囊剂、丸剂和/或颗粒剂也可以制备有包衣和外壳，例如保护免受胃肠环境和/或胃酸的包衣。
固体剂型可以含有乳浊剂并且也可以被配制以确保活性剂(在这种情况下，包含CBM32/47/67/70的分子或包含其的缀合物)在其肠道的特定部位中或向其肠道的特定部位延迟释放。
用于口服施用的固体组合物可以配制成单位剂型，每个剂量含有适当剂量的包含CBM32/47/67/70的分子(或包含其的缀合物)。包含在任何给定固体剂型中的包含CBM32/47/67/70的分子(或包含其的缀合物)的确切量将根据预期用途而变化。固体组合物可包含“单位剂量”，即，包含一定量的包含CBM32/47/67/70的分子(或包含其的缀合物)的单位剂量，该量经计算可在治疗期间产生所需效果(例如调节细胞生长和/或活性)。
用于口服施用的液体剂型可以(如所述)包括乳剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂和酏剂。除化合物或组合物外，液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂。
可以以任何合适的量使用任何公开的分子。如上所述，酸分子可以配制用于口服、粘膜或肠胃外施用，因此，精确的制剂可能取决于预期的施用途径。以任何给定剂量存在的包含CBM32/47/67/70的分子的量可以在0.1μg-1000μg的范围内。例如，约0.1μg,0.2μg,0.3μg,0.4μg,0.5μg,1μg,10μg,20μg,25μg,50μg,100μg,200μg,300μg,400μg,500μg,600μg,700μg,800μg或900μg的量。选定量的CBM32/47/67/70分子可以配制在特定体积的药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或缓冲剂中。赋形剂、稀释剂或缓冲液的体积约为10μL至5mL。例如，所需量的CBM32/47/67/70分子可以与约15μL,20μL,25μL,30μL,35μL,40μL,45μL,50μL,55μL,60μL,65μL,70μL,75μL,80μL,85μL,90μL,95μL,100μL,200μL,250μL,300μL,400μL,500μL,600μL,700μL,800μL,900μL,1mL,2mL,3mL或4mL组合(或配制)。例如，100μg CBM32/47/67/70分子可与约250μL赋形剂混合，以产生400μg/mL的最终浓度。可以使用约0.1μg/mL-1mg/mL浓度的剂量，包括例如5μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,25μg/mL,50μg/mL,100μg/mL,200μg/mL,300μg/mL,500μg/mL,600μg/mL,700μg/mL,800μg/mL或900μg/mL的剂量。
在使用中，作为细胞增殖和/或分化病症(例如，癌症)的治疗和/或预防的一部分施用的剂量CBM32/47/67/70分子可以在数天、数周、数月或数年内多次施用。例如，在初次(或第一次)施用后，可以在大约( /-1或2天)3,4,5,6,7,17,21,28和/或35天后再次施用一剂CBM32/47/67/70分子。在任何给定的天数，特定剂量的CBM32/47/67/70分子可以施用1、2、3次或更多次。每次，可以施用CBM32/47/67/70分子(通过被认为是影响合适治疗或诱导预防细胞增殖和/或分化病症发展的最佳途径)。
详细说明
现在将参考以下附图详细描述本发明，这些附图显示：
图1：增殖数据(BrdU掺入测定)。将不同的癌细胞系(黑色素瘤((a)，A2058)，乳腺癌((b)，MDA.MB.231)，胰腺((c)，PANC1)和肺((d)，A549)用Cp2CBM32TD(400μg/mL)、PBS(对照)、唾液酸结合CBM40试剂(Sp2CBMTD(400μg/mL)、Vc2CBMTD(400μg/mL)或Vc4CBM(400μg/mL))或唾液酸结合无效CBM40突变体(Sp2(R274Q)CBMTD(400μg/mL))处理并放置24小时。然后将细胞与BrdU孵育2-6小时。进行ELISA测定以测量掺入DNA中的BrdU的量。该测定是标准的测定以测量细胞生长/增殖。双向方差分析用于显示与对照组相比的统计学显著性(****表示p<0.0001，***表示p<0.001，**表示p<0.01和*表示p<0.1)。
图2：增殖数据(BrdU掺入测定)。将不同的癌细胞系((a)、胶质瘤(T98G)、结肠((b)、SW620)和卵巢((c)、PE014)用Cp2CBM32TD(400μg/mL)、PBS(对照)、唾液酸结合CBM40试剂(Sp2CBMTD(400μg/mL)、Vc2CBMTD(400μg/mL)或Vc4CBM(400μg/mL))或唾液酸结合无效CBM40突变体(Sp2(R274Q)CBMTD(400μg/mL))处理并放置24小时。然后将细胞进行BrdU测定并孵育2-6小时。进行ELISA测定以测量掺入DNA中的BrdU的量。该测定是标准的测定以测量细胞生长/增殖。双向方差分析用于显示与对照组相比的统计学显著性(****表示p<0.0001，***表示p<0.001，**表示p<0.01和*表示p<0.1)。
图3：人源转移性卵巢癌细胞系PE01、PE01顺铂抗性(PE01-CR)和PE014中细胞增殖的抑制百分比。(a)使用针对三种卵巢细胞系的Cp2CBM32TD(来自产气荚膜梭菌的GalNAc/半乳糖/乳糖结合CBM)，包括顺铂抗性形式(PE01-CR)。(b)使用针对三种卵巢细胞系的Vc2CBMTD(PE01、PE01-CR、PE014)。(c)使用针对三种卵巢细胞系的Sp2CBMTD(PE01、PE01-CR、PE014)。
图4：增殖数据(BrdU掺入测定)。将不同的癌细胞系(黑色素瘤((a)，A2058)，乳腺((b)，MDA.MB.231)，胰腺((c)，PANC1)和肺((d)，A549)用2CBM47TD(400μg/mL)、2CBM67TD(400μg/mL)、2CBM70TD(400μg/mL)、PBS(对照)或唾液酸结合CBM40试剂Sp2CBMTD(400μg/mL)处理，并放置24小时。然后将细胞与BrdU孵育2-6小时。进行ELISA测定以测量掺入DNA中的BrdU的量。该测定是标准的测定以测量细胞生长/增殖。双向方差分析用于显示与对照组相比的统计学显著性(****表示p<0.0001，***表示p<0.001，**表示p<0.01和*表示p<0.1)。
图5：增殖数据(BrdU掺入测定)。将不同的癌细胞系((a)，胶质瘤(T98G)，结肠((b)，SW620)和卵巢((c),PE014,(d)PE01))用2CBM47TD(400μg/mL)、2CBM67TD(400μg/mL)、2CBM70TD(400μg/mL)、PBS(对照)或唾液酸结合CBM40试剂Sp2CBMTD(400μg/mL)处理，并放置24小时。然后将细胞进行BrdU测定并孵育2-6小时。进行ELISA测定以测量掺入DNA中的BrdU的量。该测定是标准的测定以测量细胞生长/增殖。双向方差分析用于显示与对照组相比的统计学显著性(****表示p<0.0001，***表示p<0.001，**表示p<0.01和*表示p<0.1)。
图6：增殖数据(BrdU掺入测定)。将卵巢癌细胞(PE01顺铂抗性(CR))用Sp2CBMTD(400μg/mL)、2CBM47TD(400μg/mL)、2CBM67TD(400μg/mL)、2CBM70TD(400μg/mL)或PBS(对照)处理，并放置24小时。然后将细胞进行BrdU测定并孵育2-6小时。进行ELISA测定以测量掺入DNA中的BrdU的量。该测定是标准的测定以测量细胞生长/增殖。双向方差分析用于显示与对照组相比的统计学显著性(****表示p<0.0001，***表示p<0.001，**表示p<0.01和*表示p<0.1)。
图7：从(a)CellTiter2.0测定(CTG2.0)；和(b)直接细胞增殖测定获得的增殖数据。将卵巢癌细胞系(SK-OV-3)用Cp2CBM32TD处理并放置72小时，如下所述。使用3倍稀释系列从3mg/mL到0.457μg/mL用九种不同浓度生成剂量反应曲线。处理后，使用2.0测定或直接细胞增殖测定对平板进行终点分析。
图8：从(a)CellTiter2.0测定(CTG2.0)；和(b)直接细胞增殖测定获得的增殖数据。将卵巢癌细胞系(TOV-21G)用Cp2CBM32TD处理并放置72小时，如下所述。使用3倍稀释系列从3mg/mL到0.457μg/mL用九种不同浓度生成剂量反应曲线。处理后，使用2.0测定或直接细胞增殖测定对平板进行终点分析。
图9：从(a)CellTiter2.0测定(CTG2.0)；和(b)直接细胞增殖测定获得的增殖数据。将结肠直肠癌细胞系(Gp2D)用Cp2CBM32TD处理并放置72小时，如下所述。使用3倍稀释系列从3mg/mL到0.457μg/mL用九种不同浓度生成剂量反应曲线。处理后，使用2.0测定或直接细胞增殖测定对平板进行终点分析。
图10：从(a)CellTiter2.0测定(CTG2.0)；和(b)直接细胞增殖测定获得的增殖数据。将乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)用Cp2CBM32TD处理并放置72小时，如下所述。使用3倍稀释系列从3mg/mL到0.457μg/mL用九种不同浓度生成剂量反应曲线。处理后，使用2.0测定或直接细胞增殖测定对平板进行终点分析。
图11：从(a)CellTiter2.0测定(CTG2.0)；和(b)直接细胞增殖测定获得的增殖数据。将乳腺癌细胞系(CAMA-1)用Cp2CBM32TD处理并放置72小时，如下所述。使用3倍稀释系列从3mg/mL到0.457μg/mL用九种不同浓度生成剂量反应曲线。处理后，使用2.0测定或直接细胞增殖测定对平板进行终点分析。
图12：从(a)CellTiter2.0测定(CTG2.0)；和(b)直接细胞增殖测定获得的增殖数据。将肺癌细胞系(NCI-H441)用Cp2CBM32TD处理并放置72小时，如下所述。使用从3mg/mL到0.457μg/mL的3倍稀释系列用九种不同浓度生成剂量反应曲线。处理后，使用2.0测定或直接细胞增殖测定对平板进行终点分析。
实验
部分A
将许多不同的癌细胞系用各种CBM测试试剂处理，每种CBM测试试剂包含一种或多种含有选自由CBM32、CBM40、CBM47、CBM67和CBM70组成的组的CBM的分子。
将这些测试试剂在BrdU细胞增殖测定中进行评估，如以上图1至图6中的每一个所述。
这些测定的结果显示在图1至6中。
部分B
选择CBM Cp2CBM32TD用于使用以下测定进行进一步研究：
(I)CellTiter2.0测定(CTG2.0)；和
(ii)直接细胞增殖测定。
2.0测定提供了一种均相方法，以便通过量化存在的ATP量(其表明代谢活性细胞的存在)来确定培养物中活细胞的数量。直接细胞增殖测定依赖于细胞渗透性DNA结合染料与背景抑制试剂的组合使用。这些程序完整描述于Promega2.0Assay Technical Manual TM403(2018年10月)和Direct Cell Proliferation Assay Molecular Probes manual MP 35011(2009年7月20日)中。
在液氮中保存的细胞系在生长培养基中解冻和扩增。一旦细胞达到预期的倍增时间，就开始筛选。将生长培养基中的25μL细胞以每孔500-1500个细胞的速度接种在黑色384孔组织培养处理板中。测定板通过离心平衡并在化合物处理前在37℃下孵育24小时。在治疗时，收集一组时间点0(T0)测定平板(未接受治疗)，并分别使用CyQUANT Direct(ThermoFisher)和CellTitre-Glo 2.0(Promega)测量DNA含量和成活力的读数。将15μL/孔的测定试剂添加到测定板中。使用从3mg/mL到0.457μg/mL的3倍稀释系列评估了九种不同浓度。
在Envision酶标仪(Perkin Elmer)上读取时间点0(T0)板的荧光(CyQUANT)或吸光度(CellTitre-Glo 2.0)。将测定板与化合物一起孵育72小时，然后使用CyQUANT Direct和CellTitre-Glo 2.0进行分析。
生长抑制(GI)用作细胞生长的量度。GI百分比是通过应用以下测试和方程式计算得出的：
如果
如果
其中T是测试物品的信号量度，V是未处理/赋形剂处理的对照量度，V0是零时间时的未处理/赋形剂对照量度(也通俗地称为T0板)。该公式源自美国国家癌症研究所NCI-60高通量筛选(National Cancer Institute’s NCI-60high throughput screen)中使用的生长抑制计算。
0％的GI读数表示没有生长抑制，并且会在72小时的T读数与相应时间段的V读数相当的情况下出现。100％的GI代表完全的生长抑制(细胞停滞(cytostasis)，在这种情况下，用化合物处理72小时的细胞将具有与T0对照细胞相同的终点读数。200％的GI代表培养孔中所有细胞的完全死亡(细胞毒性)，并且在这种情况下，72小时的T读数将低于T0对照。
还提供抑制作为细胞成活力的量度。0％的抑制水平表示处理没有抑制细胞生长。100％的抑制表示在处理窗口期间细胞数量没有加倍。细胞抑制(cytostatic)和细胞毒性处理均可产生100％的抑制百分比。抑制百分比使用以下公式计算：
I＝1-T/U
其中T是经过处理的，并且U是未处理的/赋形剂对照。
在每种情况下，将细胞接种在黑色384孔组织培养处理板的生长培养基中，并通过离心进行平衡。将处理的测定板与测试化合物孵育72小时。处理后，使用2.0测定或直接细胞增殖测定对平板进行终点分析。
结果示于图7至图12中。
在这些进一步的研究中，发明人确定Cp2CBM32TD确实显示出针对乳腺癌细胞系MDA.MB.231(见图10a和10b)以及乳腺癌细胞系CAMA-1(见图11a和11b)的抗增殖活性。在BrdU测定中未观察到这种针对MDA.MB.231癌细胞的相同水平的活性。
不受理论的束缚，发明人假设这种差异可能归因于MDA.MB.231细胞的群体倍增时间(大约36小时)。因此，相信在BrdU测定中较短的处理时间(持续时间为24小时)不足以正确证明Cp2CBM32TD对MDA.MB.231细胞的抗增殖活性。
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
