一种用于生产磺基化重组水蛭素的重组菌及其制备方法与应用与流程

技术特征：
1.一种用于生产磺基化重组水蛭素的重组菌，其特征在于，所述重组菌过表达磺基化酶基因和水蛭素基因，出发菌株为大肠杆菌；所述水蛭素基因，核苷酸序列为seq id no.1-seq id no.3中的一种，所述磺基化酶基因，核苷酸序列如seq id no.4所示。2.权利要求1所述的重组菌的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：1)水蛭素基因表达载体构建：在所述水蛭素基因的5’端添加编码周质分泌肽的核苷酸序列，得到带有周质分泌肽的水蛭素基因，然后连接到质粒载体中，获得表达水蛭素的表达载体；2)磺基化酶基因辅助载体构建：在所述磺基化酶基因的5’端添加编码周质分泌肽的核苷酸序列，得到带有周质分泌肽的磺基化酶基因，然后连接到质粒载体，获得表达磺基化酶的辅助载体；步骤1)和步骤2)中所述编码周质分泌肽的核苷酸序列如seq id no.5所示；3)转化：将步骤1)获得的表达载体和步骤2)获得的辅助载体共转化至大肠杆菌，获得重组菌。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述的质粒载体为pet-22b载体；步骤2)中所述的质粒载体为pacyc-duet1载体。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述带有周质分泌肽的水蛭素基因，扩增所用引物为f1和r1；所述f1的核苷酸序列为：atacatatgaagtatctgttacctaccgc，所述r1的核苷酸序列为：ggtgctcgagtcattgcagatagtagtacgga。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述带有周质分泌肽的磺基化酶基因，扩增所用引物为f2和r2，所述f2的核苷酸序列为tatacatatgaaatatctgctgcctacc，所述r2的核苷酸序列为agactcgagtcatcagcagctaatggt。6.权利要求1所述的重组菌在生产磺基化重组水蛭素中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述生产磺基化重组水蛭素的方法如下：1)将权利要求1所述的重组菌加入含卡那霉素及氯霉素的lb培养基的试管中，37℃震荡培养，转速100～250rpm，时间6～16h；培养后将试管中菌液转移至摇瓶中，37℃，100-250rpm震荡培养至od
600 0.4～1.0；2)然后向得到的菌液中加入iptg及4-nitrophenyl sulfate，终浓度分别为1mm及0.01μm，37℃培养4h～6h；得到的菌液离心或过滤，收集菌体沉淀；获得的沉淀中加入周质蛋白提取液提取获得蛋白溶液，经纯化后获得磺基化重组水蛭素。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述周质蛋白提取液配方为：蔗糖171.15g/l,edta 0.19g/l，余量为水，用tris-base粉末将溶液至ph 8.0。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述纯化是指将获得的蛋白溶液透析48h-96h，透析过程中蒸馏水作为透析液，透析完成后离心去除沉淀，将获得的上清溶液进行冻干。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述冻干条件为温度-20～-80℃，时间24～72h。

技术总结
一种用于生产磺基化重组水蛭素的重组菌及其制备方法与应用，属于基因工程技术领域。为了提高磺基化重组水蛭素的合成产量，降低生产成本，本发明提供了一种用于生产磺基化重组水蛭素的重组菌，所述重组菌过表达磺基化酶基因和水蛭素基因，出发菌株为大肠杆菌；所述水蛭素基因，核苷酸序列为SEQ ID No.1-SEQ ID No.3中的一种，所述磺基化酶基因，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。本发明显著提升了重组水蛭素的活性，且实现了水蛭素的一步纯化方法，能够一次性获得具有较高纯度的重组水蛭素产物，这极大的减轻了后续纯化的压力。这极大的减轻了后续纯化的压力。这极大的减轻了后续纯化的压力。


技术研发人员：孙粤 包子娴 年锐 莱东 咸漠 刘文帅 樊喜英 陈泉
受保护的技术使用者：中国科学院青岛生物能源与过程研究所
技术研发日：2020.05.22
技术公布日：2021/11/26