用于多重拷贝数变异检测和等位基因比率定量的定量扩增子测序的制作方法

技术特征：
1.一种用于制备用于高通量测序的基因组dna的靶定区域的方法，所述方法包括：(a)获取基因组dna样品；(b)通过使用如下项进行两个pcr循环来扩增所述基因组dna样品的至少一部分：(i)第一寡核苷酸，其从5
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到3
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包括第一区域、长度为0至50个核苷酸的第二区域、包含至少四个简并核苷酸的第三区域、和包含与第一靶标基因组dna区域互补的序列的第四区域；和(ii)第二寡核苷酸，其从5
′
到3
′
包括第五区域、长度为0至50个核苷酸的第六区域、和包含与第二靶标基因组dna区域互补的序列的第七区域；(c)使用比步骤(b)中所使用的退火温度高0
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10℃的退火温度，并使用如下项进行至少三个pcr循环来扩增步骤(b)的产物：(i)第三寡核苷酸，其包括能够与所述第一区域的至少一部分的反向互补序列杂交的序列；和(ii)第四寡核苷酸，其包括能够与所述第五区域的至少一部分的反向互补序列杂交的序列；以及(d)通过使用第五寡核苷酸进行至少一个pcr循环来扩增步骤(c)的产物，所述第五寡核苷酸从5
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到3
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包括第八区域、长度为0至50个核苷酸的第九区域、和包含与第三靶标基因组dna区域互补的序列的第十区域，其中所述第三靶标基因组dna区域比所述第二靶标基因组dna区域更靠近所述第一靶标基因组dna区域至少一个核苷酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是用于制备用于高通量测序的基因组dna的1至10,000个靶定区域的方法。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第三区域是唯一分子标识符(umi)。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述第三靶标基因组dna区域比所述第二靶标基因组dna区域更靠近所述第一靶标基因组dna区域1
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10个碱基。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的方法，其中所述第一区域和所述第八区域是通用引物结合位点。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中所述第一区域和所述第八区域包含完整或部分ngs衔接子序列。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中所述第五区域包含在人类基因组中找不到的序列。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中所述第五区域包含不同于ngs衔接子序列的序列。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的方法，其中所述第一区域和所述第五区域的解链温度比所述第四区域和所述第七区域的解链温度高0
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10℃。10.根据权利要求1
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9中任一项所述的方法，其中所述第三区域中的所述简并核苷酸各自独立地为a、t或c之一。11.根据权利要求1
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10中任一项所述的方法，其中所述第三区域中的所述简并核苷酸均不是g。12.根据权利要求1
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11中任一项所述的方法，其中存在各自具有唯一第三区域的第一寡核苷酸群体。
13.根据权利要求1
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12中任一项所述的方法，其进一步包括纯化步骤(c)的所述产物。14.根据权利要求13所述的方法，其中纯化包括spri纯化或柱纯化。15.根据权利要求1
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14中任一项所述的方法，其进一步包括纯化步骤(d)的所述产物。16.根据权利要求15所述的方法，其中纯化包括spri纯化或柱纯化。17.根据权利要求1
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16中任一项所述的方法，其进一步包括：(e)使用与所述第一区域和所述第八区域杂交的引物通过pcr来扩增步骤(d)的所述产物，其中所述引物包括用于下一代测序的索引序列。18.根据权利要求17所述的方法，其进一步包括纯化步骤(e)的所述产物。19.根据权利要求18所述的方法，其中纯化包括spri纯化或柱纯化。20.根据权利要求17
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19中任一项所述的方法，其进一步包括：(f)对步骤(e)的所述产物进行高通量dna测序。21.根据权利要求20所述的方法，其中高通量dna测序包括下一代测序。22.根据权利要求1
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21中任一项所述的方法，其中所述第一靶标基因组dna区域和所述第二靶标基因组dna区域在基因组dna的相反的链上。23.根据权利要求1
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22中任一项所述的方法，其中所述第一靶标基因组dna区域和所述第二靶标基因组dna区域相隔40个核苷酸至500个核苷酸。24.根据权利要求1
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23中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括约30分钟的延伸时间。25.根据权利要求1
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24中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括约30秒的延伸时间。26.根据权利要求1
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25中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括约30分钟的延伸时间。27.一种用于定量至少一个靶标基因的额外拷贝的频率(fec)的方法，所述方法包括：(a)获取基因组dna样品；(b)根据权利要求1
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26中任一项所述的方法制备所述用于高通量测序的基因组dna，其中所述第四区域、所述第七区域和所述第十区域的序列与所述至少一个靶标基因杂交；(c)根据权利要求20所述的方法进行高通量测序；和(d)基于步骤(c)中获得的测序信息计算所述至少一个靶标基因的所述fec。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述方法是用于定量一组靶标基因的所述fec的方法，其中所述一组靶标基因包括2至1000个靶标基因。29.根据权利要求27或28所述的方法，其中使用第一寡核苷酸群体、第二寡核苷酸群体和第五寡核苷酸群体进行步骤(b)，其中第一、第二和第五寡核苷酸群体中的每个群体的一部分分别包含与所述一组靶标基因中的一个互补的第四、第七和第十区域。30.根据权利要求27
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29中任一项所述的方法，其中所述第四、第七和第十区域中的每个包含在人类基因组中仅发现一次的序列。31.根据权利要求27
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30中任一项所述的方法，其中与一个靶标基因杂交的每个第一寡核苷酸和与相同靶标基因杂交的每个其他第一寡核苷酸相比，具有唯一第三区域。32.根据权利要求27
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31中任一项所述的方法，其中使用分别包含与参考基因互补的第四、第七和第十区域的第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和第五寡核苷酸进行步骤(b)。33.根据权利要求27
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32中任一项所述的方法，其中步骤(b)制备每个靶标基因或参考基因的一部分用于高通量测序，其中所述部分的长度在40个核苷酸至500个核苷酸之间。34.根据权利要求27
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33中任一项所述的方法，其中fec定义如下：
35.根据权利要求27
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34中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括：(i)将ngs读段与每个靶标基因的靶定部分进行比对，并基于它们比对的基因座将所述ngs读段分组到亚组中；(ii)在每个基因座基于其umi序列划分所述ngs读段，以便将所有携带相同umi序列的ngs读段分组为一个umi家族；(iii)去除因pcr错误或ngs错误得到的umi家族；(iv)计算每个基因座的唯一umi序列的数量；和(v)基于每个靶标基因和参考基因中每个基因座的唯一umi序列的所述数量计算所述fec。36.根据权利要求35所述的方法，其中步骤(d)(iii)包括去除不满足umi简并碱基设计的umi序列。37.根据权利要求35或36所述的方法，其中步骤(d)(iii)包括去除umi家族规模小于fmin的umi家族，其中所述umi家族规模是携带相同umi的读段的数量，其中fmin在2至20之间。38.根据权利要求35
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37中任一项所述的方法，其中步骤(d)(iv)包括去除与具有更大家族规模的另一个umi序列仅相差一个或两个碱基的umi序列。39.根据权利要求27
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38中任一项所述的方法，其中fec定义如下：其中是全部或部分所述靶标基因基因座的唯一umi数量的总和，u是要考虑的基因座数，u不超过所述靶标基因中的基因座的总数；是全部或部分参考基因座的唯一umi数量的总和，v是一个参考的要考虑的基因座数，v不超过所述参考中的基因座的总数；w是要考虑的参考数，w不超过参考的总数；且k由实验校准确定。40.根据权利要求27
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39中任一项所述的方法，其中所述fec用于鉴定所述靶标基因的拷贝数变异(cnv)状态。41.一种用于定量至少一个靶标基因组基因座的不同遗传同一性的等位基因比率的方法，所述方法包括：(a)获取基因组dna样品；(b)根据权利要求1
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26中任一项所述的方法制备所述用于高通量测序的基因组dna，其中所述第四区域、所述第七区域和所述第十区域的序列与所述至少一个靶标基因组基因座附近的所述基因组dna杂交；(c)根据权利要求20所述的方法进行高通量测序；和(d)基于步骤(c)中获得的测序信息，计算所述至少一个靶标基因组基因座的不同遗传同一性的所述等位基因比率。42.根据权利要求41所述的方法，其中所述方法是用于定量一组靶标基因组基因座的不同遗传同一性的所述等位基因比率的方法，其中所述一组靶标基因组基因座包括2至10,000个靶标基因组基因座。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中使用第一寡核苷酸群体、第二寡核苷酸群体和第五寡核苷酸群体进行步骤(b)，其中第一、第二和第五寡核苷酸群体中的每个群体的一部分分别包含与所述一组靶标基因组基因座中的至少一个附近的基因组dna互补的第四、第七和第十区域。44.根据权利要求41
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43中任一项所述的方法，其中所述第四、第七和第十区域中的每个包含在步骤(b)的条件下不能与所述基因组dna的非靶标区域杂交的序列。45.根据权利要求41
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44中任一项所述的方法，其中与一个靶标基因组基因座附近的所述基因组dna杂交的每个第一寡核苷酸和与相同靶标基因组基因座附近的所述基因组dna杂交的每个其他第一寡核苷酸相比，具有唯一第三区域。46.根据权利要求41
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45中任一项所述的方法，其中每个靶标基因组基因座的长度在40个核苷酸至500个核苷酸之间。47.根据权利要求41
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46中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括：(i)将ngs读段与靶定基因组基因座进行比对，并基于它们比对的基因座将所述ngs读段分组到亚组中；(ii)在每个基因座基于其umi序列划分所述ngs读段，以便将所有携带相同umi序列的ngs读段分组为一个umi家族；(iii)去除因pcr错误或ngs错误得到的umi家族；(iv)调用每个剩余umi家族的所述遗传同一性；(v)计算每个基因座的唯一umi序列的数量；以及(vi)计算所述等位基因比率。48.根据权利要求47所述的方法，其中步骤(d)(iii)包括去除不满足umi简并碱基设计的umi序列。49.根据权利要求47或48所述的方法，其中步骤(d)(iii)包括去除umi家族规模小于fmin的umi家族，其中所述umi家族规模是携带相同umi的读段的数量，其中fmin在2至20之间。50.根据权利要求47
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49中任一项所述的方法，其中步骤(d)(iii)包括去除与具有更大家族规模的另一个umi序列仅相差一个或两个碱基的umi序列。51.根据权利要求47
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50中任一项所述的方法，其中步骤(d)(iv)包括仅当umi家族中至少70％的读段在目标遗传基因座上相同时才调用所述遗传同一性。52.根据权利要求41
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51中任一项所述的方法，其中所述等位基因比率定义为r
等位基因
＝n1/n2，其中n1是第一遗传同一性的唯一umi数量，且n2是第二遗传同一性的唯一umi数量。53.根据权利要求47
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51中任一项所述的方法，其中步骤(d)(iv)包括鉴定每个umi家族的共有序列。54.根据权利要求53所述的方法，其中所述共有序列是在所述umi家族中出现次数最多的序列。55.根据权利要求53或54所述的方法，其进一步包括将所述共有序列与所述基因座的野生型序列进行比较，从而鉴定所述共有序列中的突变。56.根据权利要求55所述的方法，其进一步包括计算所鉴定突变的变体等位基因频率(vaf)。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所鉴定突变的所述vaf定义为具有所述突变的umi家族的数量/umi家族的总数。

技术总结
本文提供了定量扩增子测序的方法，用于通过聚合酶链式反应用寡核苷酸条形码序列标记DNA样品中靶定基因组基因座的每条链，并扩增用于高通量测序的基因组区域。通过定量每个基因的额外拷贝的频率，这些方法可用于同时检测一组目标基因中的拷贝数变异(CNV)。此外，这些方法使用多重PCR对靶定基因组基因座的不同遗传同一性的等位基因比率进行定量。此外，这些方法提供了突变检测和变体等位基因频率的定量。量。量。


技术研发人员：大卫
受保护的技术使用者：威廉马歇莱思大学
技术研发日：2020.01.02
技术公布日：2021/11/25