辛酸在制备治疗脑卒中的药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及辛酸在制备治疗脑卒中的药物中的应用。


背景技术：

2.目前，全球每年约有650万人死于脑卒中，使脑卒中成为仅次于缺血性心脏病的第二大死因。其中，脑卒中通常包括出血性脑卒中和缺血性脑卒中两大类，其中缺血性脑卒中的比例高达80％以上。纵使缺血性脑卒中发生率高，但目前仍缺乏有效的治疗策略。
3.80％的缺血性脑卒中患者都伴随神经功能障碍，其主要原因被认为是脑缺血和再灌注(i/r)对神经细胞造成不可挽回的伤害。迄今为止，重组组织型纤溶酶原激活剂(recombinant tissue
‑
type plasminogen activator，rt
‑
pa)是美国食品和药物管理局(fda)批准的唯一急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke，ais)的药物。
4.但是，rt
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pa的疗效具有时间依赖性，病人到院至用药时间(door
‑
to
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needle time，dnt)尽量控制在在60分钟内，且静脉rt
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pa溶栓会增加出血转化(hemorrhagic transformation，ht)的风险，ht是ais的主要并发症，严重威胁患者生命安全。即使在预防和治疗等方面有了新进展，但还是有很多患者遗留严重的永久性神经功能损伤，加之其治疗及预后康复成本高昂、社会劳动力丧失所带来的经济影响等，带来巨大的经济负担和社会压力，因此，神经保护药物的开发是迫切需要关注的问题。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供辛酸在制备治疗脑卒中的药物中的应用，其能够起到很好的神经保护作用，为脑卒中治疗提供了新的路径。
7.本发明是这样实现的：
8.第一方面，本发明提供辛酸在制备治疗脑卒中的药物中的应用。
9.在可选的实施方式中，脑卒中为缺血性脑卒中。
10.在可选的实施方式中，辛酸为正辛酸。
11.第二方面，本发明提供辛酸在制备抑制脑卒中患者炎症因子分泌的药物中的应用。
12.在可选的实施方式中，抑制炎症因子分泌是指缺血性脑卒中患者受到缺氧
‑
糖剥夺再灌注损伤后抑制炎症因子分泌。
13.在可选的实施方式中，炎症因子选自il
‑
1β，il
‑
6和tnf
‑
α中的至少一种。
14.第三方面，本发明提供辛酸在制备抑制脑卒中患者神经细胞存活率下降的药物中的应用。
15.第四方面，本发明提供辛酸在制备抑制脑卒中患者神经细胞凋亡的药物中的应用。
16.本发明具有以下有益效果：发明人探究了辛酸对于脑卒中的治疗效果，发现辛酸可以抑制缺氧
‑
糖剥夺再灌注(ogd/r)引起的细胞存活率下降、降低细胞凋亡率，还可以抑制ogd/r损伤后炎症因子的释放，证明了辛酸对脑卒中的治疗效果。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
18.图1为化合物caprylic acid安全作用浓度筛选结果；
19.图2为化合物caprylic acid增强pc12细胞ogd/r诱导神经毒性后的细胞活力的测试结果；
20.图3为化合物caprylic acid抑制pc12细胞ogd/r诱导神经毒性后引起的细胞凋亡的测试结果；
21.图4为化合物caprylic acid抑制pc12细胞ogd/r诱导损伤后炎性因子分泌的测试结果。
具体实施方式
22.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
23.神经保护指的是使用一种影响仍存在的缺血半暗区脑组织的疗法来挽救或延缓梗死的发生。神经保护治疗可能的机制是防止局部炎症、神经元凋亡、兴奋毒性、自由基损伤和钙流入细胞，从而改善功能和缩小梗死面积。炎症、氧化应激和细胞凋亡是脑缺血再灌注损伤的主要病理之一，在过去的几十年里，已有大量的研究开发了许多神经保护疗法，能够减少动物模型缺血性中风后的脑损伤。
24.发明人对治疗脑卒中的药物做了大量的研究，利用pc12细胞建立缺血性脑卒中体外模型，通过细胞活力测定、细胞流式凋亡水平测定以及细胞炎症因子分泌水平的测定，评估了化合物caprylic acid在缺血性脑卒中体外模型中神经保护作用。结果发现，化合物caprylic acid能够抑制ogd/r引起的pc12细胞存活率下降，能够降低细胞凋亡率，还可以降低pc12细胞ogd/r损伤后炎症因子(il
‑
1β，il
‑
6，tnf
‑
α)的释放。
25.通过实验结果可以确定辛酸能够有效治疗缺血性脑卒中，为脑卒中的治疗提供了新的路径。
26.具体地，辛酸为正辛酸，具体结果如下：
27.28.在其他实施例中，辛酸也可以为异辛酸等。
29.发明人发现，辛酸能够在制备抑制炎症因子分泌的药物中得到应用，对于缺血性脑卒中患者受到缺氧
‑
糖剥夺再灌注损伤后能够抑制炎症因子分泌，且抑制效果较为明显。
30.具体地，炎症因子选自il
‑
1β，il
‑
6和tnf
‑
α中的至少一种，辛酸对于受到ogd/r损伤之后的以上炎症因子具有显著的抑制效果。
31.发明人发现，辛酸能够在制备抑制脑卒中患者神经细胞存活率下降的药物中得到应用，也可以在制备抑制脑卒中患者神经细胞凋亡的药物中得到应用。
32.试验例1
33.探究正辛酸对于缺血性脑卒中的治疗效果，具体实验方法如下：
34.(1)实验方法
35.细胞培养：pc12细胞系购自上海细胞库中国生物化学与细胞生物学研究所科学院(中国上海)。pc12细胞用dmem培养基培养，配合10％(v/v)胎牛血清(fbs)、青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml)(gibcobrl，美国马里兰州盖瑟斯堡)，细胞培养在37℃、co2体积分数5％的细胞培养箱中。
36.模型建立：pc12细胞根据不同的实验接种于96孔板上或6孔板，细胞密度分别为1
×
104/孔和5
×
105/孔。于37℃、5％co2培养箱孵育24h。同时，接种另一块96孔板作为空白对照孔。待细胞贴壁后移走上层培养基，用浓度0.01m的pbs缓冲液(ph7.4)清洗2遍，洗去残余培养基，每孔加入100μl无葡萄糖dmem培养基(不含fbs等)，并置于37℃、95％n2和5％co2的湿润密闭室孵育4h；空白对照孔则加入dmem培养基(不含fbs等)后置于37℃、5％co2培养箱孵育4h。而后，给药组用含有相应浓度药物的培养基与pc12细胞于37℃、5％co2培养箱孵育20h；空白对照组和odg/r模型组则用无葡萄糖dmem培养基(不含fbs等)与pc12细胞孵育于37℃、5％co2培养箱20h。
37.化合物正辛酸(caprylic acid)安全作用浓度筛选：将pc12细胞以1
×
105cells/ml的密度接种到96孔板中，每孔加入100μl的细胞悬液，置于37℃、5％co2培养箱孵育24h；同时接种另一块96孔板作为空白对照孔。待细胞贴壁后移走上层培养基，用浓度为0.01m的pbs缓冲液(ph7.4)洗2遍，每孔加入100μl无葡萄糖dmem培养基(不含fbs等)，并置于37℃、95％n2和5％co2的湿润密闭室孵育4h；空白对照孔则加入dmem培养基(不含fbs等)后置于37℃、5％co2培养箱孵育4h。移走孔板中原有的上层清液后加入配置好浓度梯度的含药溶液(ca：6.25、12.5、25、50、150μm)，各组分别于细胞培养箱培养20h后进行细胞活力测试。
38.细胞存活率的测定：每天观察细胞的生长状况，当细胞密度生长至85％及以上且状态良好时即可用于进行细胞活力测定实验；以细胞密度为每孔5
×
104个接种到96孔板中，每孔剂量为100u1，置于温度为37℃含5％co2的细胞培养箱中，继续培养24小时，密切观察细胞的生长状态，当观察到细胞贴壁时弃上清，按正常组、空白对照组、caprylic acid(6.25、12.5、25、50、150μm)分组，缺氧4h，再灌注20h，然后每孔加入10μl的mtt溶液，将培养板继续培养4h后用酶标仪在570nm处测定吸光度值。细胞存活率＝(od测定
‑
od测定调零)/(od空白
‑
od空白调零)
×
100％。
39.细胞凋亡率的测定：按照细胞凋亡测定剂盒说明书操作，首先将细胞以5
×
105个/孔的浓度接种于6孔板中。细胞培养箱中过夜，每组三个复孔。经过药物处理和造模后，用0.25％胰酶(不含edta)消化细胞，轻柔吹打，将细胞团消化成单细胞悬液，以1000rpm，离心
5min收集细胞；再用提前预冷的pbs清洗2次。每个样品中加入400μ1缓冲液，轻柔混匀。再分别加入alexa 488和碘化丙二钠(pi)在黑暗中孵育10分钟，进行细胞染色。用流式细胞仪检测各组样品的细胞凋亡率，用cell quest采集软件(bd biosciences)对染色细胞进行分析。
40.炎症因子的水平的测定：造模给药后获得细胞上清液，在4℃下以21,000x g离心20分钟。炎症因子il
‑
1β、il
‑
6和tnf
‑
a的水平使用elisa试剂盒测定，操作过程严格按照试剂盒说明书操作。
41.(2)实验结果
42.化合物caprylic acid安全作用浓度筛选结果如图1所示，利用mtt对caprylic acid不同浓度(6.25、12.5、25、50、150μm)的细胞存活率进行检测。与对照组(0μm)相比，caprylic acid(50、150μm)组对pc12细胞活力有明显抑制作用，*p<0.05，**p<0.01，说明该浓度对pc12细胞具有一定的细胞毒性。
43.化合物caprylic acid增强pc12细胞ogd/r诱导神经毒性后的细胞活力的测试结果如图2所示，与control组比较，ogd/r组细胞活力明显下降(##p<0.01)；与ogd/r组比较，caprylic acid：6.25、12.5、25μm剂量组细胞活力均明显升高(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。图2中可以看出，与正常组细胞比较，缺氧4小时/再复氧20小时导致细胞存活率显著下降，而化合物caprylic acid(6.25、12.5、25、50、150μm)处理后可显著抑制ogd/r引起的存活率下降，表明化合物caprylic acid可抑制ogd/r引起的pc12细胞存活率下降，结合图1结果，剔除2个(50、150μm))有毒剂量，故选择caprylic acid(6.25、12.5、25μm)为后续实验的研究剂量。
44.化合物caprylic acid抑制pc12细胞ogd/r诱导神经毒性后引起的细胞凋亡的测试结果如图3所示，与control组比较，ogd/r组明显诱导细胞凋亡率的增加(##p<0.01)；与ogd组相比，6.25、12.5、25μm浓度的caprylic acid组可降低细胞凋亡率(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
45.化合物caprylic acid抑制pc12细胞ogd/r诱导损伤后炎性因子分泌的测试结果如图4所示，与control组比较，ogd/r损伤后细胞il
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1β，il
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6和tnf
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a含量明显升高(##p<0.01，###p<0.001)；与ogd/r组比较，caprylic acid：6.25、12.5、25μm组剂量组可以明显抑制il
‑
1β、il
‑
6和tnf
‑
a的分泌(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
46.以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。