柚皮素在制备促进m1型小胶质细胞向m2极化的促进剂中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及柚皮素在制备促进m1型小胶质细胞向m2极化的促进剂中的应用。
背景技术：
2.小胶质细胞(microglia)系神经组织中唯一来源于中胚层的细胞。已知小胶质细胞存在两种活化类型。存在促炎m1表型小胶质细胞和抗炎m2表型小胶质细胞。促炎m1表型小胶质细胞产生白细胞介素
‑
1β(il
‑
1β)、肿瘤坏死因子(tnf
‑
α)、诱导型一氧化氮合酶(inos)等。il
‑
1β是效应因子，在il
‑
1β的存在下，小胶质细胞引起脑内炎症，释放出自由基活性氧等自由基。另外，在产生il
‑
1β的小胶质细胞中，吞噬老化(破坏的)细胞等代谢废物的能力降低。因此，促炎m1表型小胶质细胞对神经细胞产生伤害。而抗炎m2表型小胶质细胞产生精氨酸酶
ꢀ‑
1(arg1)、白细胞介素
‑
10(il
‑
10)、白细胞介素
‑
4(il
‑
4)、转化生长因子(tgf)
‑
β1 等。arg1是效应因子，通过释放arg1，从而作用于保护神经细胞。抗炎m2 表型小胶质细胞在抑制脑内炎症的同时，吞噬老化细胞等代谢废物的能力高，因此，有抗炎作用、即对神经细胞有保护作用。
3.美国专利us15442473公开了转录因子nurr1和foxa2彼此相互作用以将神经胶质细胞从m1表型转变为建立治疗环境的m2表型；中国专利cn112007142a 公开了一种向抗炎m2表型小胶质细胞的极性转化促进剂，为一种新型的环状肽衍生物。柚皮素(naringenin)是从芸香科植物葡萄柚citrus paradisi macfadyen 以及橘、橙的干燥果实提取的黄酮类成分，具有抗菌、抗炎、抗癌、解痉和利胆等作用。近来实验发现柚皮素对大脑缺血再灌注损伤以及aβ诱导的神经元损伤均有一定的保护作用；而关于柚皮素在小胶质细胞的亚型分化中的作用，目前还未见报道。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供柚皮素在制备促进m1型小胶质细胞向m2极化的促进剂中的应用。
5.本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
6.本发明通过培养原代小胶质细胞，添加aβ诱导原代培养的小胶质细胞，再通过添加柚皮素研究柚皮素对小胶质细胞亚型分化的影响，实验结果表明，柚皮素促进aβ诱导的m1型小胶质细胞向m2极化，柚皮素的加入激活了m2型小胶质细胞的数量，从而高表达了aβ降解酶，进一步研究表明，柚皮素是通过上调pparγ的表达参与了其诱导m2小胶质细胞亚型的转化。因此，本发明请求保护关于柚皮素的以下用途：
7.柚皮素在制备促进m1型小胶质细胞向m2极化的促进剂中的应用。即柚皮素在制备促进促炎m1表型小胶质细胞向抗炎m2表型小胶质细胞极化的促进剂中的应用。
8.柚皮素在制备促进aβ降解酶表达的促进剂中的应用。
9.柚皮素在制备促进aβ降解酶基因表达的促进剂中的应用。
10.柚皮素在制备改善阿尔茨海默病患者记忆功能的药物中的应用。
11.具体地，所述m1型小胶质细胞为aβ诱导的m1型小胶质细胞。
12.优选地，所述柚皮素使用浓度为1～100μm。
13.优选地，所述柚皮素使用浓度为50～100μm。
14.本发明还提供一种促进m1型小胶质细胞向m2极化的促进剂，所述促进剂包含柚皮素。
15.优选地，所述促进剂还包含药学上可接受的辅料。
16.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
17.本发明提供了柚皮素在制备促进m1型小胶质细胞向m2极化的促进剂中的新用途。本发明研究表明，柚皮素促进aβ诱导的m1型小胶质细胞向m2极化，柚皮素的加入激活了m2型小胶质细胞的数量，从而高表达了aβ降解酶，进一步研究表明，柚皮素是通过上调pparγ的表达参与了其诱导m2小胶质细胞亚型的转化。柚皮素具有促进小胶质细胞从m1表型向m2表型转化的作用，在抑制炎症反应、清除毒性物质及修复损伤神经等方面具有较大的应用前景。
附图说明
18.图1为柚皮素和pparγ的autodock分子对接位点。
19.图2为柚皮素促进aβ诱导的m1型小胶质细胞向m2极化。(a)实验流程图；(b)代表性免疫荧光染色图片；(c)柚皮素促进aβ诱导的cd206
‑
inos
m1 型小胶质细胞向cd206
inos
‑
m2型极化。
20.图3为柚皮素激活小胶质细胞并促进对aβ的吞噬和降解作用。(a)实验流程图；(b)m1型小胶质细胞对aβ的吞噬作用；(c)非m1型小胶质细胞对aβ的吞噬作用(d)m2型小胶质细胞对aβ的吞噬作用；(e)非m2型小胶质细胞对aβ的吞噬作用。
21.图4为柚皮素上调小胶质细胞中pparγ和ide、nep的表达。(a)实验流程图； (b)代表性免疫荧光染色图片；(c)柚皮素上调小胶质细胞中pparγ的表达； (d)柚皮素上调小胶质细胞中ide的表达；(e)柚皮素上调小胶质细胞中nep 的表达。
22.图5为柚皮素通过pparγ上调小胶质细胞中ide、nep的表达。(a)实验流程图；(b)柚皮素改善aβ1
‑
42诱导的pparγ受体水平的降低；(c)柚皮素通过pparγ受体调控ide的表达；(d)柚皮素通过pparγ受体调控nep 的表达。
23.图6为柚皮素改善5xfad小鼠认知记忆功能。(a)行为学实验流程图； (b)给药期间小鼠体重变化；(c)10min内小鼠自发运动量；(d)物体认知记忆能力测试；(e)物体位置记忆能。
具体实施方式
24.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
25.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
26.柚皮素的化学结构式如下所示：
[0027][0028]
实施例1柚皮素与其作用靶点pparγ的分子对接研究
[0029]
方法：从pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中得到化合物柚皮素的3d结构，从rcsb pdb(http://www.rcsb.org/)数据库中筛选得到核心靶蛋白的晶体结构，利用pymol(version 2.4.0)去除蛋白中水分子和配体小分子，分离出蛋白的结构。采用autodock 4.2.6软件中遗传算法进行半柔性对接，盒子中心坐标和大小根据蛋白质分子的活性位点位置和其对配体小分子可能发生作用的区域进行设定，其余参数保持默认，对化合物和靶标蛋白进行分子对接分析。
[0030]
结果：分子对接是模拟配体小分子和受体生物大分子之间的相互作用，得到其最佳结合位置和结合强度，预测其亲和力。对柚皮素及其潜在靶点pparγ进行分子对接分析，分子之间结合能量较低的构象则较为稳定，筛选对接结果中结合能低的分子构象即为最优对接结果，并分析其结合位点。对接结果如图1所示，显示，柚皮素与pparγ受体大分子中的氨基酸残基glu259、arg280、arg288、 ser342能够较好的结合作用力，结合能为
‑
7.21kcal
·
mol
‑1，表明其具有良好的亲和力。
[0031]
实施例2柚皮素促进m1型小胶质细胞向m2极化
[0032]
原代小胶质细胞培养：ddy小鼠(p2
‑
4)5
‑
6只，酒精灭菌后分离大脑皮层，除去硬脑膜，切碎放置于dmem( fbs)培养基中，离心(1000rpm,3min)，移去上清液，加入0.25％trypsin 2ml，在37度，5％co2的培养箱中孵育30min，加入10％fbs
‑
dmem培养基4ml，离心(2000rpm,5min)，移去上清液，加入 dnase i/trypsine抑制剂2ml，在37度，10％co2的培养箱中孵育15min，加入 10％fbs
‑
dmem培养基4ml，离心(1000rpm,3min)，移去上清液，加入10％ fbs
‑
dmem培养基4ml，用胶头滴管吹打解离细胞，从底部加入15％bsa的pbs溶液2ml，离心(2000rpm,6min)，移去上清液，加入10％fbs
‑
dmem 培养基2ml，细胞计数并接种于6
‑
cm培养皿上(8*105个细胞)。培养14天后，细胞达到confluence状态时，分离小胶质细胞，用pbs润洗一次，加入不含血清的dmem 3ml和0.25％trypsin 1ml，在37度，5％co2的培养箱中孵育1h，移去上清液，用pbs润洗一次，加入0.25％trypsin 2ml，在37度,5％co2的培养箱中孵育5min，加入10％fbs
‑
dmem 4ml，用胶头滴管吹打解离细胞，细胞计数并接种于8孔细胞培养板上。
[0033]
试验方法：实验流程如图2a所示，将原代培养的小胶质细胞接种于8孔板上(1.5*104cells/well)，2h后分别加入aβ1
‑
42(1μm)24h，后除去含aβ的上清，加入空白对照(dmso)，阳性对照(il
‑
4)和柚皮素，培养24h后，4％pfa 固定细胞，加入一次抗体cd206(1:200,m2 marker)和inos(1:50,m1 marker)和二次抗体alexa fluor 488和594(invitrogen,carlsbad,ca,usa)进行免疫荧光染色，使用荧光显微镜(bx
‑
61/dp70,olympus)照相并用metamorph软件进行图像解析。
[0034]
试验结果如图2b
‑
c所示，显示柚皮素(50～100μm)能显著降低m1并升高m2小胶质细胞的比例，柚皮素嫩促进aβ诱导的cd206 inos
‑
m1型小胶质细胞向cd206
‑
inos m2型极化，表明柚皮素促进aβ诱导的m1型小胶质细胞向m2极化。
[0035]
实施例3柚皮素激活小胶质细胞对aβ的吞噬作用
[0036]
方法：实验流程如图3a所示，原代培养的小胶质细胞接种于8孔板上 (1.5*104cells/well)，1h后加入柚皮素(0.1～100μm)或阳性对照il4，培养4 h后加入aβ1
‑
42(1μm)继续培养24h，后除去含aβ和柚皮素的上清，加入aβ1
‑
42 hilyte fluor 488，培养3h后，4％pfa固定细胞，加入一次抗体cd206(1:200, m2 marker)或inos(1:50,m1 marker)和二次抗体alexa fluor 594(invitrogen, carlsbad,ca,usa)进行免疫荧光染色，使用荧光显微镜(bx
‑
61/dp70,olympus) 照相并用metamorph软件进行图像解析。
[0037]
结果如图3b所示，加入aβ1
‑
42后，小胶质细胞对荧光标记的aβ1
‑
42hilytefluor 488的吞噬能力大大增加，但随着柚皮素浓度的增加，含荧光标记aβ1
‑
42 的cd206阳性小胶质细胞的数量明显减少而inos阳性小胶质细胞数量不变，结果可能提示柚皮素的加入激活了m2型小胶质细胞的数量，从而高表达了aβ降解酶，对外源性异物进行降解，而m1型小胶质细胞的降解作用较弱。
[0038]
实施例4柚皮素调节小胶质细胞中aβ降解酶的表达
[0039]
方法：本实验首先探讨柚皮素对pparγ表达的影响，实验流程如图4a所示， bv2小胶质细胞接种于8孔板上(3000cells/well)，24h后加入柚皮素(1
‑
100μm) 或阳性对照吡格列酮(pparγ激动剂)，继续培养24h后，用4％pfa固定细胞，加入一次抗体ide(1:500)或nep(1:100)和pparγ(1:100)和二次抗体alexa fluor 594和488(invitrogen,carlsbad,ca,usa)进行免疫荧光染色，使用荧光显微镜 (bx
‑
61/dp70,olympus)照相并用metamorph软件进行图像解析。
[0040]
结果如图4b
‑
e所示：柚皮素浓度依存性的上调bv2小胶质细胞中pparγ和aβ降解酶ide、nep的表达，且pparγ高表达的细胞中ide和nep的表达也显著升高，该结果表明柚皮素上调pparγ的表达很可能参与了其诱导m2小胶质细胞亚型的转化。
[0041]
实施例5 pparγ抑制剂消除柚皮素对小胶质细胞中aβ降解酶的上调作用
[0042]
方法：实验流程如图5a所示，bv2小胶质细胞接种于8孔板上(3000 cells/well)，24h后加入gw9662(2μm)，0.5h后加入柚皮素(10和50μm)或阳性对照吡格列酮(pparγ激动剂10μm)，1h后加入aβ1
‑
42(1μm)，继续培养24h后，用4％pfa固定细胞，加入一次抗体ide(1:500)或nep(1:100)和 pparγ(1:100)和二次抗体alexa fluor 594和488(invitrogen,carlsbad,ca,usa) 进行免疫荧光染色，使用荧光显微镜(bx
‑
61/dp70,olympus)照相并用metamorph 软件进行图像解析。
[0043]
结果显示，柚皮素改善aβ1
‑
42诱导的pparγ受体水平的降低(图5b)；采用pparγ抑制剂gw9662，发现gw9662消除了柚皮素诱导的ide和nep的表达上升(图5c
‑
d)，表明柚皮素通过上调pparγ的表达参与其诱导m2小胶质细胞亚型的转化。
[0044]
实施例6柚皮素改善5xfad小鼠记忆功能
[0045]
柚皮素(5,100mg/kg/day)口服给与ad模型鼠5xfad(8
‑
12月龄)，21 天后进行自发性运动测试，第22天进行物体认知记忆实验(ort)，第29天进行物体位置记忆实验(olt)。
[0046]
自发活动测试：将小鼠放入自发活动装置中(长33cm，宽28cm，高26.5cm), 摄像机
拍摄10min内的活动过程并输入计算机，动物行为分析系统自动记录并分析小鼠的总路程。
[0047]
新物体认知记忆测试：训练时将两个相同的物体a和a’放置于自发活动装置(长33cm，宽28cm，高26.5cm)中，后将小鼠放入其中，让小鼠自发探索物体a和a’，并记录其探索次数(鼻子嗅物体和爪子攀爬物体)，计算小鼠探索物体a
‘
的概率为探索a’占a、a’总次数的百分率，即a’/(a a’)
×
100％。经过 48h后，将活动箱中的物体a’取出，换成不同的新奇物体b，再次将小鼠放入其中，让小鼠自发探索物体a和b，并记录其探索次数。计算小鼠探索物体b的概率b/(a b)
×
100％，见图6c，本测试基于小鼠更喜欢接触新奇的物体。
[0048]
位置记忆测试：训练时将活动箱的两侧贴上不同的图案，将两个相同的物体 a1和a2放置于自发活动箱中，后将小鼠放入其中，让小鼠自发探索物体a1和 a2，并记录其探索次数，计算小鼠探索物体a1的概率。经过48h后，将活动箱中的物体a1换到活动箱中另一个位置a1’，再次将小鼠放入其中，让小鼠自发探索物体a1’和a2，并记录其探索次数。计算小鼠探索a1’的概率a1’/(a1’ b)
ꢀ×
100％，见图6a，本测试基于小鼠更喜欢接触新位置的物体。
[0049]
统计方法：实验数据用mean
±
sem表示，使用graphpad prism5.0软件进行组间的双因素bonferroni测试的方差分析。
[0050]
实验结果如图6b
‑
e所示，表明柚皮素给药后，小鼠自发运动量没有受到影响，高浓度柚皮素能显著改善5xfad小鼠物体认知记忆功能，有增加位置记忆的趋势。
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及柚皮素在制备促进m1型小胶质细胞向m2极化的促进剂中的应用。
背景技术：
2.小胶质细胞(microglia)系神经组织中唯一来源于中胚层的细胞。已知小胶质细胞存在两种活化类型。存在促炎m1表型小胶质细胞和抗炎m2表型小胶质细胞。促炎m1表型小胶质细胞产生白细胞介素
‑
1β(il
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1β)、肿瘤坏死因子(tnf
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α)、诱导型一氧化氮合酶(inos)等。il
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1β是效应因子，在il
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1β的存在下，小胶质细胞引起脑内炎症，释放出自由基活性氧等自由基。另外，在产生il
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1β的小胶质细胞中，吞噬老化(破坏的)细胞等代谢废物的能力降低。因此，促炎m1表型小胶质细胞对神经细胞产生伤害。而抗炎m2表型小胶质细胞产生精氨酸酶
ꢀ‑
1(arg1)、白细胞介素
‑
10(il
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10)、白细胞介素
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4(il
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4)、转化生长因子(tgf)
‑
β1 等。arg1是效应因子，通过释放arg1，从而作用于保护神经细胞。抗炎m2 表型小胶质细胞在抑制脑内炎症的同时，吞噬老化细胞等代谢废物的能力高，因此，有抗炎作用、即对神经细胞有保护作用。
3.美国专利us15442473公开了转录因子nurr1和foxa2彼此相互作用以将神经胶质细胞从m1表型转变为建立治疗环境的m2表型；中国专利cn112007142a 公开了一种向抗炎m2表型小胶质细胞的极性转化促进剂，为一种新型的环状肽衍生物。柚皮素(naringenin)是从芸香科植物葡萄柚citrus paradisi macfadyen 以及橘、橙的干燥果实提取的黄酮类成分，具有抗菌、抗炎、抗癌、解痉和利胆等作用。近来实验发现柚皮素对大脑缺血再灌注损伤以及aβ诱导的神经元损伤均有一定的保护作用；而关于柚皮素在小胶质细胞的亚型分化中的作用，目前还未见报道。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供柚皮素在制备促进m1型小胶质细胞向m2极化的促进剂中的应用。
5.本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
6.本发明通过培养原代小胶质细胞，添加aβ诱导原代培养的小胶质细胞，再通过添加柚皮素研究柚皮素对小胶质细胞亚型分化的影响，实验结果表明，柚皮素促进aβ诱导的m1型小胶质细胞向m2极化，柚皮素的加入激活了m2型小胶质细胞的数量，从而高表达了aβ降解酶，进一步研究表明，柚皮素是通过上调pparγ的表达参与了其诱导m2小胶质细胞亚型的转化。因此，本发明请求保护关于柚皮素的以下用途：
7.柚皮素在制备促进m1型小胶质细胞向m2极化的促进剂中的应用。即柚皮素在制备促进促炎m1表型小胶质细胞向抗炎m2表型小胶质细胞极化的促进剂中的应用。
8.柚皮素在制备促进aβ降解酶表达的促进剂中的应用。
9.柚皮素在制备促进aβ降解酶基因表达的促进剂中的应用。
10.柚皮素在制备改善阿尔茨海默病患者记忆功能的药物中的应用。
11.具体地，所述m1型小胶质细胞为aβ诱导的m1型小胶质细胞。
12.优选地，所述柚皮素使用浓度为1～100μm。
13.优选地，所述柚皮素使用浓度为50～100μm。
14.本发明还提供一种促进m1型小胶质细胞向m2极化的促进剂，所述促进剂包含柚皮素。
15.优选地，所述促进剂还包含药学上可接受的辅料。
16.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
17.本发明提供了柚皮素在制备促进m1型小胶质细胞向m2极化的促进剂中的新用途。本发明研究表明，柚皮素促进aβ诱导的m1型小胶质细胞向m2极化，柚皮素的加入激活了m2型小胶质细胞的数量，从而高表达了aβ降解酶，进一步研究表明，柚皮素是通过上调pparγ的表达参与了其诱导m2小胶质细胞亚型的转化。柚皮素具有促进小胶质细胞从m1表型向m2表型转化的作用，在抑制炎症反应、清除毒性物质及修复损伤神经等方面具有较大的应用前景。
附图说明
18.图1为柚皮素和pparγ的autodock分子对接位点。
19.图2为柚皮素促进aβ诱导的m1型小胶质细胞向m2极化。(a)实验流程图；(b)代表性免疫荧光染色图片；(c)柚皮素促进aβ诱导的cd206
‑
inos
m1 型小胶质细胞向cd206
inos
‑
m2型极化。
20.图3为柚皮素激活小胶质细胞并促进对aβ的吞噬和降解作用。(a)实验流程图；(b)m1型小胶质细胞对aβ的吞噬作用；(c)非m1型小胶质细胞对aβ的吞噬作用(d)m2型小胶质细胞对aβ的吞噬作用；(e)非m2型小胶质细胞对aβ的吞噬作用。
21.图4为柚皮素上调小胶质细胞中pparγ和ide、nep的表达。(a)实验流程图； (b)代表性免疫荧光染色图片；(c)柚皮素上调小胶质细胞中pparγ的表达； (d)柚皮素上调小胶质细胞中ide的表达；(e)柚皮素上调小胶质细胞中nep 的表达。
22.图5为柚皮素通过pparγ上调小胶质细胞中ide、nep的表达。(a)实验流程图；(b)柚皮素改善aβ1
‑
42诱导的pparγ受体水平的降低；(c)柚皮素通过pparγ受体调控ide的表达；(d)柚皮素通过pparγ受体调控nep 的表达。
23.图6为柚皮素改善5xfad小鼠认知记忆功能。(a)行为学实验流程图； (b)给药期间小鼠体重变化；(c)10min内小鼠自发运动量；(d)物体认知记忆能力测试；(e)物体位置记忆能。
具体实施方式
24.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
25.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
26.柚皮素的化学结构式如下所示：
[0027][0028]
实施例1柚皮素与其作用靶点pparγ的分子对接研究
[0029]
方法：从pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中得到化合物柚皮素的3d结构，从rcsb pdb(http://www.rcsb.org/)数据库中筛选得到核心靶蛋白的晶体结构，利用pymol(version 2.4.0)去除蛋白中水分子和配体小分子，分离出蛋白的结构。采用autodock 4.2.6软件中遗传算法进行半柔性对接，盒子中心坐标和大小根据蛋白质分子的活性位点位置和其对配体小分子可能发生作用的区域进行设定，其余参数保持默认，对化合物和靶标蛋白进行分子对接分析。
[0030]
结果：分子对接是模拟配体小分子和受体生物大分子之间的相互作用，得到其最佳结合位置和结合强度，预测其亲和力。对柚皮素及其潜在靶点pparγ进行分子对接分析，分子之间结合能量较低的构象则较为稳定，筛选对接结果中结合能低的分子构象即为最优对接结果，并分析其结合位点。对接结果如图1所示，显示，柚皮素与pparγ受体大分子中的氨基酸残基glu259、arg280、arg288、 ser342能够较好的结合作用力，结合能为
‑
7.21kcal
·
mol
‑1，表明其具有良好的亲和力。
[0031]
实施例2柚皮素促进m1型小胶质细胞向m2极化
[0032]
原代小胶质细胞培养：ddy小鼠(p2
‑
4)5
‑
6只，酒精灭菌后分离大脑皮层，除去硬脑膜，切碎放置于dmem( fbs)培养基中，离心(1000rpm,3min)，移去上清液，加入0.25％trypsin 2ml，在37度，5％co2的培养箱中孵育30min，加入10％fbs
‑
dmem培养基4ml，离心(2000rpm,5min)，移去上清液，加入 dnase i/trypsine抑制剂2ml，在37度，10％co2的培养箱中孵育15min，加入 10％fbs
‑
dmem培养基4ml，离心(1000rpm,3min)，移去上清液，加入10％ fbs
‑
dmem培养基4ml，用胶头滴管吹打解离细胞，从底部加入15％bsa的pbs溶液2ml，离心(2000rpm,6min)，移去上清液，加入10％fbs
‑
dmem 培养基2ml，细胞计数并接种于6
‑
cm培养皿上(8*105个细胞)。培养14天后，细胞达到confluence状态时，分离小胶质细胞，用pbs润洗一次，加入不含血清的dmem 3ml和0.25％trypsin 1ml，在37度，5％co2的培养箱中孵育1h，移去上清液，用pbs润洗一次，加入0.25％trypsin 2ml，在37度,5％co2的培养箱中孵育5min，加入10％fbs
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dmem 4ml，用胶头滴管吹打解离细胞，细胞计数并接种于8孔细胞培养板上。
[0033]
试验方法：实验流程如图2a所示，将原代培养的小胶质细胞接种于8孔板上(1.5*104cells/well)，2h后分别加入aβ1
‑
42(1μm)24h，后除去含aβ的上清，加入空白对照(dmso)，阳性对照(il
‑
4)和柚皮素，培养24h后，4％pfa 固定细胞，加入一次抗体cd206(1:200,m2 marker)和inos(1:50,m1 marker)和二次抗体alexa fluor 488和594(invitrogen,carlsbad,ca,usa)进行免疫荧光染色，使用荧光显微镜(bx
‑
61/dp70,olympus)照相并用metamorph软件进行图像解析。
[0034]
试验结果如图2b
‑
c所示，显示柚皮素(50～100μm)能显著降低m1并升高m2小胶质细胞的比例，柚皮素嫩促进aβ诱导的cd206 inos
‑
m1型小胶质细胞向cd206
‑
inos m2型极化，表明柚皮素促进aβ诱导的m1型小胶质细胞向m2极化。
[0035]
实施例3柚皮素激活小胶质细胞对aβ的吞噬作用
[0036]
方法：实验流程如图3a所示，原代培养的小胶质细胞接种于8孔板上 (1.5*104cells/well)，1h后加入柚皮素(0.1～100μm)或阳性对照il4，培养4 h后加入aβ1
‑
42(1μm)继续培养24h，后除去含aβ和柚皮素的上清，加入aβ1
‑
42 hilyte fluor 488，培养3h后，4％pfa固定细胞，加入一次抗体cd206(1:200, m2 marker)或inos(1:50,m1 marker)和二次抗体alexa fluor 594(invitrogen, carlsbad,ca,usa)进行免疫荧光染色，使用荧光显微镜(bx
‑
61/dp70,olympus) 照相并用metamorph软件进行图像解析。
[0037]
结果如图3b所示，加入aβ1
‑
42后，小胶质细胞对荧光标记的aβ1
‑
42hilytefluor 488的吞噬能力大大增加，但随着柚皮素浓度的增加，含荧光标记aβ1
‑
42 的cd206阳性小胶质细胞的数量明显减少而inos阳性小胶质细胞数量不变，结果可能提示柚皮素的加入激活了m2型小胶质细胞的数量，从而高表达了aβ降解酶，对外源性异物进行降解，而m1型小胶质细胞的降解作用较弱。
[0038]
实施例4柚皮素调节小胶质细胞中aβ降解酶的表达
[0039]
方法：本实验首先探讨柚皮素对pparγ表达的影响，实验流程如图4a所示， bv2小胶质细胞接种于8孔板上(3000cells/well)，24h后加入柚皮素(1
‑
100μm) 或阳性对照吡格列酮(pparγ激动剂)，继续培养24h后，用4％pfa固定细胞，加入一次抗体ide(1:500)或nep(1:100)和pparγ(1:100)和二次抗体alexa fluor 594和488(invitrogen,carlsbad,ca,usa)进行免疫荧光染色，使用荧光显微镜 (bx
‑
61/dp70,olympus)照相并用metamorph软件进行图像解析。
[0040]
结果如图4b
‑
e所示：柚皮素浓度依存性的上调bv2小胶质细胞中pparγ和aβ降解酶ide、nep的表达，且pparγ高表达的细胞中ide和nep的表达也显著升高，该结果表明柚皮素上调pparγ的表达很可能参与了其诱导m2小胶质细胞亚型的转化。
[0041]
实施例5 pparγ抑制剂消除柚皮素对小胶质细胞中aβ降解酶的上调作用
[0042]
方法：实验流程如图5a所示，bv2小胶质细胞接种于8孔板上(3000 cells/well)，24h后加入gw9662(2μm)，0.5h后加入柚皮素(10和50μm)或阳性对照吡格列酮(pparγ激动剂10μm)，1h后加入aβ1
‑
42(1μm)，继续培养24h后，用4％pfa固定细胞，加入一次抗体ide(1:500)或nep(1:100)和 pparγ(1:100)和二次抗体alexa fluor 594和488(invitrogen,carlsbad,ca,usa) 进行免疫荧光染色，使用荧光显微镜(bx
‑
61/dp70,olympus)照相并用metamorph 软件进行图像解析。
[0043]
结果显示，柚皮素改善aβ1
‑
42诱导的pparγ受体水平的降低(图5b)；采用pparγ抑制剂gw9662，发现gw9662消除了柚皮素诱导的ide和nep的表达上升(图5c
‑
d)，表明柚皮素通过上调pparγ的表达参与其诱导m2小胶质细胞亚型的转化。
[0044]
实施例6柚皮素改善5xfad小鼠记忆功能
[0045]
柚皮素(5,100mg/kg/day)口服给与ad模型鼠5xfad(8
‑
12月龄)，21 天后进行自发性运动测试，第22天进行物体认知记忆实验(ort)，第29天进行物体位置记忆实验(olt)。
[0046]
自发活动测试：将小鼠放入自发活动装置中(长33cm，宽28cm，高26.5cm), 摄像机
拍摄10min内的活动过程并输入计算机，动物行为分析系统自动记录并分析小鼠的总路程。
[0047]
新物体认知记忆测试：训练时将两个相同的物体a和a’放置于自发活动装置(长33cm，宽28cm，高26.5cm)中，后将小鼠放入其中，让小鼠自发探索物体a和a’，并记录其探索次数(鼻子嗅物体和爪子攀爬物体)，计算小鼠探索物体a
‘
的概率为探索a’占a、a’总次数的百分率，即a’/(a a’)
×
100％。经过 48h后，将活动箱中的物体a’取出，换成不同的新奇物体b，再次将小鼠放入其中，让小鼠自发探索物体a和b，并记录其探索次数。计算小鼠探索物体b的概率b/(a b)
×
100％，见图6c，本测试基于小鼠更喜欢接触新奇的物体。
[0048]
位置记忆测试：训练时将活动箱的两侧贴上不同的图案，将两个相同的物体 a1和a2放置于自发活动箱中，后将小鼠放入其中，让小鼠自发探索物体a1和 a2，并记录其探索次数，计算小鼠探索物体a1的概率。经过48h后，将活动箱中的物体a1换到活动箱中另一个位置a1’，再次将小鼠放入其中，让小鼠自发探索物体a1’和a2，并记录其探索次数。计算小鼠探索a1’的概率a1’/(a1’ b)
ꢀ×
100％，见图6a，本测试基于小鼠更喜欢接触新位置的物体。
[0049]
统计方法：实验数据用mean
±
sem表示，使用graphpad prism5.0软件进行组间的双因素bonferroni测试的方差分析。
[0050]
实验结果如图6b
‑
e所示，表明柚皮素给药后，小鼠自发运动量没有受到影响，高浓度柚皮素能显著改善5xfad小鼠物体认知记忆功能，有增加位置记忆的趋势。
再多了解一些
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