一种钒纳米酶及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种钒纳米酶及其制备方法与应用。


背景技术：

2.光热治疗法是利用具有较高光热转换效率的材料，将其注射入人体内部，利用靶向性识别技术聚集在肿瘤组织附近，并在外部光源(一般是近红外光)的照射下将光能转化为热能来杀死癌细胞的一种治疗方法。常用的光热材料有金au、银ag、铂pt等贵金属，光热转换效率较高。如中国专利申请cn101711872a公开了一种纳米金纳米材料，该材料选择金为研究内容，具有准球壳形，内部为空心结构，不仅可以在近红外激光照射后使局部范围内的温度升高，结合抗肿瘤药物一起使用，杀死肿瘤细胞，还可以作为显影剂应用在红外断层成像技术中。但是，该材料采用的主要材料为金，原料价格昂贵成本高；另一方面，单独使用光热材料金所达到的抗肿瘤效果有限，无法完全清除肿瘤细胞，需要结合抗肿瘤药物才能较好地杀灭肿瘤细胞。因此，迫切需要提供一种对肿瘤细胞具有显著杀灭、清除效果的材料。


技术实现要素：

3.本发明要解决的技术问题是克服现有抗肿瘤光热材料成本高、清除肿瘤效果有限的缺陷和不足，提供一种成本低廉，具有催化作用且可以显著清除肿瘤细胞的钒纳米酶。
4.本发明的目的是提供一种钒纳米酶的制备方法。
5.本发明另一目的是提供所述钒纳米酶在制备防治肿瘤药物中的应用。
6.本发明另一目的是提供所述钒纳米酶作为催化剂在催化氧化还原反应中的应用。
7.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
8.本发明第一方面提供一种钒纳米酶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
9.s1、将钒粉分散在有机溶剂中并在冰浴条件下循环超声处理、离心，收集沉淀，得到钒纳米材料；
10.s2、将钒纳米材料配制成分散液，然后，在超声条件下向分散液中加入两亲性分子并继续超声处理，再进行搅拌反应、离心，收集沉淀，即得所述钒纳米酶。
11.进一步地，步骤s2中，所述两亲性分子为磷脂
‑
聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮或羟乙基淀粉。
12.更进一步地，步骤s1中，所述有机溶剂为n
‑
甲基吡咯烷酮、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。
13.进一步地，步骤s1中，所述循环超声处理为在100～1000w功率条件下，以开/关周期：2～8s/2～8s为循环，超声处理12～72h。优选地，所述循环超声处理的条件为在700w功率条件下，以开/关周期：5s/5s为循环，超声处理48h；所述离心为先以3000～8000rpm/min进行第一次离心，收集上清液，再以10000～50000rpm/min进行第二离心；优选地，所述第一
次离心时间为5～20min，所述第二次离心时间为15～30min。
14.更进一步地，步骤s1中，所述钒粉与有机溶剂的质量体积比为(0.1～10)g：(50～200)ml。优选地，所述钒粉与有机溶剂的质量体积比为(0.1～5)g：(50～100)ml；更优选地，所述钒粉与有机溶剂的质量体积比为1g：100ml。
15.进一步地，步骤s2中，所述钒纳米材料与两亲性分子的质量比为1：(0.5～4)。优选地，所述钒纳米材料与两亲性分子的质量比为1：(0.5～2)；更优选地，所述钒纳米材料与两亲性分子的质量比为1：2；所述离心转速为10000～50000rpm/min。
16.优选地，步骤s2中，所述钒纳米材料分散液中钒纳米材料的浓度为0.5～4mg/ml，溶剂为乙醇；所述向分散液中加入两亲性分子为向分散液中加入两亲性分子溶液，所述两亲性分子溶液中两亲性分子的浓度为0.5～4mg/ml，溶剂为丙酮
‑
乙醇混合溶液(丙酮：乙醇＝2:3)。
17.优选地，步骤s2中，所述搅拌反应为采用磁力搅拌器搅拌，转速为600～1500rpm，搅拌过夜。
18.优选地，步骤s2中，还包括对收集沉淀进行洗涤，所述洗涤的溶剂为乙醇。
19.更进一步地，步骤s2中，所述在超声条件下向分散液中加入两亲性分子并继续超声处理为为在冰浴、100～500w功率条件下向分散液中加入两亲性分子并继续超声处理一段时间。
20.更进一步地，本发明还提供了一种所述制备方法制备的钒纳米酶。所述钒纳米酶中的钒为五价、四价、三价中的一种或多种；所得钒纳米酶平均粒径为50～800nm。
21.另外的，本发明还提供了所述钒纳米酶在制备防治肿瘤药物中的应用。
22.优选地，所述药物可以结合光热治疗法对肿瘤进行治疗，能达到更好的肿瘤清除、治疗效果。
23.另外的，本发明还提供了所述钒纳米酶作为催化剂在催化氧化还原反应中的应用。研究证明，所述钒纳米酶作为催化剂具有类过氧化物酶、类辣根过氧化物酶、类氧化酶、类超氧化物歧化酶、类谷胱甘肽氧化酶、类过氧化氢酶中一种或多种酶的活性，是优异的天然酶替代品。
24.本发明钒纳米酶具有类过氧化物酶活性，能够催化肿瘤微环境中的过氧化氢(h2o2)产生大量的羟基自由基(
·
oh)杀死肿瘤细胞；具有类谷胱甘肽氧化酶活性，可以催化还原型谷胱甘肽(gsh)变成氧化型谷胱甘肽；具有类过氧化氢酶活性，可以催化肿瘤微环境中的h2o2产生氧气；具有多种酶活性的钒纳米酶可构成一个自级联调控肿瘤微环境的纳米平台，产生大量的
·
oh并耗竭细胞内的gsh，达到促进肿瘤细胞凋亡的效果。同时钒纳米酶具有的光热效应，结合光热治疗可进一步烧灼肿瘤，并增强纳米酶活性，协同作用实现优异的肿瘤治疗效果。
25.本发明具有以下有益效果：
26.本发明提供了一种钒纳米酶，所需原料来源广泛，制备方法简单且尺寸可控；具有生物相容性好且可生物降解的优点，并且同时具有较好的光热效应和催化活性，经过实验证明，本发明提供的钒纳米酶协同光热效应和催化活性可以显著杀灭、清除肿瘤细胞，达到治疗肿瘤疾病的效果。
附图说明
27.图1为本发明实施例1所得钒纳米酶的电镜扫描图。
28.图2为本发明实施例1所得钒纳米酶的元素分布分析mapping图谱。
29.图3为本发明实施例1所得钒纳米酶和钒粉的x射线光电子谱。
30.图4为本发明实施例1所得钒纳米酶和钒粉的x射线衍射图谱。
31.图5为本发明实施例1所得钒纳米酶的紫外
‑
可见光谱图。
32.图6为本发明实施例1所得钒纳米酶的光热性能研究统计图。
33.图7为本发明实施例1所得钒纳米酶的酶活性研究统计图；其中，a
‑
类过氧化氢酶、b
‑
类过氧化物酶、c
‑
类谷胱甘肽氧化酶。
34.图8为本发明实施例1所得钒纳米酶肿瘤细胞毒性试验研究统计图；a
‑
单一酶催化治疗、b
‑
酶催化
‑
光热协同治疗。
具体实施方式
35.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
36.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
37.实施例1
38.本实施例为一种钒纳米酶的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
39.s1、称取1g钒粉分散在100ml n
‑
甲基吡咯烷酮(nmp)中，冰浴条件下700w，以开/关周期：5s/5s为循环进行探头超声处理48h，再用低温超速离心机5000rpm/min离心10min，除去未剥离的钒晶体，收集上清液，20000rpm/min离心20min，收集沉淀，得钒纳米材料；
40.s2、将步骤s1所得钒纳米材料与乙醇制成1mg/ml的钒纳米材料分散液，在冰水浴300w超声条件下，向1ml钒纳米材料分散液中逐滴加入1ml二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇(dspe
‑
peg)溶液(2mg/ml，溶剂为丙酮:乙醇＝2:3)，继续超声30min，再600～1500rpm磁力搅拌过夜反应，反应结束后20000rpm离心20min，乙醇洗两次，即得。
41.实施例2
42.本实施例为一种钒纳米酶的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
43.s1、称取1g钒粉分散在100ml二甲基甲酰胺中，冰浴条件下1000w，以开/关周期：8s/8s为循环进行探头超声处理12h，再用低温超速离心机8000rpm/min离心5min，除去未剥离的钒晶体，收集上清液，50000rpm/min离心15min，收集沉淀，得钒纳米材料；
44.s2、将步骤s1所得钒纳米材料与乙醇制成1mg/ml的钒纳米材料分散液，在冰水浴300w超声条件下，向1ml钒纳米材料分散液中逐滴加入1ml二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇(dspe
‑
peg)溶液(2mg/ml，溶剂为丙酮:乙醇＝2:3)，继续超声30min，再600～1500rpm磁力搅拌过夜反应，反应结束后20000rpm离心20min，乙醇洗两次，即得。
45.实施例3
46.本实施例为一种钒纳米酶的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
47.s1、称取1g钒粉分散在100ml二甲基亚砜中，冰浴条件下300w，以开/关周期：2s/2s为循环进行探头超声处理72h，再用低温超速离心机3000rpm/min离心20min，除去未剥离的
钒晶体，收集上清液，25000rpm/min离心20min，收集沉淀，得钒纳米材料；
48.s2、将步骤s1所得钒纳米材料与乙醇制成1mg/ml的钒纳米材料分散液，在冰水浴300w超声条件下，向1ml钒纳米材料分散液中逐滴加入1ml二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇(dspe
‑
peg)溶液(2mg/ml，溶剂为丙酮:乙醇＝2:3)，继续超声30min，再600～1500rpm磁力搅拌过夜反应，反应结束后20000rpm离心20min，乙醇洗两次，即得。
49.以下以实施例1制备所得钒纳米酶为例进行结构特征及性能测试，其他实施例均可达到类似的效果。
50.试验例1钒纳米酶理化性质测定
51.对实施例1所得钒纳米酶进行电镜扫描分析，结果参见图1。由图可见，实施例1所得聚乙二醇修饰的钒纳米酶分散性好，粒径大小在180～220nm之间。
52.对实施例1所得钒纳米酶进行元素分布分析，作mapping图谱，结果如图2所示。由图可见，聚乙二醇修饰的钒纳米酶存在v、c、n、o元素，表明本发明的钒纳米酶制备成功。
53.对实施例1所得钒纳米酶和钒粉分别进行x射线光电子谱和x射线衍射图谱分析，结果如图3～4所示。由图可见，聚乙二醇修饰的钒纳米酶和钒粉均存在v、c、n、o元素，表明本发明的钒纳米酶制备成功且不掺杂副产物；钒纳米酶的特征吸收峰与钒粉的特征峰完全吻合，表明本发明的钒纳米酶制备成功且晶体结构未发生变化。
54.实验例2钒纳米酶光学性能测定
55.对实施例1所得钒纳米酶光学吸收进行评估，结果参见图5。由图可见，聚乙二醇修饰的钒纳米酶在紫外、可见光和近红外区均具有很强的光学吸收，且表现出浓度依赖性。
56.在808nm波长激光条件下，对聚乙二醇修饰的钒纳米酶的光热性能进行评估，结果如图6所示。
57.从图6a可看出，聚乙二醇修饰的钒纳米酶在808nm激光激发下具有较高的温度升高，具备优异的光热性能；从图6b可看出，聚乙二醇修饰的钒纳米酶的光热稳定性良好。可见，本发明制备的聚乙二醇修饰的钒纳米酶具备光热治疗烧灼肿瘤的所需温度。
58.实验例3钒纳米酶酶催化性能测定
59.对实施例1所得钒纳米酶的类过氧化氢酶活性进行测试，测试方法为：将不同浓度钒纳米酶(0、12.5、25、50μg/ml)分散在磷酸盐缓冲液(ph 7.4)中，一旦用注射器加入h2o2(10mm)，即用jpsj
‑
605f便携式溶解氧仪测量溶液不同时间点的氧气浓度，结果如图7a所示。
60.对实施例1所得钒纳米酶的类过氧化物酶活性进行测试，测试方法为：将不同浓度钒纳米酶(0、12.5、25、50、100μg/ml)分散在磷酸盐缓冲液(ph 7.4)中，然后加入10μg/ml亚甲基蓝指示剂，最后加入h2o2(10mm)，用紫外可见光光谱仪测量溶液不同时间点的紫外吸收，结果如图7b所示。
61.对实施例1所得钒纳米酶的类谷胱甘肽氧化酶活性进行测试，测试方法为：将不同浓度钒纳米酶(0、12.5、25、50、100μg/ml)分散在磷酸盐缓冲液(ph7.4)中，然后加入0.1mm gsh，最后利用5,5'
‑
二硫代双(2
‑
硝基苯甲酸)探针检测gsh的消耗，结果参见图7c。
62.从图7a可看出，聚乙二醇修饰的钒纳米酶在过氧化氢环境中具有很强的氧气产生能力，且具有浓度依赖性，表现出较强的类过氧化氢酶活性；从图7b可看出，聚乙二醇修饰的钒纳米酶具有显著的
·
oh产生能力，且具有浓度依赖性，表现出较强的类过氧化物酶活
性；从图7c可看出，聚乙二醇修饰的钒纳米酶具有明显的gsh氧化能力，可以减轻肿瘤抗氧化能力，表现出较强的类谷胱甘肽氧化酶活性。综上，聚乙二醇修饰的钒纳米酶具有类过氧化氢酶、类过氧化物酶和类谷胱甘肽氧化酶的能力，具备调控肿瘤微环境杀死肿瘤及预防肿瘤复发转移的能力。
63.实验例4钒纳米酶对肿瘤细胞活性测定
64.实施例1所得钒纳米酶对人乳腺癌细胞mcf
‑
7进行酶催化引发的毒性进行测试，测试方法为：将mcf
‑
7细胞以每孔8
×
103个细胞的密度接种于96孔板并培养12小时。用pbs洗涤一次后，将细胞与梯度浓度(0、3.13、6.25、12.5、25、50μg/ml)的钒纳米酶分别孵育12或24小时。用pbs洗涤后，使用cell counting kit
‑
8(cck
‑
8)孵育2小时，在450nm波长处测量吸光度，进行标准细胞活力测定以确定相对细胞活力，结果参见图8a。
65.实施例1所得钒纳米酶对人乳腺癌细胞mcf
‑
7进行酶催化
‑
光热协同引发的毒性进行测试，测试方法为：将mcf
‑
7细胞以每孔8
×
103个细胞的密度接种于96孔板并培养12小时。用pbs洗涤一次后，将细胞与梯度浓度(0、3.13、6.25、12.5、25、50μg/ml)的钒纳米酶共孵育6小时，然后进行808nm激光照射(1w/cm2,5min)。继续培养18小时，用pbs洗涤后，使用cell counting kit
‑
8(cck
‑
8)孵育2小时，在450nm波长处测量吸光度，进行标准细胞活力测定以确定相对细胞活力，结果参见图8b。
66.由图8a可见，在单一酶催化治疗下，聚乙二醇修饰的钒纳米酶对肿瘤细胞表现出一定毒性且呈现浓度依赖性；由图8b可见，在光热和酶催化协同治疗下，聚乙二醇修饰的钒纳米酶对肿瘤细胞的毒性得到了极大地增强，实现显著的肿瘤杀伤效果。
67.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。