一种花粉管超薄切片及其制备方法与流程

1.本发明涉及一种花粉管超薄切片及其制备方法，属于生物科学领域。


背景技术：

2.19世纪具有划时代意义的光学显微镜诞生，它的分辨率可达到200nm，相对于分辨能力小于0.1mm的人眼，它使人们可以从组织和细胞水平上直接进行观察。然而光学显微镜的分辨率不足以观察到细胞的超微结构。1932年电子显微镜产生，其分辨率达到0.1nm的水平，这使得分辨能力从微米升级到毫米，意味着人类打开了微观世界的大门。随着技术的不断创新和发展，电子显微镜及其相关技术也得到大力的提升，被广泛的运用到材料学，农学，病理学，病毒学，分子生物学的各个研究领域中。然而近年来，科研人员对细胞超微结构的研究不再局限于平面，而是获得细胞乃至组织水平的大尺寸三维结构，为相关生命现象的研究及应用奠定基础。
3.花粉管是一种高度极化的植物细胞，其顶管生长快速，专门将遗传物质从柱头上的授粉点传递到胚珠上的受精点。花粉管的生长是由来自高尔基体的分泌小泡与质膜持续融合而产生的，在生长过程中形成新的质膜和细胞壁。这一过程涉及到大量的囊泡转运，以及细胞的胞吞胞吐作用。花粉管作为一个研究植物细胞生长的模式体系,观察其内部超微结构，对于深入研究细胞极性生长、细胞间相互作用以及信号转导等均有重要的意义。
4.利用电子显微镜观察花粉内部结构，首先要将符合实验要求的花粉管通过固定，包埋等操作制样后切片才能观察。然而青杄花粉管在液体中萌发，体积较小，而且生长方向混乱，难以操作，不能保证切到花粉管的理想截面。因此，研究一种可以特异性选择花粉管，并且可以控制花粉管包埋方向的超薄切片制样方法具有重要意义。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种花粉管超薄切片及其制备方法，所解决的技术问题是利用纤维毛细管吸取花粉管，解决挑选特定发育形态的花粉管，以及控制花粉管包埋方向等问题。该制备方法操作简单，有利于花粉管超薄切片制样，切出理想的花粉管截面或是进行特异花粉管的三维重构。
6.本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种花粉管超薄切片的制备方法，其包括：
7.s1花粉培养：将花粉加入培养液中，进行悬浮培养，得到萌发的花粉管；
8.s2选取花粉管：将纤维毛细管剪成1.5
‑
3mm的长度；在体式显微镜下，用尖头镊子夹住纤维毛细管的一端，将另一端靠近花粉管，挑选并吸取形态饱满，长度小于1mm的花粉管；之后将吸入花粉管的纤维毛细管放置在载玻片上，滴上琼脂糖溶液，使纤维毛细管浸润在其中；
9.s3确认样品方向：待步骤s2得到的样品块凝固后，将其放于在体式显微镜下观察，确认样品块中花粉管的方向与纤维毛细管一致后，顺着纤维毛细管的方向，将样品块切割
为2x2x4mm的长方体，得到包有纤维毛细管的琼脂糖样品块；
10.s4固定花粉管：将步骤s3中包有纤维毛细管的琼脂糖样品块，放置于由戊二醛与多聚甲醛配制的固定液进行前固定，pbs缓冲液清洗，再使用1wt％的锇酸进行后固定；
11.s5利用1，3
‑
二氨基硫脲进行锇沉积：用1wt％的1，3
‑
二氨基硫脲处理，常温放置30min
‑
1h，再用1wt％的锇酸浸渍，进一步沉积锇；
12.s6块染：用2wt％的醋酸双氧铀对样品块进行块染，4℃放置8
‑
12小时或常温下放置4
‑
5h；
13.s7脱水：对步骤s6块染后的样品块进行乙醇梯度脱水，分别用30％(v/v)、50％(v/v)、60％(v/v)、70％(v/v)、80％(v/v)、90％(v/v)、95％(v/v)、100％(v/v)乙醇进行梯度脱水；
14.s8渗透：分别用乙醇与丙酮混合溶液、100％(v/v)丙酮、丙酮与spurr树脂混合溶液、100％(v/v)spurr树脂进行渗透处理；
15.s9包埋与聚合：将样品放入包埋板中，调整样品块在包埋板中的方向，将样品块较长的一面垂直于包埋板放置，再向包埋板中加入100％(v/v)spurr树脂，放于烘箱进行聚合；
16.s10修块与切片：在体式显微镜下，利用砂纸、刀片对步骤s9中得到的树脂块进行修块，使其呈金字塔型，顶端表面呈梯形并暴露出纤维毛细管纵向面；最后将样品块进行切片。
17.优选地，前述的花粉管超薄切片的制备方法中，其中步骤s1中，所述培养液的组成为：蔗糖12wt％；h3bo
3 0.01wt％；cacl
2 0.01wt％。
18.优选地，前述的花粉管超薄切片的制备方法中，其中步骤s1中，所述花粉与培养液比例为(0.2g
‑
1.0g)：3ml；所述悬浮培养的温度为22
‑
28℃，所述悬浮培养的转速为100
‑
180r/min。
19.优选地，前述的花粉管超薄切片的制备方法中，其中步骤s2中，所述纤维毛细管直径为225μm；所述琼脂糖溶液的温度为35
‑
45℃，熔点为65℃；所述琼脂糖溶液的浓度为0.01g/ml。
20.优选地，前述的花粉管超薄切片的制备方法中，其中步骤s4中，所述pbs缓冲液的浓度为0.1mol/l，ph值为7.2；所述固定液为体积比是1:1的2.4wt％的多聚甲醛水溶液与2wt％戊二醛水溶液的混合液。
21.优选地，前述的花粉管超薄切片的制备方法中，其中步骤s4中，所述pbs缓冲液与固定液存放于4℃冰箱，使用时置于冰上。
22.优选地，前述的花粉管超薄切片的制备方法中，其中步骤s4中，所述pbs缓冲液清洗具体包括：将前固定后的琼脂糖样品块用pbs缓冲液清洗3
‑
4次，每次10
‑
15min，充分洗去固定液。
23.优选地，前述的花粉管超薄切片的制备方法中，其中步骤s4中，将琼脂糖样品块放于1wt％的锇酸溶液中进行后固定，4℃放置2
‑
3h，随后用纯净水清洗3
‑
4次，每次10
‑
15min。
24.优选地，前述的花粉管超薄切片的制备方法中，其中步骤s5中，所述1wt％的1，3
‑
二氨基硫脲通过以下步骤制得：取0.05g 1，3
‑
二氨基硫脲溶于5ml纯净水中，包一层锡纸避光，再将配制好的1wt％的1，3
‑
二氨基硫脲放于60℃烘箱1h，每十分钟摇晃一次，最后用孔
径为0.22μm的过滤器过滤后使用。
25.优选地，前述的花粉管超薄切片的制备方法中，其中步骤s5中，所述用1wt％的1，3
‑
二氨基硫脲处理具体包括：将琼脂糖样品块中加入300微升1，3
‑
二氨基硫脲溶液，常温放置30min
‑
1h，用纯净水将1，3
‑
二氨基硫脲处理后的琼脂糖样品块清洗3
‑
4次，每次10
‑
15min。
26.优选地，前述的花粉管超薄切片的制备方法中，其中步骤s5中，所述用1wt％锇酸浸渍具体包括：将琼脂糖样品块浸入1wt％锇酸中，室温下放置1h，之后用纯净水清洗3
‑
4次，每次10
‑
15min。
27.优选地，前述的花粉管超薄切片的制备方法中，其中步骤s6中，所述2wt％醋酸双氧铀的块染剂用纯净水配制。
28.优选地，前述的花粉管超薄切片的制备方法中，其中步骤s8中，所述渗透具体包括：乙醇与丙酮渗透，用体积比为2:1、1:1、1:2的乙醇与丙酮混合溶液处理，分别处理18
‑
22min，之后用100％(v/v)的丙酮处理3
‑
4次，每次18
‑
22min；丙酮与spurr树脂渗透，用体积比为2:1、1:1、1:2的丙酮与spurr树脂混合溶液处理，分别处理3
‑
5h，之后用100％(v/v)的spurr树脂处理至少3次，每12h换一次液体。
29.优选地，前述的花粉管超薄切片的制备方法中，其中步骤s9中所述聚合的条件为：40℃聚合2小时，60℃聚合12小时。
30.优选地，前述的花粉管超薄切片的制备方法中，其中步骤s10中所述切片的厚度为100nm。
31.本发明的目的及解决其技术问题还可以采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种花粉管超薄切片，所述花粉管超薄切片的厚度为100nm。
32.优选地，前述的花粉管超薄切片中，所述花粉管超薄切片是通过上述任一的方法制得。
33.相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：
34.本发明利用纤维毛细管可吸取特定形态的花粉管，提高数量较少体积微小(长度小于2mm，直径小于225μm)类样品的可操作性以及选择性；将花粉管装入纤维毛细管，有利于包埋时定位花粉管的位置，并在后续切片时对花粉管进行定向；本发明特异性选择样品以及可以对样品进行定向的特点，有利于减小样品三维重构的成本，提高重构效率。
附图说明
35.图1为本发明实施例1的纤维毛细管图；
36.图2为本发明实施例1的形态各异的青杄花粉管图；
37.图3为本发明实施例1的装有青杄花粉管的纤维毛细管图；
38.图4为本发明实施例1的使用纤维毛细管吸取花粉管，并用琼脂糖预包埋后，进行超薄切片制样得到的切片图；
39.图5为本发明对比例1的直接将培养好的花粉管，用琼脂糖预包埋后，进行超薄切片制样得到的切片图；
40.图6为图4得到的花粉管切片细节图，其中a图为花粉管切片的3650x放大图；b图为10000x放大图；c图为35000x放大图；cw表示细胞壁，pm表示细胞膜，m表示线粒体，v表示液
泡。
具体实施方式
41.为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
42.以下材料或试剂，如非特别说明，均为购买。
43.本发明的实施例提供了一种青杄花粉管超薄切片的制备方法，其包括：
44.s1花粉培养：将0.2g
‑
1.0g青杄花粉加入3ml培养液中，在转速为100
‑
180r/min，温度为22
‑
28℃的摇床中进行悬浮培养，得到萌发的青杄花粉管；所述青杄花粉与培养液的比例优选为0.5g：3ml，该比例更适合青杄花粉的生长；若所述青杄花粉与培养液的比例低于0.2g：3ml，则萌发的青杄花粉管太少，挑选不出足够的发育型态正常的花粉管进行超薄切片制样；若所述青杄花粉与培养液的比例高于1.0g：3ml，则由于青杄花粉管的浓度太高不利于后续的纤维毛细管吸取；所述培养液的组成为：蔗糖12wt％、h3bo30.01wt％、cacl20.01wt％；所述摇床中的培养温度优选为25℃，温度太高或太低均不利于青杄花粉发育；所述摇床的转速优选为150r/min，转速太高或太低均不利于青杄花粉发育。
45.s2选取青杄花粉管：将直径为225μm的纤维毛细管剪成1.5
‑
3mm的长度，优选为2mm，这样优选后有利于夹取和包埋；若长度小于1.5mm，不便于夹取去吸入花粉管，若长度大于3mm，不便于后期的包埋；在体式显微镜下，用尖头镊子夹住纤维毛细管的一端，将另一端靠近花粉管，挑选并吸取形态饱满，长度小于1mm的花粉管；最后将吸入花粉管的纤维毛细管放在载玻片上，滴上温度为35
‑
45℃，熔点为65℃的琼脂糖溶液(0.01g/ml)，使纤维毛细管浸润在其中；所述琼脂糖溶液的温度优选为40℃，这样可以更好地包埋纤维毛细管，使得花粉管留在纤维毛细管中，而且有利于后续树脂包埋聚合时，确定花粉管的方向；若温度太高比如高于45℃则可能会破坏花粉管内部的精细结构，太低则琼脂糖容易凝固；花粉管装入纤维毛细管后再用琼脂糖包埋，有利于定位花粉管的位置，并在后续切片时对花粉管进行定向。
46.s3确认样品方向：为方便后续对样品进行定位，待样品块凝固后，将其放于体式镜下观察，确认样品块中青杄花粉管的方向与纤维毛细管一致(因为纤维毛细管比较大，肉眼可见，花粉管比较小，肉眼看不到，这样有利于确定花粉管的方向)，顺着纤维毛细管的方向，将样品块边缘多余的琼脂糖切除(不切去边缘的琼脂糖，琼脂块比较大，不容易夹取，而且不利于确定纤维管方向)，使样品块呈2x2x4mm的长方体型，长方体型容易确定毛细管的方向，得到包有纤维毛细管(吸入花粉管)的琼脂糖样品块；
47.s4固定花粉管：将步骤s3中包有纤维毛细管的琼脂糖样品块，放置于由戊二醛与多聚甲醛组成的固定液中，在真空条件(0.09mpa)下进行前固定1
‑
2h，pbs缓冲液清洗，再使用1wt％的锇酸进行后固定；所述固定液为2.4wt％多聚甲醛与2wt％戊二醛的混合溶液，其通过以下步骤制得：将4wt％的戊二醛水溶液与4.8wt％的多聚甲醛水溶液按1:1的体积比混合均匀即可；所述pbs缓冲液的浓度为0.1mol/l，ph值为7.2；pbs缓冲液与固定液均需存放于4℃冰箱，使用时置于冰上；前固定后需用pbs缓冲液将前固定后的植物样品清洗3
‑
4次，每次10
‑
15min，充分洗去固定液；使用1wt％的锇酸进行后固定，4℃环境下放置2h，之后
必需用纯净水清洗3
‑
4次，每次10
‑
15min；之所以采用两次固定是因为，前固定固定的组织有限，后固定会加强对一些物质的固定，还可以染色；而两次固定之间使用pbs缓冲液清洗是为了避免前固定使用的固定液和后边的锇酸反应。
48.s5利用1，3
‑
二氨基硫脲(tch)进行锇沉积：用1wt％的1，3
‑
二氨基硫脲水溶液处理，常温放置30min
‑
1h，再用1wt％的锇酸浸渍，进一步沉积锇；具体地，所述1wt％的1，3
‑
二氨基硫脲水溶液通过以下步骤制得：先称取0.05g tch溶于5ml纯净水中，包一层锡纸避光，再将配制好的1wt％的tch放于60℃烘箱1h，每十分钟摇晃一次，最后用孔径为0.22μm的过滤器过滤后使用；将清洗后的琼脂糖样品块放入300微升tch溶液中，常温放置30min
‑
1h，后用纯净水将tch处理后的植物样品块清洗3
‑
4次，每次10
‑
15min，再用1wt％的锇酸进行锇沉积，室温下放置1h，之后用纯净水清洗3
‑
4次，每次10
‑
15min(一般选择10min)；
49.s6块染：用2wt％的醋酸双氧铀对样品块进行块染，4℃放置8
‑
12小时(一般选择8h即可)或常温下放置4
‑
5h；醋酸双氧铀可进行非特异性地染色，加深染色。
50.s7脱水：对块染后的样品块进行乙醇梯度脱水，分别用30％(v/v)、50％(v/v)、60％(v/v)、70％(v/v)、80％(v/v)、90％(v/v)、95％(v/v)、100％(v/v)乙醇进行梯度脱水；之所以选择梯度脱水是由于梯度脱水的脱水效果较好；
51.s8渗透：分别用乙醇与丙酮混合溶液、100％(v/v)丙酮、丙酮与spurr树脂混合溶液、100％(v/v)spurr树脂进行渗透处理；具体地，乙醇与丙酮渗透：用体积比为2:1、1:1、1:2的乙醇与丙酮混合溶液处理，分别处理18
‑
22min，之后用100％(v/v)的丙酮处理3
‑
4次，每次18
‑
22min；丙酮与spurr树脂渗透：用体积比为2:1、1:1、1:2的丙酮与spurr树脂混合溶液处理，分别处理3
‑
5h，之后用100％(v/v)的spurr树脂处理至少3次(例如3次)，每12h换一次液体；这样采用多种试剂分多次进行渗透处理可以使得渗透效果较好，提高样品质量，不容易出现碎片等现象。
52.s9包埋与聚合：根据对样品观察的要求，将样品放入包埋板中，调整样品块在包埋板中的方向。将样品块较长的一面，即纤维毛细管纵向面垂直于包埋板放置，再向包埋板中加入100％(v/v)spurr树脂，放于烘箱进行聚合；所述聚合的条件为：40℃聚合2小时，60℃聚合12小时，以使得spurr树脂更好地聚合，便于后续切片。
53.s10修块与切片：在体式显微镜下，利用砂纸、刀片对步骤s9中得到的树脂块进行修块，将多余的树脂修掉，使其呈金字塔型，顶端表面呈梯形(例如上底为2mm，下底为3mm，高为2mm)并暴露出纤维毛细管纵向面；最后将样品块装于切片机上，进行切片，切片为厚度为100nm。
54.切片后将其放置于收集带上进行收集，将收集带上的厚度为100nm的超薄切片，在扫描电镜下观察成像，见图6。
55.本发明使用纤维毛细管可以实现对花粉管方向的控制，该操作简单，不需要耗费大量的样品及药品，制备大量花粉管超薄切片，从中挑选花粉管纵切面图。该方法可直接在制样过程中特异性选定发育饱满的花粉管，并可控制其方向。当样品在树脂块中进行聚合时，通过调整琼脂糖预包埋的长方体样品块方向，使长方体块较长的一面既纤维管纵向面，垂直于包埋板，平行于树脂块侧面。由于花粉管平行于纤维毛细管，所以花粉管的纵向面平行于树脂块侧面，从而较为轻松的得到花粉管顶端纵向切片图，如图4，图6。
56.以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
57.实施例1
58.样品培养
59.称取0.5g青杄花粉于3ml培养基中，放于转速为160r/min，温度为25℃的摇床里，进行悬浮培养，得到萌发的青杄花粉管，见图2。从图2中可以看出，青杄花粉管的发育状态各不相同，有长有短，甚至有些青杄花粉发育形态不正常；而且青杄花粉管较小，其长度一般小于1mm，宽度小于200μm，肉眼很难观察清楚，需要借助显微镜；青杄花粉管的培养环境为液体，更加增大了操作难度。
60.样品制备
61.选取青杄花粉管：将图1所示的直径为225μm的纤维毛细管剪成约2mm长度。在体式显微镜下，用尖头镊子夹住纤维毛细管的一端，将另一端靠近青杄花粉管，吸取形态饱满的青杄花粉管，如图3所示，纤维毛细管可以吸取单个花粉管，实现特异性挑选花粉管的作用。最后将吸入青杄花粉管的纤维毛细管放在载玻片上，滴上温度为40℃的琼脂糖溶液(熔点为65℃，浓度为0.01g/ml)，使纤维毛细管浸润在其中。
62.确认样品方向：待样品块凝固后，将其放于体式显微镜下观察，确认样品块中青杄花粉管的方向与纤维毛细管一致后，顺着纤维毛细管的方向，将样品块边缘多余的琼脂糖切除，使样品块约呈2x2x4mm的长方体型。图4为使用纤维毛细管吸取花粉管，并用琼脂糖预包埋后，进行超薄切片制样、切片后得到的扫面电镜图。如图4所示，花粉管顺着纤维毛细管的方向(花粉管平行于纤维毛细管)，通过控制纤维毛细管的方向，可以实现在制样和切片中对花粉管方向的控制。
63.前固定：将样品块放置于由2wt％戊二醛、2.4wt％多聚甲醛(二者体积比为1:1)组成的固定液中进行固定，真空处理1h。注意固定液存放于4℃冰箱，使用时置于冰上。
64.漂洗：用0.1m的pbs缓冲液漂洗经过前固定的样品，清洗3次，每次10min；pbs缓冲液存放于4℃冰箱，使用时置于冰上。
65.后固定：使用1wt％的锇酸对漂洗后的样品进行后固定，4℃环境下放置2h。
66.漂洗：用纯净水将经过后固定的样品清洗3次，每次10min。
67.配制1wt％的tch：称取0.05gtch溶于5ml纯净水中，包一层锡纸避光，再将配制好的1wt％的tch放于60℃烘箱1h，每十分钟摇晃一次，最后用孔径0.22μm的过滤器过滤备用。
68.tch处理：用1wt％的tch对漂洗后的样品进行处理，室温下放置30min。
69.漂洗：用纯净水将tch处理后的样品清洗3次，每次10
‑
15min。
70.锇沉积：用1wt％的锇酸对漂洗后的样品进行浸渍，室温下放置1h。
71.漂洗：用纯净水将锇沉积后的样品清洗3次，每次10min。
72.块染：用2wt％的醋酸双氧铀对漂洗后的样品进行块染，4℃放置8h或室温下放置4h。
73.漂洗：用纯净水对块染后的样品清洗3次，每次10min。
74.脱水：分别用30％(v/v)、50％(v/v)、60％(v/v)、70％(v/v)、80％(v/v)、90％(v/v)、95％(v/v)、100％(v/v)乙醇对漂洗后的样品进行梯度脱水每次15min，100％乙醇脱水3次。
75.乙醇与丙酮渗透：用体积比为2:1、1:1、1:2的乙醇与丙酮混合溶液处理，分别处理20min，之后用100％(v/v)丙酮处理3次，每次20min。
76.丙酮与spurr树脂渗透：用丙酮与spurr树脂的体积比为2:1、1:1、1:2的溶液处理，分别处理3h，之后用100％(v/v)spurr树脂处理3次，每12h换一次液体。
77.包埋与聚合：根据对样品观察的要求，调整样品块在包埋板中的方向。将样品块较长的一面，既纤维毛细管纵向面垂直于包埋板放置，再向包埋板中加入100％(v/v)spurr树脂，放于烘箱进行聚合(40℃聚合2小时，60℃聚合12小时)。
78.修块与切片：在体式显微镜下，利用砂纸、刀片对之前中得到的树脂块进行修块，将多余的树脂修掉，使其呈金字塔型，顶端表面呈梯形(上底为2mm，下底为3mm，高为2mm)并暴露出纤维毛细管纵向面。最后将样品块装于切片机上，进行切片，切片厚度为100nm。
79.扫描电镜观察：将切片置于收集带上进行收集，再将收集带上的厚度为100nm的超薄切片，在扫描电镜下观察成像，见图4、图6。图4为电镜下装有花粉管的纤维毛细管整体切片图，从图4中可以看到纤维毛细管及花粉管。图6为图4得到的花粉管切片细节图，其中a图为花粉管切片的3650x放大图；b图为10000x放大图；c图为35000x放大图；在切片成像中可以清晰地观察到花粉管细胞中的液泡(v)(图6a)；细胞壁(cw)及细胞膜(pm)(图6b)；线粒体(m)(图6c)。
80.对比例1
81.样品培养
82.称取0.5g青杄花粉于3ml培养基中，放于转速为160r/min，温度为25℃的摇床里，进行悬浮培养，得到萌发的青杄花粉管，见图2。
83.样品制备
84.花粉管预包埋：吸取10微升青杄花粉管与培养液的混合物，与20微升，40℃的0.01g/ml的琼脂糖溶液(熔点为65℃)混合均匀后，滴于玻璃载玻片上，待其凝固后，将含有花粉管的琼脂块切块，使样品块约呈2x2x4mm的长方体型。图5为直接将培养好的花粉管，用琼脂糖预包埋后，进行超薄切片制样、切片后得到的扫面电镜图。从图5中可以看出，花粉管方向各异，很难得到花粉管顶端的纵切图。
85.前固定：将样品块放置于由2wt％戊二醛、2.4wt％多聚甲醛组成的固定液中进行固定，真空处理1h。注意固定液存放于4℃冰箱，使用时置于冰上。
86.漂洗：用0.1m的pbs缓冲液漂洗经过前固定的样品，清洗3次，每次10min；pbs缓冲液存放于4℃冰箱，使用时置于冰上。
87.后固定：使用1wt％的锇酸对漂洗后的样品进行后固定，4℃环境下放置2h。
88.漂洗：用纯净水将经过后固定的样品清洗3次，每次10min。
89.配制1wt％的tch：称取0.05gtch溶于5ml纯净水中，包一层锡纸避光，再将配制好的1wt％的tch放于60℃烘箱1h，每十分钟摇晃一次，最后用孔径0.22μm的过滤器过滤备用。
90.tch处理：用1wt％的tch对漂洗后的样品进行处理，室温下放置30min
‑
1h。
91.漂洗：用纯净水将tch处理后的样品洗3次，每次10min。
92.锇沉积：用1wt％的锇酸对漂洗后的样品进行浸渍，室温下放置1h。
93.漂洗：用纯净水将锇沉积后的样品清洗3次，每次10min。
94.块染：用2wt％的醋酸双氧铀对漂洗后的样品进行块染，4℃放置8h或室温下放置4h。
95.漂洗：用纯净水对块染后的样品清洗3次，每次10min。
96.脱水：分别用30％(v/v)、50％(v/v)、60％(v/v)、70％(v/v)、80％(v/v)、90％(v/v)、95％(v/v)、100％(v/v)乙醇对漂洗后的样品进行梯度脱水每次15min，100％(v/v)乙醇脱水3次。
97.乙醇与丙酮渗透：用体积比为2:1、1:1、1:2的乙醇与丙酮混合溶液处理，分别处理20min，之后用100％(v/v)丙酮处理3次，每次20min。
98.丙酮与spurr树脂渗透：用体积比为2:1、1:1、1:2的丙酮与spurr树脂混合溶液处理，分别处理3h，之后用100％(v/v)spurr树脂处理至少3次，每12h换一次液体。
99.包埋与聚合：将样品块放在包埋板中，再向包埋板中加入100％(v/v)spurr树脂，放于烘箱进行聚合(40℃聚合2小时，60℃聚合12小时)。
100.修块与切片：在体式显微镜下，利用砂纸、刀片对之前得到的树脂块进行修块，将多余的树脂修掉，使其呈金字塔型，顶端表面呈梯形(上底为2mm，下底为3mm，高为2mm)并暴露出样品。最后将样品块装于切片机上，进行切片，切片厚度为100nm。
101.扫描电镜观察：将切片置于收集带上进行收集，再将收集带上厚度为100nm的超薄切片，在扫描电镜下观察成像，见图5。如图5所示，切片图像中花粉管形态各异，很难找到实验所需的花粉管纵切图片，而且该图片中花粉管的细胞结构保留的不够完整。
102.在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
103.本发明中所述的数值范围包括此范围内所有的数值，并且包括此范围内任意两个数值组成的范围值。本发明所有实施例中出现的同一指标的不同数值，可以任意组合，组成范围值。
104.本发明权利要求和/或说明书中的技术特征可以进行组合，其组合方式不限于权利要求中通过引用关系得到的组合。通过权利要求和/或说明书中的技术特征进行组合得到的技术方案，也是本发明的保护范围。
105.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。