一种花粉管超薄切片及其制备方法与流程

技术特征：
1.一种花粉管超薄切片的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：s1花粉培养：将花粉加入培养液中，进行悬浮培养，得到萌发的花粉管；s2选取花粉管：将纤维毛细管剪成1.5
‑
3mm的长度；在体式显微镜下，用尖头镊子夹住纤维毛细管的一端，将另一端靠近花粉管，挑选并吸取形态饱满，长度小于1mm的花粉管；之后将吸入花粉管的纤维毛细管放置在载玻片上，滴上的琼脂糖溶液，使纤维毛细管浸润在其中；s3确认样品方向：待步骤s2得到的样品块凝固后，将其放于体式显微镜下观察，确认样品块中花粉管的方向与纤维毛细管一致后，顺着纤维毛细管的方向，将样品块切割为2x2x4mm的长方体，得到包有纤维毛细管的琼脂糖样品块；s4固定花粉管：将步骤s3中包有纤维毛细管的琼脂糖样品块，放置于由戊二醛与多聚甲醛配制的固定液进行前固定，pbs缓冲液清洗，再使用1wt％的锇酸进行后固定；s5利用1，3
‑
二氨基硫脲进行锇沉积：用1wt％的1，3
‑
二氨基硫脲处理，常温放置30min
‑
1h，再用1wt％的锇酸浸渍，进一步沉积锇；s6块染：用2wt％的醋酸双氧铀对样品块进行块染，4℃放置8
‑
12小时或常温下放置4
‑
5h；s7脱水：对步骤s6块染后的样品块清洗后进行乙醇梯度脱水，分别用30％(v/v)、50％(v/v)、60％(v/v)、70％(v/v)、80％(v/v)、90％(v/v)、95％(v/v)、100％(v/v)乙醇进行梯度脱水；s8渗透：分别用乙醇与丙酮混合溶液、100％(v/v)丙酮、丙酮与spurr树脂混合溶液、100％(v/v)spurr树脂进行渗透处理；s9包埋与聚合：将样品放入包埋板中，调整样品块在包埋板中的方向，将样品块较长的一面垂直于包埋板放置，再向包埋板中加入100％(v/v)spurr树脂，放于烘箱进行聚合；s10修块与切片：在体式显微镜下，利用砂纸、刀片对步骤s9中得到的树脂块进行修块，使其呈金字塔型，顶端表面呈梯形并暴露出纤维毛细管纵向面；最后将样品块进行切片。2.如权利要求1所述的花粉管超薄切片的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述培养液的组成为：蔗糖12wt％；h3bo
3 0.01wt％；cacl
2 0.01wt％。3.如权利要求1所述的花粉管超薄切片的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述花粉与培养液比例为(0.2g
‑
1.0g)：3ml；所述悬浮培养的温度为22
‑
28℃，所述悬浮培养的转速为100
‑
180r/min。4.如权利要求1所述的花粉管超薄切片的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述纤维毛细管直径为225μm；所述琼脂糖溶液的温度为35
‑
45℃，熔点为65℃；所述琼脂糖溶液的浓度为0.01g/ml。5.如权利要求1所述的花粉管超薄切片的制备方法，其特征在于，步骤s4中，所述pbs缓冲液的浓度为0.1m，ph值为7.2；所述固定液为体积比是1:1的2.4wt％的多聚甲醛水溶液与2wt％戊二醛水溶液的混合液。6.如权利要求1所述的花粉管超薄切片的制备方法，其特征在于，步骤s4中，所述pbs缓冲液清洗具体包括：将前固定后的琼脂糖样品块用pbs缓冲液清洗3
‑
4次，每次10
‑
15min，充分洗去固定液；再将该琼脂糖样品块放于1wt％的锇酸溶液中进行后固定，4℃放置2
‑
3h，随后用纯净水清洗3
‑
4次，每次10
‑
15min。
7.如权利要求1所述的花粉管超薄切片的制备方法，其特征在于，步骤s5中，所述1wt％的1，3
‑
二氨基硫脲通过以下步骤制得：取0.05g 1，3
‑
二氨基硫脲溶于5ml纯净水中，避光，再将配制好的1wt％的1，3
‑
二氨基硫脲放于60℃烘箱1h，每10分钟摇晃一次，最后用孔径为0.22μm的过滤器过滤后使用；所述用1wt％的1，3
‑
二氨基硫脲处理具体包括：将琼脂糖样品块中加入300微升1，3
‑
二氨基硫脲溶液，常温放置30min
‑
1h，用纯净水将1，3
‑
二氨基硫脲处理后的琼脂糖样品块清洗3
‑
4次，每次10
‑
15min；所述用1wt％锇酸浸渍具体包括：将琼脂糖样品块浸入1wt％锇酸中，室温下放置1h，之后用纯净水清洗3
‑
4次，每次10
‑
15min。8.如权利要求1所述的花粉管超薄切片的制备方法，其特征在于，步骤s8中，所述渗透具体包括：乙醇与丙酮渗透：用体积比为2:1、1:1、1:2的乙醇与丙酮混合溶液处理，分别处理18
‑
22min，之后用100％(v/v)的丙酮处理3次，每次18
‑
22min；丙酮与spurr树脂渗透：用体积比为2:1、1:1、1:2的丙酮与spurr树脂混合溶液处理，分别处理3
‑
5h，之后用100％(v/v)的spurr树脂处理至少3次，每12h换一次液体。9.如权利要求1所述的花粉管超薄切片的制备方法，其特征在于，步骤s9中，所述聚合的条件为：40℃聚合2小时，60℃聚合12小时；步骤s10中，所述切片的厚度为100nm。10.一种花粉管超薄切片，其特征在于，所述花粉管超薄切片的厚度为100nm；所述花粉管超薄切片是通过权利要求1
‑
9任一项的方法制得。

技术总结
本发明是关于一种花粉管超薄切片及其制备方法，该方法包括：花粉培养；选取花粉管；确认样品方向；固定花粉管；利用1，3


技术研发人员：李晓娟 姚小敏 张御格
受保护的技术使用者：北京林业大学
技术研发日：2021.08.16
技术公布日：2021/11/24