一种
α
1微球蛋白微量检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物学检测方法技术领域，具体涉及一种α1微球蛋白微量检测方法。
背景技术：
2.α1微球蛋白是由人体的肝脏和淋巴细胞合成，分子量约为33000道尔顿的糖蛋白。它由167个氨基酸组成.与人类白细胞抗原hla
‑
a11，hla
‑
b20和hla
‑
51等抗原决定簇有交叉反应。自从1975年ekstron等从慢性镉中毒病人尿液中分离出α1微球蛋白(α
‑
microglobulin，简称α
‑
mg〕以来，国外学者对α1
‑
mg的来源，生化特性以及临床应用价值等进行了大量研究。α1
‑
mg广泛存在于人体各种体液及淋巴细胞膜表面，血液中的α1
‑
mg以两种形式存在，即游离的α1
‑
mg和与iga结合的α1
‑
mg(α1mg
‑
1ga)。正常情况下，α1mg
‑
1ga约占血液中总α1
‑
mg的40
‑
70％，血液中免疫球蛋白水平对α1
‑
mg及α1mg
‑
1ga之间的比例有影响。血液中游离的α1
‑
mg可自由通过肾小球滤过膜，95％
‑
99％在肾近曲小管重吸收和代谢，只有微量从终尿排出；而结合型的α1
‑
mg则不能通过肾小球，其在尿液中的浓度为零。一般认为α1
‑
mg在血清及尿液中增高的原因有：
①
肾小管重吸收和代谢α1
‑
mg的能力降低；
②
肾小球滤过功能受损；
③
体内合成过多；
④
淋巴细胞破坏释放。基于上述
①
、
②
两点以及大量的临床实验研究证实，目前人们普遍认为血清及尿液中α1
‑
mg的测定可作为反应肾小管重吸收功能受损的一项灵敏指标，而且在某种程度上还优于β2
‑
微球蛋白。又鉴于尿液样品采集的方便性以及处理方法简单，因此，尿液中α1
‑
mg的测定方法更加广泛地被应用于肾病诊断中。不同的方法测定的α1
‑
mg值有所差别，而相同的方法在不同的实验室条件下所测定的结果则大同小异。α1
‑
mg尿液中正常含量为0.48
‑
4.24mg/l，这一指标升高，通常指示患者患有各种肾病导致的肾功能不全(如肾小球损伤早期、原发性肾小球肾炎、间质性肾炎、糖尿病肾病、狼疮肾、急慢性肾功能衰竭等)或iga型骨髓瘤、肝癌等。这一指标降低，则常见于重度肝功能损害的肝病患者。由于α1
‑
mg尿液中正常含量本身较低，加之判定这一指标降低的表现及其程度可用于疾病诊断，因此，准确定量尿液中微量α1
‑
mg的方法是比较实用的，尿液中α1
‑
mg含量检测方法的检测限(灵敏度)以及准确性就显得尤为重要，目前的检测方法中，检测限普遍在0.2
‑
0.5mg/l左右，对“尿液中微量α1
‑
mg准确定量检测”这一需求来说，仍然不够精细，另外，目前的检测方法，检测或样本保存过程中α1
‑
mg均存在不同程度的不稳定且不可控的变性或分解等，导致标准曲线现行不佳、检测结果不准确。
技术实现要素：
3.为解决上述现有方法灵敏度不高、样本不稳定等导致的检测方法不精细、不准确等问题，本发明提供一种新的α1微球蛋白微量检测方法，方案如下：
4.一种α1微球蛋白微量检测方法，包括以下步骤：
5.s1、将试剂a与样本混合，加入试剂b，混合，孵育；
6.s2、加入试剂c混合，读取吸光度值，记为吸光度值ⅰ；
7.s3、计时反应后，再次读取吸光度值，记为吸光度值ⅱ；
8.s4、计算吸光度值ⅱ与吸光度值ⅰ的差值，制作所得差值对样本中α1微球蛋白浓度的回归方程logit
‑
log(4p)函数曲线，根据待测样本所得差值，代入函数曲线计算待测样本中α1微球蛋白的浓度；
9.所述试剂a中包括聚乙二醇、乙二胺四乙酸锌钠、缓冲液；
10.所述试剂b中包括聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、缓冲液；
11.所示试剂c中包括只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、缓冲液。
12.优选地，所述试剂b中，聚乙烯吡咯烷酮浓度为5
‑
25g/l，氯化钠浓度为1
‑
3g/l。
13.优选地，所述试剂b中的缓冲液包括50
‑
100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
14.优选地，所述试剂a中聚乙二醇浓度为0.09
‑
0.12wt％，乙二胺四乙酸锌钠浓度为0.05
‑
0.1wt％。
15.优选地，所述试剂a中的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、mops缓冲液或taps缓冲液。
16.优选地，所述试剂b中还包括浓度为0.1
‑
0.15wt％的聚乙二醇和浓度为0.7
‑
1.5wt％的海藻糖。
17.优选地，所述试剂c中还包括0.03
‑
0.09wt％的氯化钾。
18.优选地，所述试剂c中还包括0.1
‑
0.2wt％的透明质酸钠。
19.优选地，所述试剂a的制备方法包括：将试剂a中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀；当所述试剂a中包括聚乙二醇时，将试剂a中包括的全部物质除聚乙二醇外均添加到其中的缓冲液中，混合均匀，然后再添加聚乙二醇，混合均匀。
20.优选地，所述试剂b的制备方法包括：将试剂b中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀，当试剂b中包括海藻糖时，在最后加入海藻糖，混合均匀。
21.优选地，所述试剂c的制备方法包括：将试剂c中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀，当试剂c中包括透明质酸钠时，在最后加入透明质酸钠，混合均匀。
22.优选地，s1所述样本包括α1微球蛋白标准品梯度浓度溶液或α1微球蛋白待测样本。
23.优选地，s1所述α1微球蛋白标准品梯度浓度溶液包括浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.40、1.00、2.00、4.00、6.00、10.00(mg/l)的α1微球蛋白标准品溶液。
24.优选地，所述方法采用全自动生化分析仪进行，进行α1微球蛋白待测样本检测时采用的全自动生化分析仪进行与计算其浓度所使用的函数曲线检测时采用的全自动生化分析仪型号相同、检测过程中参数相同。
25.优选地，s1所述试剂a用量为0.5μl，样本加入量为2.3μl，试剂b用量为200μl。
26.优选地，s1所述孵育，包括在37℃条件下孵育5min。
27.优选地，s2所述试剂c用量为50μl。
28.优选地，s3所述计时反应，反应温度37℃，反应时间5min。
29.优选地，s2、s3所述读取吸光度值，包括体系在波长546nm的吸光度值。
30.优选地，所述试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径大于只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径。
31.优选地，所述试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为350
‑
400nm，只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为
150
‑
250nm。
32.优选地，所述试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.05％
‑
0.1％(w/v)；只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.1％
‑
0.4％(w/v)。
33.优选地，所述试剂c中，标记的α1微球蛋白单克隆抗体的终浓度为0.010％
‑
0.015％(w/v)；标记的α1微球蛋白多克隆抗体的终浓度为0.02％
‑
0.08％(w/v)。
34.优选地，所述试剂c中的缓冲液包括50
‑
100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
35.有益效果
36.本发明的有益效果在于：
37.本发明采用非常简单的试剂组合物、非常短的时间(样本与试剂a混合)，即可实现对含α1微球蛋白的样本中α1微球蛋白的稳定，通过实施例及对比例验证，采用上述手段能够有效减少后续检测过程中样本中α1微球蛋白的变性或降解等过程，提高检测方法的灵敏度和准确性，但该手段仅在短时间内有效，在样本混合试剂a后放置10min以上不进行后续步骤即失去效果，且在试剂a中的两种有效组分中，乙二胺四乙酸锌钠起到至关重要的作用。
38.试剂b中同时加入聚乙二醇和海藻糖后，检测方法的灵敏度得到有效提升，单纯加入二者其一时并不能达到如此显著的效果。
39.试剂c中加入氯化钾后，有效提高回归函数曲线及整体检测方法的准确度，大大降低了检测误差。
40.试剂c中加入透明质酸钠后，进一步有效提高回归函数曲线及整体检测方法的准确度，大大降低了检测误差。
41.本发明提供的上述方法，所得回归函数曲线在0.10
‑
10.00mg/l范围内均具备良好的相关系型，检测限为0.10mg/l。
具体实施方式
42.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
43.除非特别指出，以下实施例和对比例为平行试验，采用同样的处理步骤和参数。以下实施例采用的全自动生化分析仪为日立7060全自动生化分析仪，采用的分析方法为两点终点法，但本发明提供的方法适用于市面上绝大多数全自动生化分析仪，分析方法、参数等也可在试剂使用原理范围内进行适当调整。
44.制备例1试剂a制备
45.试剂aⅰ46.试剂a中包括聚乙二醇、乙二胺四乙酸锌钠、缓冲液；
47.试剂a中的缓冲液包括磷酸盐缓冲液。
48.试剂a中聚乙二醇浓度为0.09wt％，乙二胺四乙酸锌钠浓度为0.05wt％。
49.试剂a的制备方法包括：将试剂a中包括的全部物质均添加到其中的缓冲液中，混
76.试剂b中包括聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、缓冲液；
77.试剂b中，聚乙烯吡咯烷酮浓度为5g/l，氯化钠浓度为1g/l。
78.试剂b中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
79.试剂b的制备方法包括：将试剂b中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀。
80.试剂bⅱ81.试剂b中包括聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、缓冲液；
82.试剂b中，聚乙烯吡咯烷酮浓度为25g/l，氯化钠浓度为3g/l。
83.试剂b中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
84.试剂b的制备方法包括：将试剂b中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀。
85.试剂bⅲ86.试剂b中包括聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、缓冲液；
87.试剂b中，聚乙烯吡咯烷酮浓度为15g/l，氯化钠浓度为2g/l。
88.试剂b中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
89.试剂b的制备方法包括：将试剂b中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀。
90.试剂bⅳ91.试剂b中包括聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、缓冲液；
92.试剂b中，聚乙烯吡咯烷酮浓度为15g/l，氯化钠浓度为2g/l。
93.试剂b中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
94.试剂b中还包括浓度为0.1wt％的聚乙二醇和浓度为0.7wt％的海藻糖。
95.试剂b的制备方法包括：将试剂b中包括的除海藻糖外的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀，在最后加入海藻糖，再次混合均匀。
96.试剂b
ⅴ
97.试剂b中包括聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、缓冲液；
98.试剂b中，聚乙烯吡咯烷酮浓度为15g/l，氯化钠浓度为2g/l。
99.试剂b中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
100.试剂b中还包括浓度为0.15wt％的聚乙二醇和浓度为1.5wt％的海藻糖。
101.试剂b的制备方法包括：将试剂b中包括的除海藻糖外的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀，在最后加入海藻糖，再次混合均匀。
102.试剂b
ⅵ
103.试剂b中包括聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、缓冲液；
104.试剂b中，聚乙烯吡咯烷酮浓度为15g/l，氯化钠浓度为2g/l。
105.试剂b中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
106.试剂b中还包括浓度为0.12wt％的聚乙二醇和浓度为1.1wt％的海藻糖。
107.试剂b的制备方法包括：将试剂b中包括的除海藻糖外的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀，在最后加入海藻糖，再次混合均匀。
108.经验证，在试剂b中同时加入聚乙二醇和海藻糖后，检测方法的灵敏度得到了有效
提升。
109.对比例2试剂b制备
110.试剂b
ⅶ
111.试剂b中包括聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、缓冲液；
112.试剂b中，聚乙烯吡咯烷酮浓度为15g/l，氯化钠浓度为2g/l。
113.试剂b中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
114.试剂b中还包括浓度为0.12wt％的聚乙二醇。
115.试剂b的制备方法包括：将试剂b中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀。
116.经验证，在试剂b中不加入海藻糖时，检测方法的灵敏度较同时加入聚乙二醇和海藻糖有所下降。
117.试剂b
ⅷ
118.试剂b中包括聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、缓冲液；
119.试剂b中，聚乙烯吡咯烷酮浓度为15g/l，氯化钠浓度为2g/l。
120.试剂b中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
121.试剂b中还包括浓度为1.1wt％的海藻糖。
122.试剂b的制备方法包括：将试剂b中包括的除海藻糖外的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀，在最后加入海藻糖，再次混合均匀。
123.经验证，在试剂b中不加入聚乙二醇时，检测方法的灵敏度较同时加入聚乙二醇和海藻糖有所下降。
124.制备例3试剂c制备
125.试剂cⅰ126.试剂c中包括只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、缓冲液。
127.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径大于只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径。
128.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为350
‑
400nm，只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为150
‑
250nm。
129.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.05％(w/v)；只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.1％(w/v)。
130.试剂c中，标记的α1微球蛋白单克隆抗体的终浓度为0.010％(w/v)；标记的α1微球蛋白多克隆抗体的终浓度为0.02％(w/v)。
131.试剂c中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
132.试剂c的制备方法包括：将试剂c中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀。
133.试剂cⅱ134.试剂c中包括只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、只标记有α1
微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、缓冲液。
135.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径大于只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径。
136.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为350
‑
400nm，只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为150
‑
250nm。
137.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.1％(w/v)；只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.4％(w/v)。
138.试剂c中，标记的α1微球蛋白单克隆抗体的终浓度为0.015％(w/v)；标记的α1微球蛋白多克隆抗体的终浓度为0.08％(w/v)。
139.试剂c中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
140.试剂c的制备方法包括：将试剂c中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀。
141.试剂cⅲ142.试剂c中包括只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、缓冲液。
143.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径大于只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径。
144.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为350
‑
400nm，只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为150
‑
250nm。
145.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.08％(w/v)；只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.3％(w/v)。
146.试剂c中，标记的α1微球蛋白单克隆抗体的终浓度为0.013％(w/v)；标记的α1微球蛋白多克隆抗体的终浓度为0.05(w/v)。
147.试剂c中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
148.试剂c的制备方法包括：将试剂c中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀。
149.试剂cⅳ150.试剂c中包括只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、缓冲液。
151.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径大于只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径。
152.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为350
‑
400nm，只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为150
‑
250nm。
153.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米
颗粒质量计，其浓度为0.08％(w/v)；只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.3％(w/v)。
154.试剂c中，标记的α1微球蛋白单克隆抗体的终浓度为0.013％(w/v)；标记的α1微球蛋白多克隆抗体的终浓度为0.05(w/v)。
155.试剂c中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
156.试剂c中还包括0.06wt％的氯化钾。
157.试剂c的制备方法包括：将试剂c中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀。
158.试剂c
ⅴ
159.试剂c中包括只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、缓冲液。
160.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径大于只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径。
161.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为350
‑
400nm，只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为150
‑
250nm。
162.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.08％(w/v)；只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.3％(w/v)。
163.试剂c中，标记的α1微球蛋白单克隆抗体的终浓度为0.013％(w/v)；标记的α1微球蛋白多克隆抗体的终浓度为0.05(w/v)。
164.试剂c中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
165.试剂c中还包括0.09wt％的氯化钾。
166.试剂c的制备方法包括：将试剂c中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀。
167.试剂c
ⅵ
168.试剂c中包括只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、缓冲液。
169.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径大于只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径。
170.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为350
‑
400nm，只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为150
‑
250nm。
171.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.08％(w/v)；只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.3％(w/v)。
172.试剂c中，标记的α1微球蛋白单克隆抗体的终浓度为0.013％(w/v)；标记的α1微球蛋白多克隆抗体的终浓度为0.05(w/v)。
173.试剂c中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
174.试剂c中还包括0.1wt％的透明质酸钠。
175.试剂c的制备方法包括：将试剂c中包括的除透明质酸钠外的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀，在最后加入透明质酸钠，再次混合均匀。
176.试剂c
ⅶ
177.试剂c中包括只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、缓冲液。
178.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径大于只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径。
179.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为350
‑
400nm，只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为150
‑
250nm。
180.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.08％(w/v)；只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.3％(w/v)。
181.试剂c中，标记的α1微球蛋白单克隆抗体的终浓度为0.013％(w/v)；标记的α1微球蛋白多克隆抗体的终浓度为0.05(w/v)。
182.试剂c中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
183.试剂c中还包括0.2wt％的透明质酸钠。
184.试剂c的制备方法包括：将试剂c中包括的除透明质酸钠外的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀，在最后加入透明质酸钠，再次混合均匀。
185.试剂c
ⅷ
186.试剂c中包括只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、缓冲液。
187.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径大于只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径。
188.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为350
‑
400nm，只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为150
‑
250nm。
189.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.08％(w/v)；只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.3％(w/v)。
190.试剂c中，标记的α1微球蛋白单克隆抗体的终浓度为0.013％(w/v)；标记的α1微球蛋白多克隆抗体的终浓度为0.05(w/v)。
191.试剂c中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
192.试剂c中还包括0.09wt％的氯化钾。
193.试剂c中还包括0.2wt％的透明质酸钠。
194.试剂c的制备方法包括：将试剂c中包括的除透明质酸钠外的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀，在最后加入透明质酸钠，再次混合均匀。
195.另外制备α1微球蛋白标准品梯度浓度溶液：包括浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、
0.40、1.00、2.00、4.00、6.00、10.00(mg/l)的α1微球蛋白标准品溶液。
196.实施例α1微球蛋白微量检测方法，包括以下步骤：
197.s1、将试剂a与样本混合，加入试剂b，混合，孵育；
198.s2、加入试剂c混合，读取吸光度值，记为吸光度值ⅰ；
199.s3、计时反应后，再次读取吸光度值，记为吸光度值ⅱ；
200.s4、计算吸光度值ⅱ与吸光度值ⅰ的差值，制作所得差值对样本中α1微球蛋白浓度的回归方程logit
‑
log(4p)函数曲线，根据待测样本所得差值，代入函数曲线计算待测样本中α1微球蛋白的浓度。
201.s1所述样本包括α1微球蛋白标准品梯度浓度溶液或α1微球蛋白待测样本。
202.所述方法采用全自动生化分析仪进行，进行α1微球蛋白待测样本检测时采用的全自动生化分析仪进行与计算其浓度所使用的函数曲线检测时采用的全自动生化分析仪型号相同、检测过程中参数相同。
203.s1所述试剂a用量为0.5μl，样本加入量为2.3μl，试剂b用量为200μl。
204.s1所述孵育，包括在37℃条件下孵育5min。
205.s2所述试剂c用量为50μl。
206.s3所述计时反应，反应温度37℃，反应时间5min。
207.s2、s3所述读取吸光度值，包括体系在波长546nm的吸光度值。
208.α1微球蛋白待测样本采用配制的不同浓度的α1微球蛋白标准品溶液，以便验证方法的可行性、检测限及准确度，待测样本α1微球蛋白标准品浓度。
α
1微球蛋白微量检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物学检测方法技术领域，具体涉及一种α1微球蛋白微量检测方法。
背景技术：
2.α1微球蛋白是由人体的肝脏和淋巴细胞合成，分子量约为33000道尔顿的糖蛋白。它由167个氨基酸组成.与人类白细胞抗原hla
‑
a11，hla
‑
b20和hla
‑
51等抗原决定簇有交叉反应。自从1975年ekstron等从慢性镉中毒病人尿液中分离出α1微球蛋白(α
‑
microglobulin，简称α
‑
mg〕以来，国外学者对α1
‑
mg的来源，生化特性以及临床应用价值等进行了大量研究。α1
‑
mg广泛存在于人体各种体液及淋巴细胞膜表面，血液中的α1
‑
mg以两种形式存在，即游离的α1
‑
mg和与iga结合的α1
‑
mg(α1mg
‑
1ga)。正常情况下，α1mg
‑
1ga约占血液中总α1
‑
mg的40
‑
70％，血液中免疫球蛋白水平对α1
‑
mg及α1mg
‑
1ga之间的比例有影响。血液中游离的α1
‑
mg可自由通过肾小球滤过膜，95％
‑
99％在肾近曲小管重吸收和代谢，只有微量从终尿排出；而结合型的α1
‑
mg则不能通过肾小球，其在尿液中的浓度为零。一般认为α1
‑
mg在血清及尿液中增高的原因有：
①
肾小管重吸收和代谢α1
‑
mg的能力降低；
②
肾小球滤过功能受损；
③
体内合成过多；
④
淋巴细胞破坏释放。基于上述
①
、
②
两点以及大量的临床实验研究证实，目前人们普遍认为血清及尿液中α1
‑
mg的测定可作为反应肾小管重吸收功能受损的一项灵敏指标，而且在某种程度上还优于β2
‑
微球蛋白。又鉴于尿液样品采集的方便性以及处理方法简单，因此，尿液中α1
‑
mg的测定方法更加广泛地被应用于肾病诊断中。不同的方法测定的α1
‑
mg值有所差别，而相同的方法在不同的实验室条件下所测定的结果则大同小异。α1
‑
mg尿液中正常含量为0.48
‑
4.24mg/l，这一指标升高，通常指示患者患有各种肾病导致的肾功能不全(如肾小球损伤早期、原发性肾小球肾炎、间质性肾炎、糖尿病肾病、狼疮肾、急慢性肾功能衰竭等)或iga型骨髓瘤、肝癌等。这一指标降低，则常见于重度肝功能损害的肝病患者。由于α1
‑
mg尿液中正常含量本身较低，加之判定这一指标降低的表现及其程度可用于疾病诊断，因此，准确定量尿液中微量α1
‑
mg的方法是比较实用的，尿液中α1
‑
mg含量检测方法的检测限(灵敏度)以及准确性就显得尤为重要，目前的检测方法中，检测限普遍在0.2
‑
0.5mg/l左右，对“尿液中微量α1
‑
mg准确定量检测”这一需求来说，仍然不够精细，另外，目前的检测方法，检测或样本保存过程中α1
‑
mg均存在不同程度的不稳定且不可控的变性或分解等，导致标准曲线现行不佳、检测结果不准确。
技术实现要素：
3.为解决上述现有方法灵敏度不高、样本不稳定等导致的检测方法不精细、不准确等问题，本发明提供一种新的α1微球蛋白微量检测方法，方案如下：
4.一种α1微球蛋白微量检测方法，包括以下步骤：
5.s1、将试剂a与样本混合，加入试剂b，混合，孵育；
6.s2、加入试剂c混合，读取吸光度值，记为吸光度值ⅰ；
7.s3、计时反应后，再次读取吸光度值，记为吸光度值ⅱ；
8.s4、计算吸光度值ⅱ与吸光度值ⅰ的差值，制作所得差值对样本中α1微球蛋白浓度的回归方程logit
‑
log(4p)函数曲线，根据待测样本所得差值，代入函数曲线计算待测样本中α1微球蛋白的浓度；
9.所述试剂a中包括聚乙二醇、乙二胺四乙酸锌钠、缓冲液；
10.所述试剂b中包括聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、缓冲液；
11.所示试剂c中包括只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、缓冲液。
12.优选地，所述试剂b中，聚乙烯吡咯烷酮浓度为5
‑
25g/l，氯化钠浓度为1
‑
3g/l。
13.优选地，所述试剂b中的缓冲液包括50
‑
100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
14.优选地，所述试剂a中聚乙二醇浓度为0.09
‑
0.12wt％，乙二胺四乙酸锌钠浓度为0.05
‑
0.1wt％。
15.优选地，所述试剂a中的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、mops缓冲液或taps缓冲液。
16.优选地，所述试剂b中还包括浓度为0.1
‑
0.15wt％的聚乙二醇和浓度为0.7
‑
1.5wt％的海藻糖。
17.优选地，所述试剂c中还包括0.03
‑
0.09wt％的氯化钾。
18.优选地，所述试剂c中还包括0.1
‑
0.2wt％的透明质酸钠。
19.优选地，所述试剂a的制备方法包括：将试剂a中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀；当所述试剂a中包括聚乙二醇时，将试剂a中包括的全部物质除聚乙二醇外均添加到其中的缓冲液中，混合均匀，然后再添加聚乙二醇，混合均匀。
20.优选地，所述试剂b的制备方法包括：将试剂b中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀，当试剂b中包括海藻糖时，在最后加入海藻糖，混合均匀。
21.优选地，所述试剂c的制备方法包括：将试剂c中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀，当试剂c中包括透明质酸钠时，在最后加入透明质酸钠，混合均匀。
22.优选地，s1所述样本包括α1微球蛋白标准品梯度浓度溶液或α1微球蛋白待测样本。
23.优选地，s1所述α1微球蛋白标准品梯度浓度溶液包括浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.40、1.00、2.00、4.00、6.00、10.00(mg/l)的α1微球蛋白标准品溶液。
24.优选地，所述方法采用全自动生化分析仪进行，进行α1微球蛋白待测样本检测时采用的全自动生化分析仪进行与计算其浓度所使用的函数曲线检测时采用的全自动生化分析仪型号相同、检测过程中参数相同。
25.优选地，s1所述试剂a用量为0.5μl，样本加入量为2.3μl，试剂b用量为200μl。
26.优选地，s1所述孵育，包括在37℃条件下孵育5min。
27.优选地，s2所述试剂c用量为50μl。
28.优选地，s3所述计时反应，反应温度37℃，反应时间5min。
29.优选地，s2、s3所述读取吸光度值，包括体系在波长546nm的吸光度值。
30.优选地，所述试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径大于只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径。
31.优选地，所述试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为350
‑
400nm，只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为
150
‑
250nm。
32.优选地，所述试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.05％
‑
0.1％(w/v)；只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.1％
‑
0.4％(w/v)。
33.优选地，所述试剂c中，标记的α1微球蛋白单克隆抗体的终浓度为0.010％
‑
0.015％(w/v)；标记的α1微球蛋白多克隆抗体的终浓度为0.02％
‑
0.08％(w/v)。
34.优选地，所述试剂c中的缓冲液包括50
‑
100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
35.有益效果
36.本发明的有益效果在于：
37.本发明采用非常简单的试剂组合物、非常短的时间(样本与试剂a混合)，即可实现对含α1微球蛋白的样本中α1微球蛋白的稳定，通过实施例及对比例验证，采用上述手段能够有效减少后续检测过程中样本中α1微球蛋白的变性或降解等过程，提高检测方法的灵敏度和准确性，但该手段仅在短时间内有效，在样本混合试剂a后放置10min以上不进行后续步骤即失去效果，且在试剂a中的两种有效组分中，乙二胺四乙酸锌钠起到至关重要的作用。
38.试剂b中同时加入聚乙二醇和海藻糖后，检测方法的灵敏度得到有效提升，单纯加入二者其一时并不能达到如此显著的效果。
39.试剂c中加入氯化钾后，有效提高回归函数曲线及整体检测方法的准确度，大大降低了检测误差。
40.试剂c中加入透明质酸钠后，进一步有效提高回归函数曲线及整体检测方法的准确度，大大降低了检测误差。
41.本发明提供的上述方法，所得回归函数曲线在0.10
‑
10.00mg/l范围内均具备良好的相关系型，检测限为0.10mg/l。
具体实施方式
42.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
43.除非特别指出，以下实施例和对比例为平行试验，采用同样的处理步骤和参数。以下实施例采用的全自动生化分析仪为日立7060全自动生化分析仪，采用的分析方法为两点终点法，但本发明提供的方法适用于市面上绝大多数全自动生化分析仪，分析方法、参数等也可在试剂使用原理范围内进行适当调整。
44.制备例1试剂a制备
45.试剂aⅰ46.试剂a中包括聚乙二醇、乙二胺四乙酸锌钠、缓冲液；
47.试剂a中的缓冲液包括磷酸盐缓冲液。
48.试剂a中聚乙二醇浓度为0.09wt％，乙二胺四乙酸锌钠浓度为0.05wt％。
49.试剂a的制备方法包括：将试剂a中包括的全部物质均添加到其中的缓冲液中，混
76.试剂b中包括聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、缓冲液；
77.试剂b中，聚乙烯吡咯烷酮浓度为5g/l，氯化钠浓度为1g/l。
78.试剂b中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
79.试剂b的制备方法包括：将试剂b中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀。
80.试剂bⅱ81.试剂b中包括聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、缓冲液；
82.试剂b中，聚乙烯吡咯烷酮浓度为25g/l，氯化钠浓度为3g/l。
83.试剂b中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
84.试剂b的制备方法包括：将试剂b中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀。
85.试剂bⅲ86.试剂b中包括聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、缓冲液；
87.试剂b中，聚乙烯吡咯烷酮浓度为15g/l，氯化钠浓度为2g/l。
88.试剂b中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
89.试剂b的制备方法包括：将试剂b中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀。
90.试剂bⅳ91.试剂b中包括聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、缓冲液；
92.试剂b中，聚乙烯吡咯烷酮浓度为15g/l，氯化钠浓度为2g/l。
93.试剂b中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
94.试剂b中还包括浓度为0.1wt％的聚乙二醇和浓度为0.7wt％的海藻糖。
95.试剂b的制备方法包括：将试剂b中包括的除海藻糖外的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀，在最后加入海藻糖，再次混合均匀。
96.试剂b
ⅴ
97.试剂b中包括聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、缓冲液；
98.试剂b中，聚乙烯吡咯烷酮浓度为15g/l，氯化钠浓度为2g/l。
99.试剂b中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
100.试剂b中还包括浓度为0.15wt％的聚乙二醇和浓度为1.5wt％的海藻糖。
101.试剂b的制备方法包括：将试剂b中包括的除海藻糖外的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀，在最后加入海藻糖，再次混合均匀。
102.试剂b
ⅵ
103.试剂b中包括聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、缓冲液；
104.试剂b中，聚乙烯吡咯烷酮浓度为15g/l，氯化钠浓度为2g/l。
105.试剂b中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
106.试剂b中还包括浓度为0.12wt％的聚乙二醇和浓度为1.1wt％的海藻糖。
107.试剂b的制备方法包括：将试剂b中包括的除海藻糖外的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀，在最后加入海藻糖，再次混合均匀。
108.经验证，在试剂b中同时加入聚乙二醇和海藻糖后，检测方法的灵敏度得到了有效
提升。
109.对比例2试剂b制备
110.试剂b
ⅶ
111.试剂b中包括聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、缓冲液；
112.试剂b中，聚乙烯吡咯烷酮浓度为15g/l，氯化钠浓度为2g/l。
113.试剂b中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
114.试剂b中还包括浓度为0.12wt％的聚乙二醇。
115.试剂b的制备方法包括：将试剂b中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀。
116.经验证，在试剂b中不加入海藻糖时，检测方法的灵敏度较同时加入聚乙二醇和海藻糖有所下降。
117.试剂b
ⅷ
118.试剂b中包括聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、缓冲液；
119.试剂b中，聚乙烯吡咯烷酮浓度为15g/l，氯化钠浓度为2g/l。
120.试剂b中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
121.试剂b中还包括浓度为1.1wt％的海藻糖。
122.试剂b的制备方法包括：将试剂b中包括的除海藻糖外的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀，在最后加入海藻糖，再次混合均匀。
123.经验证，在试剂b中不加入聚乙二醇时，检测方法的灵敏度较同时加入聚乙二醇和海藻糖有所下降。
124.制备例3试剂c制备
125.试剂cⅰ126.试剂c中包括只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、缓冲液。
127.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径大于只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径。
128.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为350
‑
400nm，只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为150
‑
250nm。
129.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.05％(w/v)；只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.1％(w/v)。
130.试剂c中，标记的α1微球蛋白单克隆抗体的终浓度为0.010％(w/v)；标记的α1微球蛋白多克隆抗体的终浓度为0.02％(w/v)。
131.试剂c中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
132.试剂c的制备方法包括：将试剂c中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀。
133.试剂cⅱ134.试剂c中包括只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、只标记有α1
微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、缓冲液。
135.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径大于只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径。
136.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为350
‑
400nm，只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为150
‑
250nm。
137.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.1％(w/v)；只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.4％(w/v)。
138.试剂c中，标记的α1微球蛋白单克隆抗体的终浓度为0.015％(w/v)；标记的α1微球蛋白多克隆抗体的终浓度为0.08％(w/v)。
139.试剂c中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
140.试剂c的制备方法包括：将试剂c中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀。
141.试剂cⅲ142.试剂c中包括只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、缓冲液。
143.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径大于只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径。
144.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为350
‑
400nm，只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为150
‑
250nm。
145.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.08％(w/v)；只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.3％(w/v)。
146.试剂c中，标记的α1微球蛋白单克隆抗体的终浓度为0.013％(w/v)；标记的α1微球蛋白多克隆抗体的终浓度为0.05(w/v)。
147.试剂c中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
148.试剂c的制备方法包括：将试剂c中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀。
149.试剂cⅳ150.试剂c中包括只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、缓冲液。
151.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径大于只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径。
152.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为350
‑
400nm，只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为150
‑
250nm。
153.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米
颗粒质量计，其浓度为0.08％(w/v)；只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.3％(w/v)。
154.试剂c中，标记的α1微球蛋白单克隆抗体的终浓度为0.013％(w/v)；标记的α1微球蛋白多克隆抗体的终浓度为0.05(w/v)。
155.试剂c中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
156.试剂c中还包括0.06wt％的氯化钾。
157.试剂c的制备方法包括：将试剂c中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀。
158.试剂c
ⅴ
159.试剂c中包括只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、缓冲液。
160.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径大于只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径。
161.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为350
‑
400nm，只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为150
‑
250nm。
162.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.08％(w/v)；只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.3％(w/v)。
163.试剂c中，标记的α1微球蛋白单克隆抗体的终浓度为0.013％(w/v)；标记的α1微球蛋白多克隆抗体的终浓度为0.05(w/v)。
164.试剂c中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
165.试剂c中还包括0.09wt％的氯化钾。
166.试剂c的制备方法包括：将试剂c中包括的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀。
167.试剂c
ⅵ
168.试剂c中包括只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、缓冲液。
169.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径大于只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径。
170.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为350
‑
400nm，只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为150
‑
250nm。
171.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.08％(w/v)；只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.3％(w/v)。
172.试剂c中，标记的α1微球蛋白单克隆抗体的终浓度为0.013％(w/v)；标记的α1微球蛋白多克隆抗体的终浓度为0.05(w/v)。
173.试剂c中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
174.试剂c中还包括0.1wt％的透明质酸钠。
175.试剂c的制备方法包括：将试剂c中包括的除透明质酸钠外的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀，在最后加入透明质酸钠，再次混合均匀。
176.试剂c
ⅶ
177.试剂c中包括只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、缓冲液。
178.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径大于只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径。
179.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为350
‑
400nm，只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为150
‑
250nm。
180.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.08％(w/v)；只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.3％(w/v)。
181.试剂c中，标记的α1微球蛋白单克隆抗体的终浓度为0.013％(w/v)；标记的α1微球蛋白多克隆抗体的终浓度为0.05(w/v)。
182.试剂c中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
183.试剂c中还包括0.2wt％的透明质酸钠。
184.试剂c的制备方法包括：将试剂c中包括的除透明质酸钠外的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀，在最后加入透明质酸钠，再次混合均匀。
185.试剂c
ⅷ
186.试剂c中包括只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒、缓冲液。
187.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径大于只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径。
188.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为350
‑
400nm，只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒的平均粒径为150
‑
250nm。
189.试剂c中，只标记有α1微球蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.08％(w/v)；只标记有α1微球蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯纳米颗粒，按聚苯乙烯纳米颗粒质量计，其浓度为0.3％(w/v)。
190.试剂c中，标记的α1微球蛋白单克隆抗体的终浓度为0.013％(w/v)；标记的α1微球蛋白多克隆抗体的终浓度为0.05(w/v)。
191.试剂c中的缓冲液包括100mmol/ltris
‑
hcl缓冲液。
192.试剂c中还包括0.09wt％的氯化钾。
193.试剂c中还包括0.2wt％的透明质酸钠。
194.试剂c的制备方法包括：将试剂c中包括的除透明质酸钠外的全部物质添加到其中的缓冲液中，混合均匀，在最后加入透明质酸钠，再次混合均匀。
195.另外制备α1微球蛋白标准品梯度浓度溶液：包括浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、
0.40、1.00、2.00、4.00、6.00、10.00(mg/l)的α1微球蛋白标准品溶液。
196.实施例α1微球蛋白微量检测方法，包括以下步骤：
197.s1、将试剂a与样本混合，加入试剂b，混合，孵育；
198.s2、加入试剂c混合，读取吸光度值，记为吸光度值ⅰ；
199.s3、计时反应后，再次读取吸光度值，记为吸光度值ⅱ；
200.s4、计算吸光度值ⅱ与吸光度值ⅰ的差值，制作所得差值对样本中α1微球蛋白浓度的回归方程logit
‑
log(4p)函数曲线，根据待测样本所得差值，代入函数曲线计算待测样本中α1微球蛋白的浓度。
201.s1所述样本包括α1微球蛋白标准品梯度浓度溶液或α1微球蛋白待测样本。
202.所述方法采用全自动生化分析仪进行，进行α1微球蛋白待测样本检测时采用的全自动生化分析仪进行与计算其浓度所使用的函数曲线检测时采用的全自动生化分析仪型号相同、检测过程中参数相同。
203.s1所述试剂a用量为0.5μl，样本加入量为2.3μl，试剂b用量为200μl。
204.s1所述孵育，包括在37℃条件下孵育5min。
205.s2所述试剂c用量为50μl。
206.s3所述计时反应，反应温度37℃，反应时间5min。
207.s2、s3所述读取吸光度值，包括体系在波长546nm的吸光度值。
208.α1微球蛋白待测样本采用配制的不同浓度的α1微球蛋白标准品溶液，以便验证方法的可行性、检测限及准确度，待测样本α1微球蛋白标准品浓度。
再多了解一些
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