表没食子儿茶素没食子酸酯的应用及手洗消毒剂的制作方法

1.本技术涉及抗病毒应用技术领域，尤其涉及表没食子儿茶素没食子酸酯的应用及手洗消毒剂。


背景技术：

2.腺病毒是急性呼吸系统感染的主要病原体，在全世界范围广泛流行，并呈现季节波动性小、地方散发为主的流行病学特征。免疫功能低下或缺陷人群最易被hadv感染，可能来自外源新发感染，也可能源于潜伏感染病毒的激活。全球范围内人群感染腺病毒类型主要为b种(hadv3、hadv7、hadv11、hadv14、hadv55)和c种(hadv1、hadv2、hadv5)，中国境内呼吸道感染腺病毒的主要类型为b3基因型(即hadv3型)和b7基因型，各基因型病毒的不同流行株具有明显的地域限制性。
3.腺病毒感染诱发的疾病包括急性呼吸道疾病和急性支气管炎、流行性结膜炎、肠胃炎、角膜结膜炎、脑膜脑炎、膀胱炎、心肌炎甚至重症肺炎，并可能导致肥胖等非炎症症状。腺病毒传播的方式主要为空气飞沫、直接接触污染物或是受感染的组织、饮用感染的水源，并可通过粪
‑
口途径传播。然而，目前没有有效地针对该病毒的预防或治疗制剂，比如有效的手部消毒剂使用，能够辅助疫苗进行预防，从而加强卫生管理和药物治疗。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本技术的目的在于提供表没食子儿茶素没食子酸酯在制备预防和/或治疗腺病毒引起疾病制剂中的应用及手洗消毒剂。本技术提供的表没食子儿茶素没食子酸酯能够有效的抑制腺病毒的吸附、复制和组装，从而起到抑制腺病毒的感染，且其还能够直接对腺病毒进行灭活，具有用作制备预防和或治疗腺病毒引起疾病制剂的应用前景。
5.为实现上述申请的目的，本技术提供以下技术方案：
6.本技术公开了了表没食子儿茶素没食子酸酯在制备预防和/或治疗腺病毒引起疾病制剂中的应用。
7.上述技术方案中，所述腺病毒的基因型包括人3型腺病毒和人腺病毒3型绿色荧光病毒。
8.上述技术方案中，所述腺病毒引起疾病包括急性呼吸道疾病、急性支气管炎、流行性结膜炎、肠胃炎、角膜结膜炎、脑膜脑炎、膀胱炎、心肌炎甚至重症肺炎和病理性肥胖。
9.上述技术方案中，所述制剂包括消毒剂、药物和以表没食子儿茶素没食子酸酯为基础制备的衍生物。
10.本技术还提供了一种针对腺病毒的手洗消毒剂，包含表没食子儿茶素没食子酸酯。
11.与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果：
12.本技术提供的表没食子儿茶素没食子酸酯能够有效的抑制腺病毒的吸附、复制和组装，从而起到抑制腺病毒的感染，且其还能够直接对腺病毒进行灭活，具有用作制备预防
和或治疗腺病毒引起疾病制剂的应用前景。
附图说明
13.图1为本技术实施例提供消毒剂对hadv
‑
b3
‑
gfp病毒的杀灭荧光变化图，处理时间为60s；组图上方为初始滴度为6.5
×
106ffu/ml的试验病毒悬液，经过10倍稀释后的五个滴度；左方“1～3”分别表示采用a型、b型和c型消毒剂进行处理的试验组，“4”表示未经消毒剂处理的阳性对照组，其病毒滴度与试验组对应。
具体实施方式
14.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
15.在本技术中，所述表没食子儿茶素没食子酸醋也称为表没食子儿茶素
‑3‑
没食子酸a或表没食子儿茶酚没食子酸酷。本技术对所述表没食子儿茶素
‑3‑
没食子酸酷的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可，优选购置于selleck。
16.本技术实施例提供了表没食子儿茶素没食子酸酯在制备预防和/或治疗腺病毒引起疾病制剂中的应用。
17.上述实施方式中，所述腺病毒的基因型包括人3型腺病毒和人3型绿色荧光腺病毒。
18.上述实施方式中，所述腺病毒引起疾病包括急性呼吸道疾病、急性支气管炎、流行性结膜炎、肠胃炎、角膜结膜炎、脑膜脑炎、膀胱炎、心肌炎甚至重症肺炎和病理性肥胖。
19.上述实施方式中，所述制剂包括消毒剂、药物和以表没食子儿茶素没食子酸酯为基础制备的衍生物。
20.本技术实施例还提供了一种针对腺病毒的手洗消毒剂，包含表没食子儿茶素没食子酸酯。
21.在本技术中，当所述制剂优选为药物时，所述表没食子儿茶素没食子酸醋优选占药物总质量的l％～99％。本技术对所述药物的辅料没有特殊限定，优选通过药物剂型选择相对应的辅料。
22.在本技术中，当所述制剂优选为消毒剂时，所述表没食子儿茶素没食子酸酷优选占消毒剂总质量的l％～99％。本技术对所述消毒剂的辅料没有特殊限定，优选采用常规制备消毒剂的辅料即可，如棕榈酸酯、乙醇等。
23.下面将结合本技术中的实施例，对本技术中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
24.下述实施例主要通过实验验证含有egcg的酒精消毒剂对无包膜的常见的引起儿童呼吸道感染的人3型腺病毒的杀灭效果。
25.一、材料与方法
26.一)材料
27.表没食子儿茶素没食子酸棕榈酸酯(egcg)、egcg
‑
棕榈酸酯(表没食子儿茶素没食子酸棕榈酸酯(egcg)是通过表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)与棕榈酰氯的酯化制备的。既增强了egcg的亲脂性，又保持了egcg的生物活性)，均由sigma公司提供，其母液位20mg/ml，除菌过滤分装。
28.胎牛血清、dmem细胞培养基和胰蛋白酶均为国外进口产品。分析纯级无水乙醇为国内市售产品。
29.模型细胞：人肺非小细胞肺癌细胞(a549)，由广东省病毒学重点实验室提供。
30.毒株：人3型绿色荧光腺病毒(hadv
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b3
‑
gfp)，由广东省病毒学重点实验室提供。
31.细胞培养基：使用高糖培养基dmem内加入10％(v/v)胎牛血清fbs，1％(v/v)青
‑
链霉素抗生素(100u/ml)；使用高糖培养基dmem内加入2％(v/v)胎牛血清fbs，1％(v/v)青
‑
链霉素抗生素(100u/ml)制备细胞维持培养基。
32.细胞培养：先用2％细胞维持培养基将a549细胞培养成单层，然后种入hadv
‑
b3
‑
gfp病毒，获得滴度为1.3
×
107ffu/ml的试验病毒悬液。将试验病毒悬液与3％牛血清白蛋白进行对倍稀释后成6.5
×
106ffu/ml，备用。
33.待试品：
34.a型消毒剂，含2
‰
(v/v)egcg
‑
棕榈酸酯的乙醇溶液；
35.b型消毒剂，75％乙醇；
36.c型消毒剂，碘酒和聚乙烯吡咯烷酮的混合物。
37.二)方法
38.1、病毒量检测
39.将hadv
‑
b3
‑
gfp病毒连续稀释5个梯度，分别稀释成6.5
×
105ffu/ml、6.5
×
104ffu/ml、6.5
×
103ffu/ml、6.5
×
102ffu/ml和65ffu/ml的浓度备用。
40.将a549细胞以1
×
104/孔的密度接种入96孔板并培养至细胞长满后，弃去培养基上清，加入上述各个稀释度病毒液(100ul/孔)，每个稀释度重复4孔，置于5％co2培养箱中37℃孵育2h进行病毒感染后，弃去未吸附和感染的病毒液，并在96孔板中加入新鲜的细胞维持培养基，继续置于co2培养箱中继续培养40h后，统计每孔的绿色荧光数量，荧光数量即对应于病毒量，计算灭活对数值。
41.2、egcg抗病毒生物合成作用
42.6.5
×
106ffu/ml的病毒20μl/孔感染己长满80％单层a549细胞，37℃吸附1h后，弃病毒液，于培养孔中加入含不同浓度egcg(0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/mll、5μg/ml、10μg/ml)100μl/孔，37℃培养，观察cpe现象，待到病毒对照组50％以上细胞呈cpe现象时(对照组分为正常细胞对照组，种毒了的病毒对照组，且均未添加egcg)，按照上述方法检测病毒抑制率。病毒抑制率＝(实验组荧光数量
‑
对照组荧光数量)/(细胞对照组荧光数量
‑
病毒对照组荧光数量)
×
100％
43.3、egcg对病毒的直接杀灭作用
44.试验组：混合液包含50μl的hadv
‑
b3
‑
gfp病毒悬液6.5
×
106ffu/ml和450μl待试品(待试品为上述的a型消毒剂、b型消毒剂和c型消毒剂)。混合液在(20
±
1)℃分别孵育90s后进行病毒滴定。其中，病毒悬液的浓度经过了10倍的梯度稀释，如图1所示。
45.三个实验组出来统计荧光个数，消毒剂对病毒的杀灭对数值，试验独立重复3次。
46.三)结果
47.1、egcg抗病毒生物合成作用
48.egcg在0.5～10μg/ml范围内，对hadv
‑
b3
‑
gfp病毒有明显抑制作用，且在该范围内，病毒抑制率与egcg浓度呈对数直线关系((r2＝0.927，p<0.05)，eucu的抗病毒生物合成的半数有效浓度ic
50
为1.12μg/ml，治疗指数(ti)为9.23，表明eucu对hadv
‑
b3
‑
gfp病毒有抗细胞内生物合成作用。
49.表1.egcg对病毒的抑制率
[0050][0051]
表1中，“ ”表示50％～75％出现cpe，“ ”表示25％～50％出现cpe，“ ”表示≦25％出现cpe，“－”表示无cpe出现。
[0052]
2、egcg对病毒的直接杀灭作用
[0053]
含egcg
‑
棕榈酸酯消毒剂病毒灭活试验结果表明，如图1所示，本技术提供的a型消毒剂作用1min对hadv
‑
b3
‑
gfp灭活对数值＞4.00，达到消毒合格要求。
[0054]
hadv
‑
b3
‑
gfp病毒与a型消毒剂孵育60s后，病毒滴度降0；而b型消毒剂处理60s后，病毒滴度为1.2
×
103ffu/ml，c型则为3.2
×
103ffu/ml；二者对病毒的灭活作用有限，且均未达到《消毒技术规范》要求。
[0055]
此外，对于a型消毒剂，当孵育时间>30s，a品牌消毒剂杀灭病毒平均效果均达到《消毒技术规范》要求，当孵育时间>60s各消毒剂杀灭病毒效果差异无统计学意义，即孵育时间>60s时，孵育时间对病毒滴度的降低无明显影响。
[0056]
表2三种消毒剂孵育病毒60s时的病毒滴度
[0057][0058]“－”表示为不添加消毒剂，对应于图1中的第四行
[0059]
目前仍然需要证明对广泛的无包膜病毒有活性的基于酒精成分洗手液。本技术提供的消毒剂，保护egcg，其对hadv
‑3‑
gf具有杀灭效果。通过上述egcg抗病毒生物合成作用的试验结果推测，egcg可能与细胞的病毒受体竞争性结合，阻断了病毒的吸附，达到了预防作用，其对于病毒的直接灭活作用，可能源于其阻断了病毒的吸附或者复制。
[0060]
以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。