一种心脏瓣膜小叶及其制备方法与流程

1.本发明涉及心脏瓣膜技术领域，具体涉及一种心脏瓣膜小叶及其制备方法。


背景技术：

2.据世界卫生组织公布的《2021年世界卫生统计》，在所有致人类死亡的原因中，心血管疾病(cvd)的发病率和致死率都占各类疾病之首。目前瓣膜置换术中用到的人工瓣膜主要有机械瓣膜和生物瓣膜两种，均存在一些问题：机械瓣膜由于非生理血流动力学使患者需要终生抗凝治疗，增加了患者发生大出血和血栓栓塞的风险，目前已经逐渐退出市场。
3.目前临床上的主流手术瓣产品是生物瓣膜，经导管心脏瓣膜植入术(tavr)中使用的也均为生物瓣膜；生物瓣膜主要由戊二醛(ga)交联的脱细胞牛心包或猪主动脉瓣制备而成，而戊二醛在近50年以来一直是应用最广泛的化学交联剂，然而经其处理后的人工生物瓣膜晚期钙化现象严重，大量组织基质丢失，生物力学性能下降，瓣叶衰败率高，其中低龄患者更为明显，严重影响患者寿命。此外，残余戊二醛产生的游离醛基具有细胞毒作用，易引发严重反应，直接影响了生物瓣的生物相容性。以上因素导致生物瓣膜的使用年限仅有10～15年，严重限制了其在先心病儿童及60岁以下中年群体中的应用。因此，设计制备新型瓣膜材料，以获得更加耐用、抗钙化性能优良、血液动力学良好且可组织再生的瓣膜至关重要。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种心脏瓣膜小叶及其制备方法，该心脏瓣膜材料具有耐久性更好、抗钙化性能优良、血液动力学良好、可组织再生等优异性能。
5.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
6.本发明第一方面提供一种心脏瓣膜小叶，所述心脏瓣膜小叶为三层结构，所述三层结构依次为纤维层、海绵层和心室层；
7.所述纤维层的制备原料包括聚合物以及明胶或胶原蛋白；
8.所述海绵层的制备原料包括聚合物和多糖类物质；
9.所述心室层的制备原料包括聚合物和丝素蛋白；
10.所述聚合物选自plcl、pla、plga、pcl和pu中的至少一种。
11.优选地，所述心脏瓣膜小叶厚度为300～500μm；
12.所述纤维层厚度为50～150μm；
13.所述海绵层厚度为200～400μm；
14.所述心室层厚度为50～150μm。
15.优选地，所述纤维层中聚合物与明胶或胶原蛋白的质量比值不小于1；
16.所述海绵层中聚合物与多糖类物质的质量比值不小于1；
17.所述心室层中聚合物与丝素蛋白的质量比值不小于1。
18.优选地，所述多糖类物质选自透明质酸、海藻酸、壳聚糖和纤维素中的至少一种；
19.所述透明质酸的分子量为(0.5～200)
×
104。
20.优选地，所述胶原蛋白选自牛胶原蛋白、猪胶原蛋白、海洋胶原蛋白和鱼胶原蛋白中的至少一种。
21.优选地，所述丝素蛋白来源于桑蚕丝或柞蚕丝。
22.本发明第二方面提供一种上述心脏瓣膜小叶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
23.(a)将纤维层、海绵层和心室层的制备原料分别溶于溶剂中，得到纤维层溶液、海绵层溶液和心室层溶液；
24.(b)将纤维层溶液、海绵层溶液和心室层溶液通过静电纺丝依次形成纤维层、海绵层和心室层，即得所述心脏瓣膜小叶。
25.优选地，所述溶剂选自氢氧化钠溶液、二甲基甲酰胺、甲酸和六氟异丙醇中的至少一种。
26.优选地，所述纤维层溶液、海绵层溶液和心室层溶液的浓度分别为10～400mg/ml。
27.优选地，所述静电纺丝的控制参数如下：
28.注射器的流量为2～20ml/h；针头和接收器之间的电压为5～20kv，距离为5～25cm；接收器的转速为100～1000rpm；
29.所述针头为20～25g钝头针头。
30.优选地，所述制备方法还包括对静电纺丝形成的纤维层、海绵层和心室层进行真空干燥处理。
31.心脏瓣膜小叶由三层结构组成，分别为纤维层、海绵层和心室层；天然心脏瓣膜的厚度为300～500μm左右，其中，纤维层主要由胶原纤维构成，纤维沿瓣叶周向排列，心脏舒张时发挥受力作用；海绵层主要由糖胺聚糖和蛋白聚糖构成，排列方向为随机向，起到缓冲作用；心室层由弹性纤维构成，纤维沿瓣叶径向排列，为心脏瓣膜提供弹性；本发明制备方法采用天然材料明胶/胶原蛋白、多糖类物质和丝素蛋白以及聚合物(比如聚l
‑
乳酸
‑
ε
‑
己内酯plcl)，利用静电纺丝技术制备仿生的三层心脏瓣膜小叶，其中，聚合物以及明胶(gel)/胶原蛋白用于模拟三层结构的纤维层，聚合物和多糖类物质用于模拟海绵层，而聚合物和丝素蛋白用于模拟心室层；其中，明胶作为胶原蛋白的水解产物，可用来模拟纤维层的胶原蛋白；透明质酸(ha)是一种大分子直链糖胺聚糖，可用来模拟海绵层的糖胺聚糖；丝素蛋白(sf)是一种坚韧而富有弹性的蛋白质，可提高聚合物的弹性模量，用于模拟天然心脏瓣膜三层结构中心室层的弹性蛋白；本发明制备得到的心脏瓣膜小叶在体内植入时，外层的纤维层和心室层用于维持结构和提供力学支撑，而中间层的海绵层可以可控地生物降解以支持细胞渗透到支架内部，增强细胞外基质的分泌。本发明制备得到的三层心脏瓣膜小叶一方面可以保证其生物相容性和力学性能，另一方面还可以通过控制材料混合比例来控制支架的纤维直径、孔隙率大小和降解速率，最重要的是，仿生三层瓣膜小叶可以很好地模拟天然心脏瓣膜的三层结构，为其体内长期植入提供了结构稳定性。
32.与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
33.本发明制备方法采用静电纺丝技术制备了仿生三层心脏瓣膜小叶，聚合物为仿生三层瓣膜小叶提供了足够的机械强度，而明胶/胶原蛋白、多糖类物质和丝素蛋白提高了生物相容性，包括促进细胞粘附、增殖、迁移等，有助于ecm的再生和生理功能的重建，在组成
上，本发明仿生三层心脏瓣膜小叶的每一层组分都与天然心脏瓣膜组分相似；结构上，本发明仿生三层心脏瓣膜小叶三层结构明显，与天然瓣膜小叶的三层结构类似；功能上，本发明仿生三层心脏瓣膜力学性能适宜，能够促进细胞增殖和粘附、维持细胞活力、可以下调钙化相关基因表达，皮下埋植后显示出更优异的抗钙化、细胞化和血管化能力，为组织再生提供更有利的微环境；此外，本发明仿生三层心脏瓣膜小叶可以促进胶原蛋白、糖胺聚糖和弹性蛋白等细胞外基质的分泌，血管化更完全，有利于组织重塑，更加接近于天然心脏瓣膜的功能。除此之外，静电纺丝制备过程比传统瓣膜成本低、更简单、高效、稳定性更好，有利于规模化生产。
附图说明
34.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
35.图1为本发明实验例2中tri
‑
layer、mono
‑
layer以及plcl材料的宏观拍照结果以及横截面的sem图；
36.图2为本发明实验例2中tri
‑
layer、mono
‑
layer以及plcl材料的力学性能检测结果；
37.图3为本发明实验例2中血小板粘附实验结果；
38.图4为本发明实验例2中钙化诱导培养基培养的vics在tri
‑
layer、mono
‑
layer以及plcl上7天和14天时的alp活性定性分析结果；
39.图5为本发明实验例2中聚合酶链反应实验检测细胞成骨分化过程及qpcr数据；
40.图6为本发明实验例2中电感耦合等离子体质谱法(icp
‑
ms)定量检测钙含量结果；
41.图7为本发明实验例2中4周和8周wistar幼鼠皮下埋植的h&e染色结果；
42.图8为本发明实验例2中4周和8周wistar幼鼠皮下埋植的cd31免疫荧光染色结果；
43.图9为本发明实验例2中4周和8周的微血管数量定量检测结果。
具体实施方式
44.下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
45.需要注意的是，除非另有说明，本技术使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
46.实施例1
47.本实施例为一种心脏瓣膜小叶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
48.(a)将plcl/gel、plcl/ha和plcl/sf分别溶于溶剂中并磁力搅拌过夜，得到终浓度为150mg/ml的plcl/gel溶液、plcl/ha溶液和plgl/sf溶液，其中，溶剂为二甲基甲酰胺；plcl/ha溶液中ha的分子量为200
×
104；plcl/gel中plcl与gel质量的比值为2；plcl/ha中plcl与ha质量的比值为2；plgl/sf中plcl与sf质量的比值为2；
49.(b)将plcl/gel溶液填充到配有23g钝头针头的注射器中，将注射器装入注射泵中
并设置恒定流量为6ml/h，然后，在收集芯棒上覆盖一层铝箔，将高压电源的一头与针头相连，另一头与接收器相连，控制针头和接收器之间的电压为12kv，距离为20cm；接收器的转速为100rpm；待形成plcl/gel纺丝层后，保持接收器不动，将注射器中的plcl/gel溶液更换为plcl/ha溶液，在plcl/gel纺丝层上形成plcl/ha纺丝层，按照上述操作，在成plcl/ha纺丝层上形成plgl/sf纺丝层，得到三层瓣膜小叶；
50.(c)将三层瓣膜小叶真空干燥36h，即得心脏瓣膜小叶。
51.实施例2
52.本实施例为一种心脏瓣膜小叶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
53.(a)将plcl/gel、plcl/ha和plcl/sf分别溶于溶剂中并磁力搅拌过夜，得到终浓度为100mg/ml的plcl/gel溶液、plcl/ha溶液和plgl/sf溶液，其中，溶剂为甲酸；plcl/ha溶液中ha的分子量为20
×
104；plcl/gel中plcl与gel质量的比值为1；plcl/ha中plcl与ha质量的比值为1；plgl/sf中plcl与sf质量的比值为1；
54.(b)将plcl/gel溶液填充到配有25g钝头针头的注射器中，将注射器装入注射泵中并设置恒定流量为15ml/h，然后，在收集芯棒上覆盖一层铝箔，将高压电源的一头与针头相连，另一头与接收器相连，控制针头和接收器之间的电压为10kv，距离为16cm；接收器的转速为500rpm；待形成plcl/gel纺丝层后，保持接收器不动，将注射器中的plcl/gel溶液更换为plcl/ha溶液，在plcl/gel纺丝层上形成plcl/ha纺丝层，按照上述操作，在成plcl/ha纺丝层上形成plgl/sf纺丝层，得到三层瓣膜小叶；
55.(c)将三层瓣膜小叶真空干燥30h，即得心脏瓣膜小叶。
56.实施例3
57.本实施例为一种心脏瓣膜小叶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
58.(a)将plcl/gel、plcl/ha和plcl/sf分别溶于溶剂中并磁力搅拌过夜，得到终浓度为60mg/ml的plcl/gel溶液、plcl/ha溶液和plgl/sf溶液，其中，溶剂为六氟异丙醇；plcl/ha溶液中ha的分子量为20
×
104；plcl/gel中plcl与gel质量的比值为2；plcl/ha中plcl与ha质量的比值为2；plgl/sf中plcl与sf质量的比值为2；
59.(b)将plcl/gel溶液填充到配有20g钝头针头的注射器中，将注射器装入注射泵中并设置恒定流量为8ml/h，然后，在收集芯棒上覆盖一层铝箔，将高压电源的一头与针头相连，另一头与接收器相连，控制针头和接收器之间的电压为17kv，距离为18cm；接收器的转速为800rpm；待形成plcl/gel纺丝层后，保持接收器不动，将注射器中的plcl/gel溶液更换为plcl/ha溶液，在plcl/gel纺丝层上形成plcl/ha纺丝层，按照上述操作，在成plcl/ha纺丝层上形成plgl/sf纺丝层，得到三层瓣膜小叶；
60.(c)将三层瓣膜小叶真空干燥24h，即得心脏瓣膜小叶。
61.实施例4
62.本实施例为一种心脏瓣膜小叶的制备方法，该制备方法与实施例3中的制备方法基本相同，区别仅在于将plcl替换为plga。
63.实施例5
64.本实施例为一种心脏瓣膜小叶的制备方法，该制备方法与实施例3中的制备方法基本相同，区别仅在于将plcl替换为pla。
65.实施例6
66.本实施例为一种心脏瓣膜小叶的制备方法，该制备方法与实施例3中的制备方法基本相同，区别仅在于将将明胶替换为牛胶原蛋白。
67.实施例7
68.本实施例为一种心脏瓣膜小叶的制备方法，该制备方法与实施例3中的制备方法基本相同，区别仅在于将透明质酸替换为壳聚糖。
69.实施例8
70.本实施例为一种心脏瓣膜小叶的制备方法，该制备方法与实施例3中的制备方法基本相同，区别仅在于将透明质酸替换为纤维素。
71.对比例1
72.本对比例为一种心脏瓣膜小叶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
73.(a)将plcl、gel、ha和sf共同溶于溶剂中并磁力搅拌过夜，得到终浓度为100mg/ml混合溶液，其中，溶剂为六氟异丙醇；混合溶液中，ha的分子量为20
×
104；plcl与gel质量的比值为2；plcl与ha质量的比值为2；plcl与sf质量的比值为2；
74.(b)将混合溶液填充到配有20g钝头针头的注射器中，将注射器装入注射泵中并设置恒定流量为8ml/h，然后，在收集芯棒上覆盖一层铝箔，将高压电源的一头与针头相连，另一头与接收器相连，控制针头和接收器之间的电压为17kv，距离为18cm；接收器的转速为800rpm；形成一层纺丝层，得到单层瓣膜小叶；
75.(c)将单层瓣膜小叶真空干燥24h，即得心脏瓣膜小叶。
76.对比例2
77.本对比例为一种心脏瓣膜小叶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
78.(a)将plcl溶于溶剂中并磁力搅拌过夜，得到混合溶液，其中，溶剂为六氟异丙醇；混合溶液中plcl的浓度为100mg/ml；
79.(b)将混合溶液填充到配有20g钝头针头的注射器中，将注射器装入注射泵中并设置恒定流量为8ml/h，然后，在收集芯棒上覆盖一层铝箔，将高压电源的一头与针头相连，另一头与接收器相连，控制针头和接收器之间的电压为17kv，距离为18cm；接收器的转速为800rpm；形成一层纺丝层，得到单层瓣膜小叶；
80.(c)将单层瓣膜小叶真空干燥24h，即得心脏瓣膜小叶。
81.实验例1
82.本实验例为plcl/ha中ha分子量以及含量对人脐静脉内皮细胞(huvec)增殖的作用的研究
83.选取ha的相对分子量为20
×
104，plcl/ha溶解甲酸(fa)溶剂中，溶液浓度180mg/ml，plcl/ha质量比为1：1。将配制好的plcl/ha溶液填充到一个10ml的注射器中，注射器配有23g钝头针头。将注射器装入注射泵中，设置恒定流量为6ml/h。将高压电源的一头与针头相连，另一头与接收器相连。针头和接收器之间的电压为12kv，距离为20cm，接收器的转速为100rpm，制备心脏瓣膜小叶；
84.按照上述方法分别制备ha相对分子量为0.5万、1万、10万、120万和200万，plcl/ha溶液中ha浓度为10、100、200、300和500μg/ml的心脏瓣膜小叶；
85.实验方法:(a)plcl/ha静电纺丝支架进行灭菌处理。(b)将材料剪成1
×
1cm，依据iso 10993
‑
12:2012将材料按照0.2g/ml的浓度置于培养基中，37℃、5％(v/v)co2培养箱中
浸提24小时，0.22μm无菌滤膜过滤后，得到plcl/ha静电纺丝支架浸提液。(c)收集huvec，以3000个/孔的细胞密度铺板在96孔板里，37℃、5％(v/v)co2培养箱中培养。(d)24小时后，吸弃培养基，每孔加100μl plcl/ha静电纺丝支架浸提液。(e)1、3、5天后，吸弃培养基，无菌pbs清洗3次。(f)在所有孔中加入10μl cck
‑
8的无血清培养基，37℃避光孵育2小时。用酶标仪在450nm处测定od值；
86.实验结果为：ha对huvec增殖的作用呈现分子量大小依赖性和浓度依赖性的特性。一方面，随着ha分子量的降低，其对huvec增殖的效果更加明显，即小分子量的ha更加能促进huvec的增殖。另一方面，随着ha浓度的升高，对huvec增殖的作用呈现先上升后下降的趋势，在10～100μg/ml的浓度范围内对huvec增殖的作用呈现上升趋势，在100～500μg/ml的范围内则呈现一个降低的趋势，当ha的浓度为100μg/ml时，促进增殖的作用最显著，继续增加浓度并不能继续增强其促进细胞增殖的效果。
87.实验例2
88.按照实施例3和对比例1～2的制备方法分别制备得到心脏瓣膜小叶，其中实施例3制备得到的心脏瓣膜小叶命名为tri
‑
layer，对比例1制备得到的心脏瓣膜小叶命名为mono
‑
layer；对比例2制备得到的心脏瓣膜小叶为纯plcl组；
89.1、对上述tri
‑
layer、mono
‑
layer以及纯plcl的横截面进行电子显微镜扫描和宏观拍照，扫描和拍照结果如图1所示，图中，a、b、c为对应的sem图，d、e、f为对应的宏观照片；
90.由图1可知，tri
‑
layer组的平均纤维直径在3.17到4.66μm之间变化；其中，plcl/sf层为3.43～4.28μm，plcl/gel层为3.17～4.66μm。
91.2、对上述tri
‑
layer、mono
‑
layer以及纯plcl的力学性能进行检测，将各试样切成3
×
1cm，用厚度仪测量plcl/gel静电纺丝支架的厚度，以10mm/min的速度进行拉伸，直至材料断裂，记录1kn载荷下的应力
‑
应变曲线。由应力
‑
应变曲线图计算试样的极限抗拉强度、断裂伸长率和弹性模量等参数。检测结果如图2所示，图中，a为弹性模量、b为极限抗拉强度和c为断裂伸长率。ns表示无显著性差异，*表示p<0.05，**表示p<0.01；
92.由图2可知，比于单纯的plcl，tri
‑
layer的弹性模量增强(32.18
±
4.19mpa)，最大应力变大(10.73
±
1.39mpa)，断裂伸长率降低(153.95
±
7.82％)，即在plcl中加了sf、ha和gel后，力学性能明显提高，且tri
‑
layer组的力学性能优于mono
‑
layer组。
93.3、对上述tri
‑
layer、mono
‑
layer以及纯plcl进行胶原酶酶解实验
94.用去离子水配制胶原酶溶液50ml，含302.85mg tris，5.55mg cacl2，10mg nan3，2mg胶原酶，通过0.22μm无菌滤膜过滤除菌后备用，用盐酸调节ph＝7.8；将tri
‑
layer、mono
‑
layer以及纯plcl充分干燥后，切成1
×
1cm；称重，记录原始重量为m0。将样品放入到离心管中，并加入胶原酶溶液，置于摇床上室温震荡；0
‑
12周后，取出仿生三层瓣膜小叶，用去离子水清洗3次，在80℃恒温干燥箱中烘干至恒重。再次称重，记录重量为m1。用如下公式计算失重率：失重率(％)＝(m1
‑
m0)/m0
×
100％；
95.结果为三层瓣膜小叶tri
‑
layer组的胶原酶酶解速率低于mono
‑
layer组，但tri
‑
layer、mono
‑
layer以及纯plcl三组之间并没有显著性差异。
96.4、上述tri
‑
layer、mono
‑
layer以及纯plcl的血液相容性实验
97.①
血小板粘附实验：用打孔器将上述tri
‑
layer、mono
‑
layer以及纯plcl剪成24孔板的大小，用生理盐水冲洗一下，在滤纸上吸干，放在24孔板内，铺平(n＝5)。取含抗凝剂的
兔子全血，3000rpm离心15分钟，缓慢吸出上清，得到高浓度血小板血浆(prp)。向每孔中加入0.3ml prp，37℃孵育60分钟。用无菌pbs冲洗三次，每次3分钟。用2.5％(v/v)戊二醛室温固定60分钟。70％、80％、90％、100％乙醇梯度脱水。用sem观察材料表面粘附的血小板个数及状态；观察结果如图3所示；
98.由图3可知：血小板粘附实验结果显示，三组材料表面均未粘附血小板。
99.②
溶血率测定：将tri
‑
layer、mono
‑
layer以及纯plcl剪成1
×
1cm(n＝5)，置于10ml生理盐水中，37℃孵育10分钟。取8ml含抗凝剂的兔子全血，加10ml生理盐水，得到18ml稀释血液。在10ml生理盐水中的样品中加入0.2ml稀释血液，37℃孵育60分钟。1000g离心10分钟。取100μl上清，加入到96孔板中，用酶标仪在545nm处测定od值。ods表示实验组(tri
‑
layer、mono
‑
layer或纯plcl 稀释血液)的od值，odp表示阳性对照组(去离子水 稀释血液)的od值，odn表示阴性对照组(生理盐水 稀释血液)的od值。溶血率(％)＝(ods
‑
odn)/(odp
‑
odn)
×
100％。
100.计算结果为三组材料的溶血率均低于0.1％，远低于国家(gb/t 16886)溶血率标准；
101.由上述结果可知：三组之间未见明显差异，但三层瓣膜小叶tri
‑
layer组的溶血率最低，说明仿生三层瓣膜小叶的血液相容性最佳。
102.5.上述tri
‑
layer、mono
‑
layer以及纯plcl上瓣膜间质细胞(vics)的体外成骨分化检测
103.培养细胞24小时后，吸弃普通低糖dmem培养基，在阴性对照组(n.c.)中加入普通低糖dmem培养基，阳性对照组(p.c.)及其他实验组中加入钙化诱导培养基，继续在37℃、5％(v/v)co2培养箱中培养。每隔一天更换钙化诱导培养基。在用钙化诱导培养基培养7天和14天后，吸弃培养基，用无菌pbs清洗材料。通过碱性磷酸酶(alp)定量定性实验和定量聚合酶链反应实验(qpcr)检测细胞成骨分化程度，从而确定其钙化水平；钙化诱导培养基培养的vics在tri
‑
layer、mono
‑
layer以及纯plcl上7天和14天时的alp活性定性分析结果如图4所示，聚合酶链反应实验检测细胞成骨分化过程及qpcr数据如图5所示，图中，a参与成骨分化的基因表达；b为twist1，c为runx2，d为atf4，e为alp，f为osx，g为ocn，h为opn和i为rankl基因表达水平；*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001；
104.由图4、图5可知，体外碱性磷酸酶(alp)定性染色结果显示，阳性对照组(p.c.组)的alp染色呈明显阳性，且数量最多；而阴性对照组(n.c.组)则无明显阳性出现。在第7天和14天，相比于阳性对照组，tri
‑
layer上的vics的钙化结节均显著降低。从qpcr结果可以看出，相比于阳性对照组，在第7天和第14天，所有三组材料均可以显著下调成骨分化相关基因的表达。mono
‑
layer材料在下调twist1、alp、atf4和ocn等相关基因的程度上与tri
‑
layer材料无显著性差异，这说明在组成比例一致的条件下，结构差异对钙化影响不大。此外，相比于plcl组，tri
‑
layer在下调runx2、osx、opn和rankl基因的程度上更明显，说明tri
‑
layer可通过上述途径延缓钙化的发生。
105.6.皮下植入模型评价上述tri
‑
layer、mono
‑
layer以及纯plcl材料钙化
106.实验动物选用50g左右的wistar雄性幼鼠，将上述tri
‑
layer、mono
‑
layer以及纯plcl材料剪成1
×
1cm大小，腹腔注射10％(w/v)水合氯醛麻醉大鼠(0.33ml/100g体重)后，剃皮毛。左右侧背部皮下分别植入实验组样品和戊二醛交联对照组样品(ga
‑
bhv)，缝合皮
肤切口，4～8周后将动物安乐死，取出移植物；
107.①
将取出来的材料在80℃恒温干燥箱中烘干至恒重，称重，记录重量，用于硝酸微波消解。消解后用电感耦合等离子体质谱法(icp
‑
ms)定量检测钙含量，检测结果如图6所示，图中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。
108.②
组织学染色定性观察钙化情况：苏木精&伊红(h&e)和von kossa染色直观反映样品的组织形态学改变和局部微观钙化点分布，4周(a
‑
c)和8周(d
‑
f)wistar幼鼠皮下埋植的h&e染色结果如图7所示，比例尺＝50μm；
109.4周(a
‑
c)和8周(d
‑
f)wistar幼鼠皮下埋植的cd31免疫荧光染色结果如图8所示，图中，微血管用cd31抗体标记(红色荧光)，细胞核用dapi标记(蓝色荧光)。比例尺＝50μm；
110.4周和8周的微血管数量定量检测结果如图9所示，图中，***表示p<0.001，****表示p<0.0001。
111.由图6可知，tri
‑
layer在4周时的钙离子含量低至0.13
±
0.03μg/mg，在第8周的数值为0.19
±
0.04μg/mg，均明显低于plcl组和mono
‑
layer组的钙离子含量，提示tri
‑
layer具有更好的抗钙化能力。此外，tri
‑
layer的钙化水平远低于临床使用的戊二醛交联生物心脏瓣膜(ga
‑
bhv)(21.8
±
32.6μg/mg)，也低于商品化的sino产品的钙化水平(0.7
±
1.2μg/mg)。说明在皮下埋植实验中，tri
‑
layer的抗钙化性能明显优于ga
‑
bhv，克服了ga
‑
bhv最大的缺陷。
112.由图7可知，tri
‑
layer、mono
‑
layer以及纯plcl材料保持整体结构，细胞从tri
‑
layer、mono
‑
layer以及纯plcl材料外表面浸润到内部。plcl组浸润的细胞仅仅集中在边缘部位，且浸润细胞数量少。移植8周后，mono
‑
layer和tri
‑
layer均可见一层再生良好的新组织，平均厚度大于plcl对照组。而tri
‑
layer由于生物相容性更好，因此细胞几乎浸润整个支架，深度更深，分布更均匀，细胞化程度更完全。因此，添加gel、ha和sf的mono
‑
layer和tri
‑
layer组生物相容性更好，有利于细胞浸润；其次，虽然mono
‑
layer和tri
‑
layer组均含有ha，且ha含量相同，但在tri
‑
layer中，plcl ha位于中间层，皮下埋植后会与上下两层形成一定的浓度梯度，中间层浓度高，而外侧浓度低，这样位于中间层的ha可以发挥一个趋化的作用，从而使外侧的细胞更易于向tri
‑
layer的中部迁移。
113.由图8、图9可知，在第4周和第8周时，plcl组微血管数量最少，且主要分布于支架外侧周围，而tri
‑
layer中的微血管数量最多，在整个三层瓣膜中均匀分布；图9定量结果也表明tri
‑
layer中的新生的微血管数量明显高于plcl对照组。第8周时，新生的微血管数量均随着时间的延长而有所增加，具体数量分别为，plcl组：14.14
±
2.11；mono
‑
layer组：33.94
±
4.16；tri
‑
layer组：54.14
±
2.67。支架内部形成的微血管有利于为长入的细胞进行氧气和营养物质的运输，同时可以运走代谢废物，有利于组织再生。
114.综上，tri
‑
layer有更优的力学性能和稳定性，能够促进细胞增殖和粘附、维持细胞活力、可以下调钙化相关基因表达，皮下埋植后显示出更优异的抗钙化、细胞化和血管化能力，为组织再生提供更有利的微环境。
115.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术
方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。