一种诱导人脐带间充质干细胞向神经细胞方向分化的方法与流程

1.本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种将人脐带间充质干细胞向神经细胞方向转分化的方法。


背景技术：

2.神经退行性疾病的重要病理学基础是局部神经元变性和坏死，目前治疗这类疾病的主要方法是用药物补充缺乏的神经递质，但这不能从根本上解决相应神经元变性坏死的问题，用细胞进行替代治疗日益成为这类疾病治疗方法的研究热点。间充质干细胞是由中胚层发育而来的一类多能干细胞，存在于结缔组织和器官间质中，可以在特定条件下分化为三层胚胎细胞。存在于哺乳动物胎儿脐带wharton’s胶质和血管周围组织中的间充质干细胞，理论上具有自我更新、增殖和多向分化等干细胞的特性，而且来源丰富，应用无伦理约束，同时，其免疫原性低，因此，人脐带间充质干细胞可能成为神经系统疾病细胞治疗的良好来源，但首要的问题是需要证实人脐带间充质干细胞是否具有向神经细胞方向分化的潜能。
3.作者在研究中体外培养人脐带wharton’s胶质来源的间充质干细胞，通过改良培养环境，成功地诱导了脐带间充质干细胞向神经细胞方向分化，证实了人脐带间充质干细胞具有向神经细胞方向转分化的潜能，为利用人脐带间充质干细胞替代治疗神经系统疾病提供了一定的实验依据。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的在于提供一种诱导人脐带间充质干细胞向神经细胞方向转分化的方法。
5.本发明为解决上述技术问题采用以下技术方案：
6.一种诱导人脐带间充质干细胞向神经细胞方向分化的方法，包括以下步骤：
7.s1.人脐带间充质干细胞的分离与培养；
8.s2.步骤s1所得培养后的人脐带间充质干细胞按1
×
104个/孔的密度接种于24孔培养板，用细胞培养液培养过夜；所述细胞培养液成分为：dmem/f12基础培养液89ml，fbs 10ml，100
×
ps 1ml；
9.s3.将24孔培养板中的细胞培养液换为诱导分化液，继续培养14d，期间每隔3d换液一次；所述诱导分化液的成分为：dmem/f12基础培养液97ml，fbs 2ml，bdnf2ug，gdnf 2ug，100
×
ps 1ml。
10.进一步的，步骤s1所述人脐带间充质干细胞的分离与培养方法包括：
11.s11.人脐带从医院剖宫产术中获取，获取前经产妇知情同意；
12.s12.在超净台上将脐带于磷酸盐缓冲盐水中漂洗30秒后，切成2
‑
3cm长的段，然后用镊子剥去脐带血管，用眼科剪将wharton’s胶剪碎成0.5
‑
1mm3大小的组织块；
13.s13.将组织块均匀贴在75cm2培养瓶底，各组织块间相距约5mm，加入少量细胞培
养液，细胞培养液的量不超过组织块的高度，以防止组织块漂浮，然后置于37℃、5％co2培养箱培养；
14.s14.过夜后，培养瓶中加入10ml细胞培养液，继续培养；
15.s15.经过5
‑
7d后，组织块周围可见有细胞长出，此时换细胞培养液；
16.s16.此后每2
‑
3d换液一次，约7
‑
9d后，细胞铺满瓶底约80％，用0.25％胰酶进行消化并传代，如此传3代后，可用于后续实验。
17.进一步的，所述步骤s13、s14、s15中的细胞培养液成分为：dmem/f12基础培养液89ml，fbs 10ml，100
×
ps 1ml。
18.进一步的，步骤s11所述脐带在获得后的两小时内进行细胞培养。
19.进一步的，步骤s2所述24孔培养板是经过浓度为0.01％的多聚
‑
l
‑
赖氨酸孵育过的。
20.有益效果
21.本发明通过应用脑源性神经营养因子(bdnf)胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)明显诱导脐带间充质干细胞分化为神经细胞。
附图说明
22.图1为人脐带间充质干细胞在进行诱导分化后的形态变化示意图。
23.其中图a为诱导分化1天后的细胞形态，此时细胞呈间充质干细胞特有的长梭形；图b为诱导分化7天后的细胞形态，此时有细胞已经呈现圆形，并且有的细胞两端出现细小的突起(箭头所示)；图c和图d为诱导分化14天后的细胞形态，此时有细胞从圆形的胞体上长出类似神经细胞的单极、双极或多极突起(箭头所示)。
具体实施方式
24.下面详细描述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。实施例：
25.本发明所使用的材料包括：
26.(1)dulbecco's modified eagle media(dmem)/f12基础培养液(thermo公司)；
27.(2)胎牛血清(fetal bovine serum，fbs，gibco公司)；
28.(3)脑源性神经营养因子(brain
‑
derived neurotrophic factor，bdnf，invitrogen公司)；
29.(4)胶质细胞源性神经营养因子(glial cell
‑
derived neurotrophic factor，gdnf，invitrogen公司)；
30.(5)0.25％胰酶(sigma公司)；
31.(6)100
×
青霉素链霉素混合液(penicillin and streptomycin，ps，beyotime公司)；
32.(7)多聚
‑
l
‑
赖氨酸(poly
‑
l
‑
lysine，pll，sigma公司)：dd h2o配成终浓度为0.01％的稀释液，过滤后分装保存；
33.(8)细胞培养液：dmem/f12基础培养液89ml，fbs 10ml，100
×
ps 1ml；
34.(9)诱导分化液：dmem/f12基础培养液97ml，fbs 2ml，bdnf 2ug，gdnf 2ug，100
×
ps 1ml。
35.一种诱导人脐带间充质干细胞向神经细胞方向分化的方法，包括以下步骤：
36.s1.分离与培养人脐带间充质干细胞：
37.s11.取剖宫产术中胎儿娩出后的脐带，立刻置于无菌的pbs中(脐带在获得后的两小时内必须进行细胞培养)；
38.s12.在超净台上将脐带于pbs中漂洗30秒后，切成2
‑
3cm长的段，剪开羊膜，然后用镊子剥去脐带血管，用眼科剪将wharton’s胶剪碎成0.5
‑
1mm3大小的组织块；
39.s13.将组织块均匀贴在75cm2培养瓶底，各组织块间相距约5mm，加入少量细胞培养液，细胞培养液的量不超过组织块的高度，以防止组织块漂浮，然后置于37℃、5％co2培养箱培养；
40.s14.过夜后，培养瓶中加入10ml细胞培养液，继续培养；
41.s15.约5
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7d后，组织块周围可见有细胞长出，此时换一次细胞培养液，大部分组织块可在换液时去除；
42.s16.此后每2
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3d换液一次，约7
‑
9d后，细胞铺满瓶底约80％，用0.25％胰酶进行消化并传代，如此传3代后，可用于后续实验。
43.s2.诱导人脐带间充质干细胞向神经细胞转分化：
44.s21.用多聚
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l
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赖氨酸孵育24孔培养板，过夜后去除；
45.s22.人脐带间充质干细胞按1
×
104个/孔的密度接种于多聚
‑
l
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赖氨酸孵育过的24孔培养板中，用细胞培养液培养过夜；
46.s23.将24孔培养板中的细胞培养液换为诱导分化液，继续培养14d，期间每隔3d换诱导分化液一次。
47.如图1所示，其中图a为诱导分化1天后的细胞形态，此时细胞呈间充质干细胞特有的长梭形；图b为诱导分化7天后的细胞形态，此时有细胞已经呈现圆形，并且有的细胞两端出现细小的突起(箭头所示)；图c和图d为在诱导分化14天后的细胞形态，此时有细胞从圆形的胞体上长出类似神经细胞的单极、双极或多极突起(箭头所示)，与原来的长梭状形态明显不同，说明人脐带间充质干细胞经诱导分化后可向神经细胞方向分化。