一种蚜虫取食损伤影响菌核病侵染的评估方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种蚜虫取食损伤影响菌核病侵染的评估方法。


背景技术：

2.油菜属十字花科芸薹属，目前生产上栽培的有三种类型：甘蓝型、芥菜型和白菜型油菜。油菜是仅次于谷类作物的世界第二大食物能源，是世界上大豆和棉花之后第三个主要的可食用油资源。
3.然而，油菜生长期常常受到病虫害的影响，制约产量的增加。大量的病虫害侵袭，造成油菜大面积毁种和缺苗断垄，严重影响油菜生长。在作物生长过程中，受到十字花科害虫和病原体的侵害，并且近些年入侵率持续增加，使油菜的产量受到严重的制约。其中，影响最大的虫害就是蚜虫。蚜虫是油菜上的重要害虫，是刺吸式口器的代表性昆虫，取食植物时将口针刺入植物组织表皮细胞和薄壁细胞间，插入筛管内，口针分泌出胶状唾液和水状唾液保护口针并且防止植物组织愈合，从而可以长时间不断地取食植物韧皮部汁液，获得碳水化合物，氨基酸，矿物质，维生素以及大分子物质。
4.传统鉴定油菜抗蚜的方法都是以在室内和田间接种蚜虫之后，观察油菜植株的感蚜的情况来确定，需要花费大量的人力，物力和财力，而且还要长期在室内饲养蚜虫种群，如果不保存这些物种，需要从田间去采集，田间的蚜虫长期受到农药的影响，产生较大的抗药性，对实验的作物也会长期产生适应性，造成评估的不准确，而且受到气候的影响较大，如果不适发的年限，蚜虫及病毒病均不易采集到，实验也会受到影响，而且传统的方法人为地因素太多，需要大量的重复来降低人为的影响，实验数据也存在较大的变化，且不能根据实验结果知道潜在的抗性机理及深层的原因。


技术实现要素：

5.基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种蚜虫取食损伤影响菌核病侵染的评估方法。
6.本发明提出的一种蚜虫取食损伤影响菌核病侵染的评估方法，包括如下步骤：
7.s1采用子囊孢子喷雾接种法，在不同品种油菜植株上接种病原菌，观察植株的发病情况，并对不同品种分级鉴定抗菌核病性，与田间结果相对照；
8.s2通过“y”型嗅觉仪对不同品种油菜植株进行蚜虫选择性实验，并与前期田间抗蚜实验结果和epg取食行为的结果结合，分析品种的抗蚜性，得到抗蚜性数据；
9.s3蚜虫在不同品种油菜植株上取食后，再喷洒子囊孢子悬浮液，观察植株的发病情况，得到抗病性数据；
10.s4通过分析比对抗病性与抗蚜性的数据，粗略消除相同时间内蚜虫在不同品种上的取食差异，进而评估在不同品种油菜植株上，蚜虫取食损伤对菌核病侵染的影响。
11.优选的，所述步骤s1不同品种油菜植株包括冬油菜品种德乐油6、冬油菜品种中双
11、冬油菜品种浙平4和春油菜品种新油17，不同品种油菜植株分为两组：第一组为冬油菜品种德乐油6和冬油菜品种中双11，第二组为冬油菜品种浙平4和春油菜品种新油17。
12.优选的，所述步骤s1通过人工接种菌核病，按照抗病等级划分标准，确定各油菜品种的抗菌核病性。
13.优选的，所述第一组冬油菜品种德乐油6和冬油菜品种中双11的田间蚜虫种群调查步骤为：
14.s1选取时间从2016年11月开始调查一直持续到2017年的3月，每个月的固定日期调查两个冬油菜品种上的蚜虫数量，结果显示，德乐油6上的蚜虫数量在2017年1月达到峰值457.50
±
75.83，之后逐渐下降，而中双11上的蚜虫数量逐渐增加，到2017年3月达到峰值159.82
±
22.28；
15.s2在每个调查时间点，德乐油6上的蚜虫数量均显著多于中双11，说明在田间环境下，德乐油6更适宜蚜虫的生长发育，相较于德乐油6，中双11对蚜虫有一定的抗性。
16.优选的，所述第二组冬油菜品种浙平4和春油菜品种新油17的田间温室蚜虫种群调查步骤为：
17.s1选取时间从2016年11月开始到2017年3月，每个月的固定日期调查冬油菜品种浙平4和春油菜品种新油17上的蚜虫数量，结果显示，冬油菜浙平4以及春油菜新油17上蚜虫数量均上升，在2017年3月份达到峰值；
18.s2在5个调查时间点中，除了2017年1月份两个品种上的蚜虫数量没有明显的差异，其它时间点，浙平4上的蚜虫数量均明显多于新油17，说明浙平4在田间更适合蚜虫的生长发育，而新油17相较于浙平4对蚜虫有一定的抗性。
19.优选的，所述步骤s2通过“y”型嗅觉仪测定蚜虫寄主偏好性：冬油菜品种德乐油6对蚜虫的吸引力明显高于冬油菜品种中双11，冬油菜品种浙平4对蚜虫的吸引力要强于春油菜品种新油17，即冬油菜品种德乐油6和冬油菜品种浙平4叶表的挥发物对蚜虫的吸引力强于冬油菜品种中双11和春油菜品种新油17。
20.优选的，所述步骤s2对蚜虫取食行为进行测定，对不同品种油菜植株连续记录6小时，每个处理至少记录20次，并筛选出epg参数，筛选出的epg参数分为四类：总览性参数、叶表参数、叶肉参数以及韧皮部参数分别进行测定，归类。
21.优选的，所述蚜虫取食行为进行测定的测试环境条件为：恒定光照和25
±
1℃。
22.本发明中，所述一种蚜虫取食损伤影响菌核病侵染的评估方法，通过分析比对抗病性与抗蚜性的数据，粗略消除相同时间内蚜虫在不同品种上的取食差异，评估在不同品种油菜植株上，蚜虫取食可以显著增加菌核病的侵染率。
附图说明
23.图1为本发明提出的一种蚜虫取食损伤影响菌核病侵染的评估方法的流程图；
24.图2为两个冬油菜上蚜虫种群的动态变化示意图；
25.图3为不同调查时间两个油菜品种上蚜虫种群数量的动态变化示意图；
26.图4为两个冬油菜品种上蚜虫取食对菌核病发病率的影响示意图；
27.图5为两个油菜品种上蚜虫取食对菌核病发病率的影响示意图。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
29.参照图1
‑
5，一种蚜虫取食损伤影响菌核病侵染的评估方法，包括如下步骤：
30.s1采用子囊孢子喷雾接种法，在不同品种油菜植株上接种病原菌，观察植株的发病情况，并对不同品种分级鉴定抗菌核病性，与田间结果相对照；
31.s2通过“y”型嗅觉仪对不同品种油菜植株进行蚜虫选择性实验，并与前期田间抗蚜实验结果和epg取食行为的结果结合，分析品种的抗蚜性，得到抗蚜性数据；
32.s3蚜虫在不同品种油菜植株上取食后，再喷洒子囊孢子悬浮液，观察植株的发病情况，得到抗病性数据；
33.s4通过分析比对抗病性与抗蚜性的数据，粗略消除相同时间内蚜虫在不同品种上的取食差异，进而评估在不同品种油菜植株上，蚜虫取食损伤对菌核病侵染的影响。
34.本发明中，步骤s1不同品种油菜植株包括冬油菜品种德乐油6、冬油菜品种中双11、冬油菜品种浙平4和春油菜品种新油17，不同品种油菜植株分为两组：第一组为冬油菜品种德乐油6和冬油菜品种中双11，第二组为冬油菜品种浙平4和春油菜品种新油17。
35.本发明中，步骤s1通过人工接种菌核病，按照抗病等级划分标准，如表1所示，确定各油菜品种的抗菌核病性。
36.表1鉴定油菜菌核病抗病等级划分标准
[0037][0038]
经过3次重复的鉴定，3次计算的相对抗性指数比对表1，发现德乐油6和中双11属于中抗菌核病的品种，浙平4为低感菌核病的品种，新油17为低抗品种。
[0039]
表2油菜菌核病人工接种鉴定结果
[0040][0041]
本发明中，第一组冬油菜品种德乐油6和冬油菜品种中双11的田间蚜虫种群调查步骤为：
[0042]
s1选取时间从2016年11月开始调查一直持续到2017年的3月，每个月的固定日期调查两个冬油菜品种上的蚜虫数量，结果显示，德乐油6上的蚜虫数量在2017年1月达到峰值457.50
±
75.83，之后逐渐下降，而中双11上的蚜虫数量逐渐增加，到2017年3月达到峰值159.82
±
22.28；
[0043]
s2在每个调查时间点，德乐油6上的蚜虫数量均显著多于中双11，说明在田间环境下，德乐油6更适宜蚜虫的生长发育，相较于德乐油6，中双11对蚜虫有一定的抗性。
[0044]
本发明中，第二组冬油菜品种浙平4和春油菜品种新油17的田间温室蚜虫种群调查步骤为：
[0045]
s1选取时间从2016年11月开始到2017年3月，每个月的固定日期调查冬油菜品种浙平4和春油菜品种新油17上的蚜虫数量，结果显示，冬油菜浙平4以及春油菜新油17上蚜虫数量均上升，在2017年3月份达到峰值；
[0046]
s2在5个调查时间点中，除了2017年1月份两个品种上的蚜虫数量没有明显的差异，其它时间点，浙平4上的蚜虫数量均明显多于新油17，说明浙平4在田间更适合蚜虫的生长发育，而新油17相较于浙平4对蚜虫有一定的抗性。
[0047]
本发明中，步骤s2通过“y”型嗅觉仪测定蚜虫寄主偏好性：冬油菜品种德乐油6对蚜虫的吸引力明显高于冬油菜品种中双11，德乐油6对蚜虫的吸引率达到65％，而在中双11上只有35％，冬油菜品种浙平4对蚜虫的吸引力要强于春油菜品种新油17，在浙平4上，对蚜虫的吸引率达到62％，而在新油17上只有38％。由于y型嗅觉仪测定的主要是叶表挥发物对蚜虫的吸引作用，即冬油菜品种德乐油6和冬油菜品种浙平4叶表的挥发物对蚜虫的吸引力强于冬油菜品种中双11和春油菜品种新油17，如表3所示。
[0048]
表3 y型嗅觉仪测定蚜虫寄主选择性
[0049][0050]
本发明中，步骤s2对蚜虫取食行为进行测定，确定了甘蓝蚜在油菜上的epg测定条件，对不同品种油菜植株连续记录6小时，每个处理至少记录20次，并筛选出epg参数，筛选出的epg参数分为四类：总览性参数、叶表参数、叶肉参数以及韧皮部参数分别进行测定，归
类，列表4定义如下。
[0051]
表4用于比较不同油菜品种抗蚜性的epg参数
[0052][0053]
[0054][0055]
第一组两个冬油菜品种上蚜虫的取食行为
[0056]
如表5所示，两个冬油菜品种的总览性参数没有明显的差异。但叶表参数显示，蚜虫在中双11上(5.80
±
0.26)比在德乐油6上(4.88
±
0.17)显著推迟开始第一次穿刺的时间(f＝2.52,df＝17,t＝
‑
2.84,p＝0.0112)。表明相比于在德乐油6上，蚜虫在中双11的叶片表面遇到一定的阻碍，这与我们y型嗅觉仪的研究结果一致，或许是中双11叶片表面存在排拒性挥发物，导致蚜虫推迟开始探测的时间。蚜虫口针进入叶片叶肉细胞中之后，大多数与叶肉相关的参数在两个品种之间没有显著的差异。但在德乐油6上蚜虫穿刺细胞的总时间(6.01
±
0.18)显著短于中双11(6.63
±
0.20,f＝1.2661,df＝18,t＝
‑
2.2720,p＝0.0356)。说明在叶肉中，蚜虫在中双11上遇到一定的阻碍，因此耗费的路径期时间较德乐油6长。在韧皮部，蚜虫在德乐油6上唾液分泌占韧皮部行为的比例(0.09
±
0.01,f＝697.87,df＝7,t＝
‑
2.39,p＝0.0483)明显低于中双11，但持续取食的比例(1.57
±
0.00)却明显高于中双11。在德乐油6上唾液分泌的总时长(4.45
±
0.14)也明显短于中双11(5.64
±
0.29,f＝3.56,df＝13,t＝
‑
3.81,p＝0.0022)。其它参数没有明显的差异。说明在韧皮部，中双11对蚜虫的取食存在一定的阻碍性，汁液的适合度也低于德乐油6。可见，中双11在叶表，叶肉以及韧皮部均较德乐油6更不适合蚜虫取食。因此，我们将这两个冬油菜品种中的中双11定义为抗蚜虫的冬油菜，德乐油6定义为感蚜虫的冬油菜。
[0057]
第二组春油菜与冬油菜品种的抗蚜性鉴定
[0058]
正如表5中所出示的，在冬春油菜之间，大多数总览性参数没有显著的差异。除了蚜虫在浙平4上(10.22
±
0.01)比在新油17上花费更长的探测时间(10.18
±
0.01,f＝2.01,df＝18,t＝
‑
2.22,p＝0.0391)，意味着浙平4更适合蚜虫取食。叶片表面，与浙平4相比，蚜
虫在新油17上显著推迟开始第一次探测(f＝1.09,df＝21,t＝2.73,p＝0.0125)，这也与我们y型嗅觉仪的研究结果相一致，更多的蚜虫被浙平4所吸引，挥发性物质的存在使更多的蚜虫在浙平4上更快地开始刺探植株。在叶肉中，蚜虫在两个品种之间没有显著的差异。只是在新油17上，蚜虫在每次探测中产生显著更多的细胞穿刺。并且蚜虫在新油17上从第一次探测开始到第一个细胞穿刺的时间(6.33
±
0.40)也明显长于在浙平4上(5.09
±
0.32,f＝1.34,df＝22,t＝2.48,p＝0.0214)。总路径时间在新油17上(9.39
±
0.17)显著短于在浙平4上(9.80
±
0.08)。这也说明新油17的叶肉中存在一定的定向阻碍，口针在穿刺通过叶肉的过程中，容易被误导，但这种误导整体上不会影响口针通过叶肉组织。可见，在叶肉组织中，很难准确的判断两个品种的抗性。口针进入韧皮部之后，韧皮部的阻碍性在两个品种之间没有明显的差异。但蚜虫在第一次持续取食之前的唾液分泌时间在新油17上显著短于浙平4上，而持续取食的比重则显著高于在浙平4上。也就是说，在韧皮部，蚜虫在新油17上遇到的阻碍更小，汁液更适合蚜虫取食。总的来说，新油17的叶表对蚜虫有一定的阻碍性，但韧皮部的汁液更适合蚜虫取食，而在浙平4上则相反。但结合田间试验和y型嗅觉仪的研究结果，浙平4更适合蚜虫的生存发育，浙平4叶表或许除了具备吸引物质之外，还可能存在其它的结构性的适宜性方便蚜虫取食。
[0059]
表5甘蓝蚜在四个油菜品种上的取食行为
[0060]
[0061][0062]
本发明中，蚜虫取食行为进行测定的测试环境条件为：恒定光照和25
±
1℃。
[0063]
如图4所示，蚜虫取食可以显著增加菌核病的侵染率，在德乐油6上，取食前喷洒子囊孢子液，发病率只有26％，但蚜虫取食后，发病率上升到74％。在中双11上，取食后发病率也明显增加了3倍，但在取食前和取食后，两个冬油菜品种之间的发病率没有显著的差异。
[0064]
如图5所示，春油菜和冬油菜上，菌核病喷洒的发病率没有明显的差异，蚜虫取食后，也没有明显的差异，然而，蚜虫取食后，在两个品种上均可以显著增加菌核病的侵染率。浙平4上，取食后发病率增加了2倍多，在新油17上，取食使发病率上升到90％。
[0065]
本发明：采用子囊孢子喷雾接种法，在不同品种油菜植株上接种病原菌，观察植株的发病情况，并对不同品种分级鉴定抗菌核病性，与田间结果相对照；通过“y”型嗅觉仪对不同品种油菜植株进行蚜虫选择性实验，并与前期田间抗蚜实验结果和epg取食行为的结果结合，分析品种的抗蚜性，得到抗蚜性数据；蚜虫在不同品种油菜植株上取食后，再喷洒子囊孢子悬浮液，观察植株的发病情况，得到抗病性数据；通过分析比对抗病性与抗蚜性的数据，粗略消除相同时间内蚜虫在不同品种上的取食差异，进而评估在不同品种油菜植株上，蚜虫取食损伤对菌核病侵染的影响。
[0066]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。