修复环的方法和胶原凝胶组合物与流程

collagen gels,”paper presented at:orthopedic research society,annual meeting；san francisco,ca(2012))。然而，尚无研究报道在体内使用可注射的生物材料治疗环缺损。
11.由针穿刺诱导的环缺损导致在大鼠尾脊中可预测的椎间盘退化类型(keorochana等，“the effect of needle size inducing degeneration in the rat caudal disc:evaluation using radiograph,magnetic resonance imaging,histology,and immunohistochemistry,”spine j.10:1014
‑
23(2010)；han等，“a simple disc degeneration model induced by percutaneous needle puncture in the rat tail,”spine 33:1925
‑
34(2008))。在此类模型中，退化由髓核组织从穿刺缺损挤出而引发。尽管针穿刺模型已频繁用于检测用于椎间盘再生的生物材料(zou等，“efficacy of intradiscal hepatocyte growth factor injection for the treatment of intervertebral disc degeneration,”mol.med.rep.8:118
‑
22(2013)；zhang等，“intradiscal injection of simvastatin retards progression of intervertebral disc degeneration induced by stab injury,”arthritis res.ther.11:r172(2009)；gullung等，“platelet
‑
rich plasma effects on degenerative disc disease:analysis of histology and imaging in an animal model,”evid.based spine care j.2:13
‑
8(2011)；sheikh等，“in vivo intervertebral disc regeneration using stem cell
‑
derived chondroprogenitors,”j.neurosurg.spine 10:265
‑
72(2009))，但是尚没有研究使用这种模型来研究所诱导缺损的修复以阻止椎间盘退化。
12.本发明涉及克服本领域中的这些和其他缺陷。
13.发明概述
14.本发明的第一个方面涉及一种修复环的方法。所述方法包括提供胶原凝胶组合物，所述胶原凝胶组合物包含胶原凝胶和交联剂。在修复环的条件下，将所述胶原凝胶组合物注射至环修复位点中、注射至环修复位点周围或注射至环修复位点附近。所述交联剂以如下的量包括在胶原凝胶中或者加入胶原凝胶中：所述量足以引起胶原凝胶交联，并且能够使胶原凝胶组合物与在注射所述胶原凝胶组合物的位置附近的组织整合。
15.本发明的第二个方面涉及一种胶原凝胶组合物，所述胶原凝胶组合物包含胶原凝胶和交联剂。所述交联剂以如下的量包括在组合物中和/或加入组合物中：所述量足以引起所述胶原凝胶交联，并且能够使所述胶原凝胶组合物与同所述胶原凝胶组合物接触的组织整合。
16.在其他方法和组合物不成功时，注射本发明的胶原凝胶组合物的方法能够成功。所述凝胶组合物是可注射的，并且在递送时具有低粘度，因此可以被递送至多种形状和尺寸以部分或完全封闭环缺损。所述凝胶组合物的递送不会导致对任何周围组织的损伤，并且显示出与相邻天然椎间盘组织整合。而且，由于所述方法涉及注射生物材料的凝胶组合物，因而没有导致在周围椎间盘空隙中留下破坏性碎片的灾难性故障的可能性。如上文所述，天然的环主要包含i型胶原，因而递送交联的i型胶原凝胶以修复区域为长期组织生长和生物修复缺损提供了基底。
17.在下文中阐述的实施例中，在大鼠尾脊的af中诱导针穿刺缺损后，高密度i型胶原显示出修复环缺损长达5周。这种能力与rf交联正相关。针穿刺大鼠尾显示出是研究用于环
缺损的生物材料的适宜的体内模型。下文实施例中所述的实验的目的是评估hdc修复大鼠尾脊中的针穿刺af缺损的能力。具体地，目的是检测注射的hdc凝胶是否能够防止核组织挤出和/或随后的ivd退化(如通过组织学和放射学结果所确定)。此外，评估注射的胶原的交联是否影响修复过程。对于该目的而言，以不同的浓度加入核黄素(“rf”)(其为一种胶原交联的光活性引发剂)。使用大鼠尾模型筛选胶原凝胶的这些不同组成。
18.附图简述
19.图1a
‑
c是用于根据t2
‑
rt确定髓核尺寸方法的照片。图1a显示了具有针穿刺椎间盘(白色箭头)的大鼠尾的t2加权的磁共振图像。图1b显示了以彩色图显示的具有t2
‑
rt测量的匹配图像。在近端健康相邻椎间盘的np内绘制roi。将减除阈值设定为在roi的t2
‑
rt平均值以下2个标准偏差。图1c的图像显示了低于阈值的所有体素被减除。随后，计数在椎间盘空隙中的剩余体素。roi表示所关注的区域。
20.图2是显示所有穿刺组的五周结果的示例图像的图像图表。根据np体素计数和组织学截面测量结果，相比于健康椎间盘，所显示的来自0.5mm rf组的试样显示其np尺寸仅略有减小。来自0.25mm rf组的ivd显示了减小的核尺寸。np仍显示均质性和高信号，但是丧失了其椭圆形。在射线照片上亦可见的减小的椎间盘高度导致pfirrmann iii级。注射未交联胶原的ivd显示出更大的np尺寸减小。np仍是高信号，但是显示出更高的异质性。未治疗的椎间盘显示出终末的退行性改变：在磁共振图像上的黑色椎间盘以及塌陷的椎间盘空隙。np组织完全被结缔组织取代。可见终板损伤。np表示髓核。
21.图3a
‑
b是显示核尺寸和椎间盘高度测量结果的图。图3a的图显示了根据np体素计数测量结果的核尺寸。在5周中0.5mm rf组显示出比健康椎间盘略少的np体素。在第2周至第5周之间两个交联组的体素计数保持恒定。在5周中注射有未交联胶原凝胶的动物显示出np体素的持续下降。在所有时间点未治疗组均显示出最低的体素计数值。图3b显示了与np体素计数结果相关的椎间盘高度测量结果。0.5mm rf组保留了其初始椎间盘高度的88％；未治疗组降至55％。组内的变化是源于磁共振成像调度限制。np表示髓核；dhi表示椎间盘高度指数。
22.图4a
‑
f是5周后被穿刺的ivd的不同的组织学结果的照片。图4a显示番红o染色，0.25mm rf组。椎间盘显示出标准尺寸的椭圆形np。针穿刺缺损和纤维帽用方框标出。图4b表示偏振光下更高的放大倍数。针穿刺缺损清晰可见(白色箭头)。af薄层内部三分之二保持分离；没有组织修复的迹象。缺损的外部三分之一通过纤维帽(“fc”)桥接。非双折射的fc基质似乎浸润亮的双折射的af纤维。图4c显示了0.25mm rf组的阿尔新蓝染色。仅薄的纤维线(黑色箭头)桥接环缺损(白色箭头)。图4d显示了未交联组的阿尔新蓝染色。无纤维组织可见地修复缺损(白色箭头)。远端纤维环(“daf”)和近端纤维环(“paf”)保持分离，并且渗入周围的瘢痕组织(“st”)。黑色箭头指向被隔离的np物质。图4e显示了未交联组的阿尔新蓝染色。np组织(黑色箭头)挤出通过环缺损进入椎旁空隙。af显示出多条裂缝(白色箭头)。图4f表示未治疗的对照ivd。针穿刺缺损(箭头)诱导了严重的退行性改变。未见有序的af组织；np已被结缔组织取代。关键词：b，终板骨；ct；计算机断层扫描。
23.图5a
‑
f是5周后0.5mm rf组被穿刺的ivd的番红o染色的照片。图5a显示较低放大倍数。np显示出标准尺寸和椭圆形。清楚的边界分离np与af和终板骨b。方框标注了针穿刺缺损。图5b是显示穿透通过af的每个层的针穿刺缺损的更高放大倍数。方框标注的纤维帽
在af的外部桥接环缺损。相比于周围的st，这种纤维组织的基质被番红o染色更深。图5c和5d显示更高放大倍数的纤维帽，其看来正渗入af纤维。图5e和5f显示了在偏振光下的观察的与a至c相同的试样。亮的双折射af纤维与纤维帽的非双折射的组织配合。关键词：af表示纤维环；np，髓核；st，瘢痕组织；fc，纤维帽。
24.图6a
‑
b是显示胶原凝胶结果的照片。图6a显示了就在胶原凝胶(“cg”)注射后的番红o染色、偏振光照射。高密度胶原(hdc)分布在椎旁空隙中，从而覆盖了af缺损。与af不同的是，hdc在偏振光下是非双折射的，表明了更低的组织有序性。图6b显示更高放大倍数。可见穿刺缺损(箭头)。cg显示为番红o染色略微为阳性的无定形均质组织。其未迁移至af缺损。关键词：np表示髓核；af，纤维环；cg，胶原凝胶。
25.图7是显示胶原注射5周后在椎旁空隙中使用阿尔新蓝染色的胶原结果的照片。三个无定形均质胶原岛被瘢痕组织环绕。岛a显示无细胞浸润，岛b显示非常有限的细胞浸润。岛c显示出高度的成纤维细胞浸润。如胶原组织中的重吸收区(黑色箭头)所表明，细胞显示为将组织重组。无炎症反应迹象。
26.发明详述
27.本发明涉及一种修复环的方法。该方法包括提供一种胶原凝胶组合物，所述胶原凝胶组合物包含胶原凝胶和交联剂。在修复环的条件下，将所述胶原凝胶组合物注射至环修复位点中、注射至环修复位点周围或注射至环修复位点附近。所述交联剂以如下的量包括在胶原凝胶中或者加入胶原凝胶中：所述量足以引起胶原凝胶交联，并且能够使胶原凝胶组合物与在注射所述胶原凝胶组合物的位置附近的组织整合。
28.本发明还涉及一种胶原凝胶组合物，所述胶原凝胶组合物包含胶原凝胶和交联剂。所述交联剂以如下的量包括在组合物中和/或者加入组合物中：所述量足以引起所述胶原凝胶交联，并且能够使所述胶原凝胶组合物与同所述胶原凝胶组合物接触的组织整合。
29.椎间盘将脊椎彼此之间分离，并且通过缓冲冲击和吸收传递至脊柱的应力和应变而充当天然减震器。椎间盘组织主要包括三个区域：终板、纤维环(“af”)和髓核(“np”)。纤维环是坚硬的胶原
‑
纤维复合物，其具有包绕致密度较小的纤维软骨和过渡区的i型胶原纤维的外缘。这些胶原纤维以圆柱形的层排列。在每个层中，纤维彼此平行；但是，层间的纤维取向在30至60度之间变化。在脊柱的扭转、弯曲和压缩应力的过程中，这种排列方式提供了支撑。存在于椎间盘的上表面和下表面处的终板与纤维环共同起作用，以在椎间盘中内容纳髓核的凝胶样基质。髓核由蛋白聚糖软基质和在水中无规取向的ii型胶原纤维组成。蛋白聚糖和水含量在椎间盘中心处为最高，并且向椎间盘外周降低。
30.进行本发明的方法以修复例如ivd的纤维环结构。如在本文中所使用，术语“修复”指恢复、保持和/或增强功能和/或结构的任何修正、增强、整修、补救、弥补、使其完好、更新、缝补、修补等。因此，术语“修复”也可指修正、增强、整修、补救、弥补、使其完好、更新、缝补、修补、保持(即避免进一步损伤或退化)或者以其他方式恢复功能和/或结构。“修复”包括完全修复和部分修复椎间盘的环缺损。而且，术语“修复”还包括治疗、预防或改善与椎间盘环缺损相关或由椎间盘环缺损引起的至少一种症状。“治疗”、“预防”或“改善”指推迟或阻止发生、逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止与椎间盘环缺损或损伤相关的状态的进展或严重程度的进展、加重或恶化。
31.在一个实施方式中，进行本发明的方法以“修复”椎间盘的af，并且在修复环的治
疗后，在数天、数周、数月或数年的一段时间后，椎间盘高度的至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％或更多得以保持。
32.在进行本发明的方法时，在有效修复环的条件下，将胶原凝胶组合物(如下文所述)注射至环修复位点中、注射至环修复位点周围或注射至环修复位点附近。例如可以使用插入受影响的椎间盘的纤维环中的导向针(但是导向针不是必需的)进行组合物的注射。然后，可以通过导向针插入注射针。使用注射针穿透纤维环可能是必需的或者不是必需的。可以使用成像技术(例如荧光透视、磁共振成像、计算机断层扫描或本领域熟知的任何其他类似技术)验证导向针针尖的位置或注射针针尖的位置。
33.在一个实施方式中，注射不会导致对周围组织的损伤。
34.在另一个实施方式中，注射产生与环的天然组织整合的被注射的凝胶组合物。
35.本发明的方法可以在任何哺乳动物(包括人)中进行。
36.本发明的胶原凝胶组合物还可以用于修复纤维软骨结构(如半月板、盂唇和韧带/肌腱止点，以及硬脊膜闭合)中的缺损。
37.如所提及的，本发明的方法包括提供和注射胶原凝胶组合物。现将对此类组合物进行描述。存在几种类型的胶原。i、ii、iii和iv型胶原主要用作生物材料的来源。i型胶原可以存在于大部分结缔组织中，是活的生物体中丰度最高的胶原类型，并且存在于肌腱、真皮和骨中。工业上，在很多情况下，胶原可以从生物体的那些部分中提取。ii型是形成软骨的胶原。iii型胶原在与i型胶原相同的组织中以少量存在。iv型胶原形成基底膜。i、ii和iii型作为胶原纤维存在于活的生物体中，并且具有保持组织或器官的强度的主要功能。不具有纤维化能力的iv型形成4个分子构成的网状组装体，并且可能参与基底膜中的细胞分化。如本文中所使用，术语“胶原”指本领域公知的或待发现的任意一种或多种类型的胶原。
38.在一个实施方式中，在胶原凝胶组合物中的胶原是i型胶原。其与天然af是相同类型的胶原。当将i型胶原递送至已经含有i型胶原的组织时，(在注射后)对凝胶组合物免疫应答的可能性和与周围组织的任何不利的相互作用被消除。
39.胶原可以是可溶性或不溶性的，并且可以来自任意动物中的任意组织。例如，可以使用来源于皮肤和肌腱(包括大鼠尾肌腱、小牛皮肤胶原和/或小牛伸肌肌腱)的胶原来制备胶原凝胶。
40.在一个实施方式中，胶原凝胶以约1
‑
200mg/ml、约10
‑
180mg/ml、约20
‑
160mg/ml、约30
‑
140mg/ml、约40
‑
120mg/ml、约50
‑
100mg/ml、约60
‑
80mg/ml、高于约50mg/ml、高于约100mg/ml、高于约150mg/ml、低于约200mg/ml、低于约150mg/ml、低于约100mg/ml或者低于约50mg/ml的浓度包括在本发明的组合物中。
41.在本发明的组合物中包含交联剂，所述交联剂以足以引起胶原凝胶交联的量包括在本发明的组合物中。该试剂还可以引起与周围胶原纤维的一些交联。这意味着例如所注射的凝胶与缺损周围的组织具有很好的粘附。换言之，本发明的组合物在注射时会稳定地整合至周围组织中。根据一个实施方式，这意味着一旦将本发明的组合物注射至环修复位点，其由于与周围组织整合而能够停留在修复位点的位置。
42.在一个实施方式中，使用基于胶原的材料的交联来抑制该材料的抗原性，以防止超急性排斥反应。
43.交联还用于改善机械性质和增强抗降解性。
44.可以使用不同的交联方法来交联本发明的胶原凝胶组合物。可以使用uv或可见光处理来光引发交联。可以改变光暴露的多个方面，如光暴露时间(0
‑
600或更多秒)和强度(高达2,000mw/cm2)。uv照射(在例如200
‑
300nm)是增加胶原纤维的机械强度的一种迅速且易控的方法，并且其不产生需要随后通过洗涤生物材料而除去的任何毒性副产物。胶原凝胶可以包含含有羟基的组分，如多糖或gag，所述含有羟基的组分可以优化uv和/或可见光的交联处理。可以在光敏剂染料(如亚甲基蓝和玫瑰红着色剂)的存在下使用可见光交联胶原。
45.还可以使用电子束和/或γ射线通过辐射处理来进行交联。辐射引发的交联不需要使用细胞毒性的交联剂，并且没有必需的后续处理步骤。辐射引发的交联的另一个优势是γ射线能够穿透至生物材料的深部，这可能是使用其他方法(如可见光或uv光引发的交联)无法实现的。
46.可以使用一种或多种交联剂来交联本发明的胶原凝胶组合物。交联剂是含有能够化学连接至蛋白上的特定官能团(伯胺、巯基等)的两个或更多个反应性末端的分子。优选地，交联剂不应导致非挥发性副产物的形成。交联剂可以包括但不限于戊二醛、甲醛或六亚甲基二异氰酸酯。交联剂还可以是碳二亚胺、聚醛、聚砜、经活化的peg、环氧化物、咪唑或二异氰酸酯。交联可以包括使用醛(如戊二醛或甲醛(其可以交联赖氨酸残基))、1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)(其可以交联氨基和羧基)，或者聚环氧化合物(如丙三醇聚(缩水甘油基醚)和聚(乙二醇二缩水甘油基醚))处理。交联剂可以是六亚甲基二异氰酸酯(hmdi)，其能够交联氨基。
47.在一个实施方式中，交联剂选自：核黄素、玫瑰红、核糖、核心蛋白聚糖、碳二亚胺、醛及其组合。根据一个特定的实施方式，交联剂是核黄素。将交联剂(例如核黄素)混入凝胶不仅有助于促进在胶原凝胶中的交联，还有助于促进与周围天然胶原纤维的交联。本发明的胶原凝胶组合物在缺损区域中聚合，这使得组合物中的胶原利用与周围天然胶原的天然相互作用以促进在缺损部位处的凝聚和机械愈合。在缺损部位中的聚合还使得凝胶扩散并适应不同的缺损形状和尺寸。
48.交联剂可以以高达约1.5mm、约2.0mm、约2.5mm、约3.0mm、约3.5mm、约4.0mm、约4.5mm、约5.0mm、约5.5mm、约6.0mm、约6.5mm、约7.0mm或约7.5mm的浓度，或者以大于约7.5mm的浓度包括于组合物中。
49.本发明的胶原凝胶组合物是高度机械、化学和生物可调的。以允许改变胶原密度和交联剂浓度的方式加工胶原，所述胶原密度和交联剂浓度均影响机械性质。还可以在混合过程期间、混合过程之前和/或混合过程之后加入细胞，从而增加组合物的通用性。可以将各种生长因子和试剂(包括治疗剂)加入组合物中，以引发来自细胞和周围组织的特异性应答。
50.本发明的胶原凝胶组合物还可以包含活细胞。细胞可以是干细胞或祖细胞、分化的细胞、终末分化的细胞或其组合。细胞可以是全能、多能或单能干细胞，或者诱导的多能干细胞。细胞可以是经由不需要破坏人胚胎的技术(例如经由已建立的细胞系)而得到的人胚胎干细胞。间充质干细胞(也称为骨髓基质细胞、多能基质细胞或msc)是能够分化成多种细胞类型(包括成骨细胞、肌腱细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞)的多能干细胞。这些细胞
laboratory manual(cold springs laboratory press,2001)中，其通过引用在此整体并入本技术。用于操作核酸的许多公知技术和方案(例如在制备核酸构建体、诱变、测序、将dna引入细胞和基因表达以及蛋白分析中)详细描述于current protocols in molecular biology(fred m.ausubel等编著，2003)中，其通过引用在此整体并入本技术。
57.不同的遗传信号和加工事件控制多种水平的基因表达(例如dna转录和信使rna(“mrna”)翻译)以及随后由宿主细胞产生和表达的所需蛋白的量。dna的转录依赖于启动子的存在，启动子是指引rna聚合酶的结合，并由此促进mrna合成的dna序列。启动子的“强度”(即其促进转录的能力)是不同的。对于表达已克隆基因的目的而言，希望使用强启动子以获得高转录水平并因此获得高表达水平。取决于所利用的宿主系统，可以使用多种合适的启动子中的任意一种。适于指引在哺乳动物细胞中的表达的常用启动子包括但不限于sv40、mmtv、金属硫蛋白
‑
1、腺病毒ela、cmv、立即早期免疫球蛋白重链启动子和增强子，以及rsv
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ltr。启动子可以是组成型的，或者是组织特异性或诱导性的。
58.根据一个实施方式，本发明的组合物是可注射的。由于本发明的胶原凝胶组合物是可注射的，因而可使用微创外科技术和标准医疗设备将其递送至不同缺损部位。其他af修复组合物和技术需要更大的手术部位以便锚定至周围组织。而且，与本发明的组合物不同，其他现有的af修复技术不能适应不同的缺损形状和尺寸，这使得外科医生需要除去更多天然组织以产生均一的缺损。
59.在本发明的胶原凝胶组合物的一个实施方式中，该胶原凝胶组合物在递送时具有低粘度，并且不依赖于缺损的尺寸和形状而在任意缺损中聚合。而且，使用例如核黄素在原位交联是新的和独特的，因为能够形成具有更高机械稳定性的凝胶而不损坏凝胶/af界面。
实施例
60.下述实施例旨在示例本发明的实施，但是其并非旨在限制本发明的范围。
61.材料和方法
62.研究组
63.本研究使用42只雄性、10至12周龄、近交系、无胸腺裸大鼠。将动物分成4组。第1组14只被针穿刺并注射浓度为15mg/ml的hdc。第2组15只被穿刺并注射rf交联的hdc(15mg/ml)：9只使用0.25mm的rf，6只使用0.5mm的rf。第3组6只被穿刺并保持不进行治疗以作为对照。在5周后处死这3组中的所有动物。收集尾部并用于组织学分析。处死第4组的6只动物；收集尾部，随后进行针穿刺并注射hdc。这组用来研究直接注射后的胶原形态和分布。
64.根据美国兽医医师协会的标准方案使用二氧化碳处死所有动物。
65.该研究经特种外科医院的动物管理和使用委员会和纽约州批准，并依据由其提供的指导原则进行。
66.胶原凝胶的制备
67.如之前所述(cross等，“dense type i collagen matrices that support cellular remodeling and microfabrication for studies of tumor angiogenesis and vasculogenesis in vitro,”biomaterials 31:8596
‑
607(2010)；bowles等，“self
‑
assembly of aligned tissue
‑
engineered annulus fibrosus and intervertebral disc composite via collagen gel contraction,”tissue eng part a 16:1339
‑
48
(2010)，其通过引用在其整体并入本技术)，从大鼠尾肌腱采集和复溶胶原。在0.1％醋酸中消化纤维，冷冻48小时，冻干，并在0.1％醋酸中以20mg/ml复溶。就在递送前，将酸性胶原溶液与含有10x dulbecco磷酸盐缓冲液(“dpbs”)、1n naoh和1x dpbs的工作溶液混合，以引发15mg/ml的最终胶原凝胶的聚合。对于rf组，以所需浓度将rf加入1x dpbs中。注射后，将含有rf的凝胶暴露于波长为480nm的蓝光下达40秒以引发交联。
68.开放的针穿刺和胶原注射
69.在影像学控制下对尾部第3和第4椎骨之间的目标水平进行定位。将动物麻醉并置于俯卧位。在标记水平上制造2
‑
cm的纵向皮肤切口。然后暴露af，需要非常小心以保护其不被损坏。随后，使用附接至含有胶原凝胶的注射器的18号针头对af进行穿刺。穿刺后立即将约0.5ml的凝胶注射至缺损周围。当将rf加入胶原时，凝胶在原位固化。将对照组穿刺并且不进行治疗。为了将穿刺技术标准化，针总是在相同取向上(针斜面向上)插入至相同深度(直至斜面完全穿透af)。
70.定量磁共振成像
71.根据磁共振成像(“mri”)体素的数量利用定量成像评估np的尺寸，在本技术中磁共振成像体素的数量由标记的np体素计数组成。在穿刺后1、2和5周时在7t mri(bruker 7t usr preclinical mri system)上获得磁共振图像(图1a)。
72.基于12个采集的回波的t2信号强度对弛豫时间的拟合半对数曲线，使用矢状多层多回波脉冲序列(tr＝2000ms、te＝12ms、nex＝2、回波数＝12、回波间隔＝12ms、切片厚度＝1mm、矩阵大小＝320
×
320、分辨率：125μm
×
125μm
×
1mm)创建t2图像。使用bruker(bruker biospin corporation,billerica,ma)的所有权程序topspin用于拟合过程。将色彩图分配给所得t2图像(图1b)。接下来，在被穿刺的ivd近侧的健康椎间盘的np中心内绘制尺寸为约1mm2的标准目标区域(“roi”)。测定该roi的平均t2弛豫时间(t2
‑
rt)，使用减去2个标准偏差的该值来设定在该切片中所有体素的减除阈值(图1b)。随后减去t2值低于阈值的体素(图1c)。其结果是，仅有代表np组织的具有t2值的体素保留在椎间盘空隙中，然后对其进行计数。在各时间点，对被穿刺的椎间盘的平均体素计数与近端相邻健康ivd的平均体素计数进行比较。
73.定性mri分析
74.利用矢状turborare序列(tr＝2017ms、te＝60ms、nex＝6、回波链长＝12、切片厚度＝1mm、矩阵大小＝320
×
320、分辨率：125μm
×
125μm
×
1mm)用于定性评估。使用经改良的pfirrmann评分(yu等，“mri assessment of lumbar intervertebral disc degeneration with lumbar degenerative disease using the pfirrmann grading systems,”plos one 7:e48074(2012)，其全部内容通过引用在此并入本技术)，其根据np信号强度、均质性和椎间盘高度损失所定义概括了4个退化级别(表1)。
75.表1：经改良的磁共振成像pfirrmann分级
76.77.椎间盘高度测量
78.在数字射线照相柜中获得椎间盘高度。非常小心地获得索引区段的真实侧位片。基于lu等，“effects of chondroitinase abc and chymopapain on spinal motion segment biomechanics.an in vivo biomechanical,radiologic,and histologic canine study,”spine22:1828
‑
34(1997)的经改良的方法(其全部内容通过引用在此并入本技术)，ivd高度表示为椎间盘高度指数，所述椎间盘高度指数由椎间盘高度除以相邻椎体高度计算。测定术前以及术后第1、2和5周时间点的椎间盘高度。
79.组织学
80.在适当固定后，将尾部脱钙、正中矢状位切开并转移至75％乙醇中。将节片包埋于石蜡中，然后切成5μm厚，并使用阿尔新蓝和番红
‑
o染色。通过绘制围绕核的roi来测定np的尺寸，并且随后使用bioquant图像程序测定该roi的截面积(图2)。将被穿刺的椎间盘的平均截面积测定结果与健康近端相邻ivd的平均截面积测定结果进行比较。使用han分级系统来描述被穿刺的ivd的退化阶段。该系统基于af/np细胞结构、形态和边界(han等，“a simple disc degeneration model induced by percutaneous needle puncture in the rat tail,”spine 33:1925
‑
34(2008)，其全部内容通过引用在此并入本技术)。分级系统的范围为5(健康椎间盘)至15(终末退化的椎间盘)。
81.统计学
82.使用方差模型的嵌套多层次分析对np体素计数和椎间盘高度数据进行评估，其中在被穿刺和健康相邻水平、未治疗的穿刺对比胶原注射和rf浓度中嵌套。在jmp 9.0(sas institute inc.,sas campus drive cary,nc)中完成分析。p≤0.05表示变量和测定结果之间的统计学意义的显著相关性。
83.实施例1
‑
定性mri
84.在5周的mr图像中，0.5
‑
mm rf组的6只动物中的5只未显示出明显的退行性改变体征(图2)。该组经改良的pfirrmann分级范围为i至iii(平均值：1.3)。在相同时间点，0.25mm rf组中的所有动物显示出减小的np尺寸，但是核保持均质和高信号(图2)。pfirrmann分级范围为ii至iii(平均值：2.6)。未交联的胶原组显示出更加异质的更小的np，且具有显著增加的af/np比(图2)。af膨出进入核中，使其呈现出沙漏形状。所有动物具有pfirrmann iii级。在未治疗组中的6个试样中的5个显示出黑色ivd，表明其为终末的椎间盘退化(图2)。pfirrmann分级范围为iii至iv(平均值：3.8)。
85.实施例2
‑
np体素计数
86.在1、2和5周时，对照ivd具有140至153体素的平均np体素计数；0.5mm rf组的体素计数为129(sd /
‑
16.3)至140(sd /
‑
22.5)之间。0.25mm rf组显示出更低的值：在第1周时为71体素(sd /
‑
59.14)，在第2和第5周时为57体素(sd /
‑
56.40)。在第2周至第5周之间，两个rf组的np体素计数均保持恒定。
87.未交联胶原组在第1周时显示出46(sd /
‑
25)体素，其在第5周时持续降至14(sd /
‑
15.6)。未治疗组在各时间点均显示出最低的体素计数值，其在5周后降至5(sd /
‑
4.17)(图3a)。总之，与未治疗的椎间盘相比，hdc凝胶注射显著增加体素计数值(p<0.0001)。已证明增加rf浓度(0mm、0.25mm和0.5mm)显著增加np体素计数值(p<0.0001)。
88.实施例3
‑
椎间盘高度测量
89.针穿刺后所有被穿刺的ivd的椎间盘高度均下降，但是在第2周至第5周之间保持恒定(图3b)。0.5
‑
mm rf组保持其初始椎间盘高度的84％(sd /
‑
8.77)的平均值，0.25mm rf组保持77％(sd /
‑
8.72)的平均值。
90.未交联胶原组保持在椎间盘高度的67％(sd /
‑
16.86)，未治疗组保持在椎间盘高度的53％(sd /
‑
13.82)。总之，hdc治疗凝胶显著改善了椎间盘高度指数(p＝0.0264)。
91.实施例4
‑
环缺损
92.针穿刺缺损穿透通过全部af薄层(图4a、4b和5a
‑
5c)，并且在所有动物中5周后仍可见。在对照组和未交联组中，af纤维保持分离并浸润周围的瘢痕组织(图4d)。未见表示环修复过程的肉芽组织、增加的细胞结构或血管形成。0.5
‑
mm rf组显示在af的外三分之一形成了纤维帽，其浸润纤维环，桥接两个缺损末端(图5a
‑
5f)。该纤维帽由包埋于致密胶原基质中的成纤维细胞组成，相比于周围的af和瘢痕组织，所述致密胶原基质被番红
‑
o和阿尔新蓝染色的程度更深。0.25
‑
mm rf组显示出形成了类似的帽(图4a和4b)或者修复af的外部的薄纤维线(图4c)。在两个交联组中，af的内部三分之二未显示出组织修复迹象。
93.实施例5
‑
椎间盘退化
94.在0.5
‑
mm rf组中无明显的退化迹象。ivd显示出平均han退化分级为6.8。在0.25
‑
mm rf组中的ivd显示出具有簇形成的np细胞的减少，且平均han分级达到9.3。
95.在未交联胶原组中的所有ivd均显示出进行性退化改变的指征，仅在椎间盘空隙中可见残余np组织(图2)。穿刺缺损的分支进入af，产生多个裂隙。np组织突出通过开放的缺损(图4e)。椎间盘显示出的han分级为12.8。
96.在未治疗组中的所有动物均显示出严重的退化指征；np完全被结缔组织取代。af显示出破裂和无序(图4f)。若干试样显示出显著的终板损伤(图2)。平均han分级为14.3。
97.实施例6
‑
组织学截面积
98.5周后，被穿刺的ivd近端的健康np的平均np截面积为1.59mm2。0.5
‑
mm rf、0.25
‑
mm rf和未交联胶原组的平均值分别为1.29mm2、0.78mm2和0.78mm2。没有可检测的np组织保持在未治疗ivd的椎间盘空隙中。
99.实施例7
‑
注射的胶原的结果
100.就在注射后，胶原分布进入椎旁空隙，从而覆盖环缺损外部，但是没有迁移进入缺损(图6a
‑
6b)。hdc显示为被阿尔新蓝或番红
‑
o染色较弱的均质的无定形组织。5周后，残余胶原仍显示为均质的和无定形的，并且被宿主成纤维细胞以不同程度浸润。再吸收区域是可见的，表明所注射的材料被宿主细胞重组(图7)。未见炎症或异物反应迹象。
101.实施例1
‑
7的讨论
102.本研究的第一个目的是测试在针穿刺大鼠尾模型中hdc修复环缺损的能力。已发现胶原能够保持af在椎间盘空隙中保留核组织的能力，从而阻止ivd的退行性改变。还观察到了胶原凝胶诱导纤维组织形成的潜能，所述纤维组织部分恢复环的完整性。第二个目的是评估加入rf是否影响af修复的质量。已发现针穿刺后rf改善np尺寸和椎间盘高度保持长达5周或更长时间。
103.rf的有益作用是剂量依赖性的。在不存在rf时，与未治疗的ivd相比，胶原凝胶仅使得np尺寸和椎间盘高度产生微不足道的增加。根据np体素计数和组织学截面积测量结果，0.5
‑
mm rf组保留了其大部分的核组织。保持了84％的平均椎间盘高度。mri分析和组织
stiffness of hydrogels,”mater.lett.74:58
‑
61(2012)，其全部内容通过引用在此并入本技术)。已将若干不同的物质用于交联生物聚合物凝胶(schek等，“genipin
‑
crosslinked fibrin hydrogels as a potential adhesive to augment intervertebral disc annulus repair,”eur.cell.mater.21:373
‑
83(2011)；harriger等，“glutaraldehyde crosslinking of collagen substrates inhibits degradation in skin substitutes grafted to athymic mice,”j.biomed.mater.res.35:137
‑
45(1997)；jarman
‑
smith等，“porcine collagen crosslinking,degradation and its capability for fibroblast adhesion and proliferation,”j.mater.sci.mater.med.15:925
‑
32(2004)，其全部内容通过引用在此并入本技术)。使用rf是有优势的，因为其仅在原位被蓝光活化后交联纤维，从而使胶原凝胶在注射前保持液态。可以证明相比于刚性生物植入物，可注射的生物材料在用于脊柱操作时更具有技术可行性，因为不需要将其锚定在af或椎体上。而且，只有可注射的物质才可以经皮应用。
107.已证实大鼠尾模型适于测试胶原凝胶的不同组成。18号针产生大的缺损，所述大的缺损包含大鼠尾椎间盘中的af的几乎整个后壁。相比于由椎间盘切除术中的环切除术或椎间盘造影的穿刺所诱导的缺损，该缺损成比例地大得多。如果不进行治疗，则高的椎间盘内压结合np的液体稠度导致核组织的迅速挤出。
108.相比于在使用相同模型利用经皮方法的其他研究中所描述，未经治疗的ivd退化得更加迅速(keorochana等，“the effect of needle size inducing degeneration in the rat caudal disc:evaluation using radiograph,magnetic resonance imaging,histology,and immunohistochemistry,”spine j 10:1014
‑
23(2010)，其全部内容通过引用在此并入本技术)。这可能是由于在研究中使用的开放方法，其中从af上切下了椎旁肌肉，从而产生大的组织缺损。
109.尽管已在本文详细地示出和描述了优选的实施方式，但是在不脱离本发明主旨的前提下可以对其进行各种修订、增加、替代等等，这对相关领域的技术人员将是显而易见的，因而将这些认为是在下述权利要求所定义的本发明的范围之内。