复合生物补片及其制备方法及应用与流程

1.本发明涉及医疗技术领域，尤其是涉及一种复合生物补片及其制备方法及应用。


背景技术：

2.人体缺损组织的修复与再生是临床上一直存在的难题。近年来，随着细胞生物学和组织工程技术的不断发展，一种新的修复材料
‑
生物补片逐渐受到人们的关注。生物补片是指来源于同种或异种的生物组织，经脱细胞等处理过程除去组织中含有的各类细胞而完整保存细胞外基质的三维立体结构并能用来修复人体受损软组织的材料。生物补片可通过空间诱导和组织替代作用修复受损组织，具有良好的组织兼容性。胶原属于一种细胞外基质，是具有生物功能的结构蛋白质，占人体蛋白质总量的1/3，是构成皮肤、韧带、软骨、肌腱等结缔组织或器官的主要成分。作为生物医用材料，胶原具有微弱的免疫抗原性、良好的生物降解性、促进细胞存活和生长等优异性能。因此胶原基膜补片广泛应用于硬脑脊膜缺损修复、运动肌腱撕裂修复、疝及腹壁缺损的修复、烧伤整形、口腔膜缺损修复等方面。
3.目前，胶原基补片主要的材料来源包括同种异体材料和异种异体材料，同种异体材料由于材料来源易受限制、容易存在蛋白病毒，并且价格比较昂贵，因此不适宜临床应用。异种异体材料包括猪皮、猪小肠、牛心包膜、牛跟腱等，由于这种天然材料源于猪、牛等组织，资源丰富，成本低，经处理后毒性小、生物相容性良好，因此以此原料制备的生物补片具有广泛的应用前景。但是目前的生物补片存在以下缺点：
①
普遍力学性能不够理想，为了保证补片的力学强度，多采用化学交联的方法进行改性，容易有溶剂残留，无法保证补片的生物相容性和安全性；
③
直接采用动物组织处理后进行修复，如猪皮、心包膜等，贴服性较差，容易发生偏移；
④
不具有适宜的孔隙结构，因此不具有良好的组织再生性。
4.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的第一目的在于提供一种复合生物补片，以解决上述问题中的至少一种。
6.本发明的第二目的在于提供一种复合生物补片的制备方法，该制备方法简单方便，成本低。
7.本发明的第三目的在于提供一种复合生物补片在脑膜修复、脊膜修复、肩袖修复、疝修补、眼科修复、乳房修复、止血修复或口腔修复中的应用。
8.第一方面，本发明提供了一种复合生物补片，包括疏水多孔层、致密层和多孔支架；
9.所述疏水多孔层背向待修补组织一侧，并负载抗感染药物；
10.所述多孔支架面向待修补组织一侧；
11.所述致密层位于疏水多孔层和多孔支架之间。
12.作为进一步技术方案，所述疏水多孔层的制备原料包括疏水性纳米纤维素；
13.优选地，所述疏水性纳米纤维素包括乙基纤维素。
14.作为进一步技术方案，所述疏水多孔层的制备方法包括如下步骤：
15.将疏水性纳米纤维素溶于有机试剂，然后加入抗感染药物，混合后制膜；
16.优选地，所述有机试剂包括六氟异丙醇和/或乙醇；
17.优选地，所述疏水性纳米纤维素与有机试剂的比例为1g:(4
‑
8)ml；
18.优选地，按质量百分比计，所抗感染药物的加入量为疏水性纳米纤维素的5％
‑
10％；
19.优选地，所述制膜的方式包括静电纺丝；
20.优选地，所述疏水多孔层的厚度为0.5
‑
2mm。
21.作为进一步技术方案，所述致密层的制备材料包括乙基纤维素和/或羟丙基甲基纤维素。
22.作为进一步技术方案，所述多孔支架的制备材料包括ⅰ型胶原、纤维素、壳聚糖、透明质酸、明胶、丝素蛋白、淀粉中的至少一种，优选为ⅰ型胶原。
23.作为进一步技术方案，所述多孔支架的制备方法包括如下步骤：
24.将所述ⅰ型胶原溶于酸性溶液中得到胶原溶液，然后进行干燥处理制备得到多孔支架；
25.优选地，所述酸性溶液包括醋酸溶液和/或盐酸溶液，优选为醋酸溶液；
26.优选地，所述醋酸溶液的浓度为0.01
‑
1mol/l，优选为0.02
‑
0.5mol/l；
27.优选地，所述胶原溶液中ⅰ型胶原的浓度为0.1wt％
‑
2.0wt％，优选为0.5wt％
‑
1.5wt％；
28.优选地，所述干燥的方式包括冷冻干燥；
29.优选的，所述冷冻干燥的处理条件为：在温度为
‑
40℃～
‑
10℃条件下处理1
‑
6h，然后在温度为
‑
10℃～0℃条件下处理12～48h，再在22℃～28℃条件下处理1
‑
2h。
30.作为进一步技术方案，所述ⅰ型胶原的制备方法包括如下步骤：
31.a.将动物跟腱除杂、粉碎后进行盐溶液处理；
32.b.将经过a步骤处理的动物跟腱进行酶处理，并去除不溶物质；
33.c.调节b步骤得到的溶液的ph至12
‑
14，添加盐溶液至溶液中盐浓度为2.5
‑
7.5mol/l，得到沉淀；
34.d.将c步骤得到的沉淀依次进行酸性溶液处理，分离和干燥得到ⅰ型胶原；
35.优选地，所述动物跟腱包括牛跟腱、猪跟腱、马跟腱、羊跟腱中的至少一种，优选为牛跟腱；
36.优选地，a步骤中，所述盐溶液包括nacl溶液、nahco3溶液、柠檬酸钠溶液、tris
‑
hcl溶液、tris
‑
base溶液中的至少一种，优选为nacl溶液；
37.优选地，a步骤中，所述盐溶液的浓度为5wt％
‑
25wt％；
38.优选地，a步骤中，所述动物跟腱与盐溶液的质量比为1:(50
‑
100)；
39.优选地，b步骤中，所述酶处理为采用含酶的酸性溶液对动物跟腱进行处理；
40.优选地，b步骤中，所述酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、无花果酶、菠萝酶、木瓜酶、灰链霉分泌酶、枯草杆菌属酶中的至少一种，优选为胃蛋白酶；
41.优选地，b步骤中，所述酸性溶液包括醋酸溶液、柠檬酸溶液、苹果酸溶液、乳酸溶液中的至少一种，优选为醋酸溶液；
42.优选地，b步骤中，所述酸性溶液的浓度为0.25
‑
0.8mol/l；
43.优选地，c步骤中，采用碱溶液调节b步骤得到的溶液的ph，所述碱包括naoh、koh、ca(oh)2中的至少一种，优选为naoh；
44.优选地，c步骤中，调节b步骤得到的溶液的ph至13，添加盐溶液至溶液中盐浓度为4
‑
5mol/l；
45.优选地，d步骤中，所述酸性溶液包括盐酸溶液、醋酸溶液、柠檬酸溶液、磷酸溶液、硫酸溶液中的至少一种，优选为盐酸溶液；
46.优选地，d步骤中，所述酸性溶液的浓度为0.1
‑
10mol/l，优选为2
‑
5mol/l。
47.作为进一步技术方案，所述抗感染药物包括酮洛芬、罗红霉素、阿莫西林或环丙沙星中的至少一种。
48.第二方面，本发明提供了一种复合生物补片的制备方法，包括如下步骤：
49.将溶有乙基纤维素的有机试剂和羟丙基甲基纤维素水溶液混合，然后将混合溶液涂覆于所述疏水多孔层和所述多孔支架之间并压合，再经过加热处理后制备得到复合生物补片；
50.优选地，所述有机试剂包括乙醇；
51.优选地，所述有机试剂中乙基纤维素的浓度为2wt％
‑
5wt％；
52.优选地，所述羟丙基甲基纤维素水溶液的浓度为2wt％
‑
5wt％；
53.优选地，所述溶有乙基纤维素的有机试剂和羟丙基甲基纤维素水溶液混合的体积比为1:(10
‑
15)；
54.优选地，所述压合的压力为0.4
‑
0.8mpa；
55.优选地，所述压合的时间为40
‑
60min；
56.优选地，所述加热处理的温度为110
‑
130℃；
57.优选地，所述加热处理的时间为24
‑
36h；
58.优选地，所述混合溶液涂覆的厚度为0.1
‑
0.5mm；
59.优选地，所述复合生物补片的厚度为2
‑
5mm。
60.第三方面，本发明提供了一种复合生物补片在脑膜修复、脊膜修复、肩袖修复、疝修补、眼科修复、乳房修复、止血修复或口腔修复中的应用。
61.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
62.本发明提供的复合生物补片，包括疏水多孔层、致密层和多孔支架，其中疏水多孔层背向待修补组织一侧，并负载抗感染药物，其疏水性和负载的药物能够相互配合，有助于缓释药物，起到预防和抗感染以及防粘连的作用；多孔支架具有多孔结构，面向待修补组织一侧，有利于细胞的粘附和增长，诱导膜组织再生；疏水多孔层和多孔支架间隔致密层，能够保证产品的尺寸稳定性和机械强度，同时也能够起到屏障的作用。
63.本发明提供的复合生物补片的制备方法简单方便，成本低。
64.本发明提供的复合生物补片能够用于脑膜修复、脊膜修复、肩袖修复、疝修补、眼科修复、乳房修复、止血修复或口腔修复中。
附图说明
65.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体
实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
66.图1为实施例1
‑
3和对比例3的膜补片的药物释放速率图；
67.图2为实施例1的膜补片染色图；
68.图3为对比例3的膜补片染色图。
具体实施方式
69.下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
70.需要说明的是，本发明的复合生物补片可以作为脑膜补片、脊膜补片、肩袖补片、疝补片、眼科补片、乳房补片、止血补片或者口腔修复膜进行使用，本发明中所指的背向待修补组织一侧是指背向脑膜、脊膜、肩袖和口腔膜等其他缺损组织；面向待修补组织一侧是指面向脑膜、脊膜、肩袖和口腔膜等其他缺损组织。
71.第一方面，本发明提供了一种复合生物补片，包括疏水多孔层、致密层和多孔支架；
72.所述疏水多孔层背向待修补组织一侧，并负载抗感染药物；
73.所述多孔支架面向待修补组织一侧；
74.所述致密层位于疏水多孔层和多孔支架之间。
75.本发明提供的复合生物补片，包括疏水多孔层、致密层和多孔支架，其中疏水多孔层背向待修补组织一侧，并负载抗感染药物，其疏水性和负载的药物能够相互配合，有助于缓释药物，起到预防和抗感染以及防粘连的作用；多孔支架具有多孔结构，面向待修补组织一侧，有利于细胞的粘附和增长，诱导膜组织再生；疏水多孔层和多孔支架间隔致密层，能够保证产品的尺寸稳定性和机械强度，同时也能够起到屏障的作用。
76.在一些优选的实施方式中，所述疏水多孔层的制备原料包括但不限于疏水性纳米纤维素，以疏水性纳米纤维素为原料制备疏水多孔层，能够显著提高疏水多孔层的力学性能。
77.优选地，所述疏水性纳米纤维素包括但不限于乙基纤维素。
78.乙基纤维素(ec)是一种不溶于水的纤维素衍生物，分子上羟基被大量乙基取代，而未被取代的羟基通过氢键相连，形成紧密的珊瑚状网络结构，赋予ec极好的机械性质，它的非毒性、疏水性、机械性、热塑性和成膜性在很多领域都有应用价值，如食品、微胶囊化、过滤和医药等。在本发明中，以乙基纤维素为原料制备得到的疏水性纳米纤维素具有良好的机械性能和疏水性，能够起到药物缓释的作用。
79.在一些优选的实施方式中，所述疏水多孔层的制备方法包括如下步骤：
80.将疏水性纳米纤维素溶于有机试剂，然后加入抗感染药物，混合后制膜；
81.优选地，所述有机试剂包括但不限于六氟异丙醇和/或乙醇；
82.优选地，所述疏水性纳米纤维素与有机试剂的比例为1g:(4
‑
8)ml，例如可以为，但不限于1g:4ml、1g:5ml、1g:6ml、1g:7ml或1g:8ml；
83.优选地，按质量百分比计，所抗感染药物的加入量为疏水性纳米纤维素的5％
‑
10％，例如可以为，但不限于5％、6％、7％、8％、9％或10％；
84.优选地，所述制膜的方式包括但不限于静电纺丝，或者本领域技术人员所熟知的其他制膜方式；
85.优选地，所述疏水多孔层的厚度为0.5
‑
2mm，例如可以为，但不限于0.5mm、1mm、1.5mm或2mm。
86.通过对疏水多孔层的制备方法进行进一步优化和调整，使得疏水多孔层具有良好的机械性能，同时能够缓释药物，具有预防和抗感染以及防粘连的作用。
87.在一些优选的实施方式中，所述致密层的制备材料包括但不限于乙基纤维素和/或羟丙基甲基纤维素。羟丙基甲基纤维素具有良好的成膜性、粘合性、抗氧化性、广谱抗菌性和优异阻隔性等优点，以其为原料制备得到的致密层的致密性良好，同时还能够加强与疏水多孔层和多孔支架的连接强度。乙基纤维素具有疏水性，以其为原料制备致密层能够提致密层与疏水多孔层的连接强度。
88.需要说明的是，上述“和/或”是指，致密层的制备材料可以包括乙基纤维素，也可以包括羟丙基甲基纤维素，还可以包括乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。
89.在一些优选的实施方式中，所述多孔支架的制备材料包括但不限于ⅰ型胶原、纤维素、壳聚糖、透明质酸、明胶、丝素蛋白、淀粉中的至少一种，优选为ⅰ型胶原。
90.以ⅰ型胶原为原料制备多孔支架，能够使得多孔支架具有三维多孔结构，更有利于细胞的粘附和增长，诱导膜组织再生。需要说明的是，本发明对于ⅰ型胶原的来源不做具体限制，可以采用市场上购买的ⅰ型胶原或者采用自己制备的ⅰ型胶原。
91.在一些优选的实施方式中，所述多孔支架的制备方法包括如下步骤：
92.将所述ⅰ型胶原溶于酸性溶液中得到胶原溶液，然后进行干燥处理制备得到多孔支架；
93.优选地，所述酸性溶液包括但不限于醋酸溶液和/或盐酸溶液，优选为醋酸溶液；
94.优选地，所述醋酸溶液的浓度为0.01
‑
1mol/l，例如可以为，但不限于0.01mol/l、0.05mol/l、0.1mol/l、0.2mol/l、0.4mol/l、0.6mol/l、0.8mol/l或1mol/l，优选为0.02
‑
0.5mol/l；
95.优选地，所述胶原溶液中ⅰ型胶原的浓度为0.1wt％
‑
2.0wt％，例如可以为，但不限于0.1wt％、0.2wt％、0.5wt％、1.0wt％、1.5wt％或2.0wt％，优选为0.5wt％
‑
1.5wt％；
96.优选地，所述干燥的方式包括但不限于冷冻干燥，或者本领域技术人员所熟知的其他干燥方式；
97.优选的，所述冷冻干燥的处理条件为：在温度为
‑
40℃～
‑
10℃条件下处理1
‑
6h，然后在温度为
‑
10℃～0℃条件下处理12～48h，再在22℃～28℃条件下处理1
‑
2h。
98.优选地，所述冷冻干燥的处理条件为：在温度为
‑
30℃～
‑
20℃条件下处理1
‑
6h，然后在温度为
‑
10℃～0℃条件下处理24～36h，再在22℃～28℃条件下处理1
‑
2h。
99.在本发明中，通过对多孔支架的制备方法进行进一步优化和调整，使得制备得到
的多孔支架具有好的三维多孔结构，更有利于细胞的粘附和增长，诱导膜组织再生。
100.在一些优选的实施方式中，所述ⅰ型胶原的制备方法包括如下步骤：
101.a.将动物跟腱除杂、粉碎后进行盐溶液处理。其中除杂为去除多于的组织、脂肪等杂质；盐溶液处理为去除杂蛋白。制备i型胶原蛋白最合适的原料之一是跟腱，跟腱的纤维几乎都是ⅰ型胶原蛋白、大大简化了纯化ⅰ型胶原蛋白所需的步骤。因此，本发明以动物跟腱原料制备i型胶原蛋白。
102.b.将经过a步骤处理的动物跟腱进行酶处理，并去除不溶物质。其中酶处理为去除其他杂质蛋白；不溶物质主要为大尺寸的跟腱组织，需要去除，另外也可将此部分大颗粒的跟腱重新进行粉碎然后再次进行酶处理以提高原料的利用率。
103.c.调节b步骤得到的溶液的ph至12
‑
14，添加盐溶液至溶液中盐浓度为2.5
‑
7.5mol/l，得到沉淀。采用等电点沉淀法和盐析法以分离得到ⅰ型胶原沉淀，另外，碱性条件能够很好地对病毒进行灭活，能够提高胶原的生物相容性和安全性。
104.d.将c步骤得到的沉淀依次进行酸性溶液处理，分离和干燥得到ⅰ型胶原。将沉淀再次进行溶解，去除不溶性杂质，进一步提高ⅰ型胶原的纯度。
105.优选地，所述动物跟腱包括但不限于牛跟腱、猪跟腱、马跟腱、羊跟腱中的至少一种，优选为牛跟腱；
106.优选地，a步骤中，所述盐溶液包括但不限于nacl溶液、nahco3溶液、柠檬酸钠溶液、tris
‑
hcl溶液、tris
‑
base溶液中的至少一种，优选为nacl溶液；
107.优选地，a步骤中，所述盐溶液的浓度为5wt％
‑
25wt％，例如可以为，但不限于5％、10％、15％、20％或25％；
108.优选地，a步骤中，所述动物跟腱与盐溶液的质量比为1:(50
‑
100)，例如可以为，但不限于1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或1:100；
109.优选地，b步骤中，所述酶处理为采用含酶的酸性溶液对动物跟腱进行处理；
110.优选地，b步骤中，所述酶包括但不限于胃蛋白酶、胰蛋白酶、无花果酶、菠萝酶、木瓜酶、灰链霉分泌酶、枯草杆菌属酶中的至少一种，优选为胃蛋白酶；
111.优选地，b步骤中，所述酸性溶液包括但不限于醋酸溶液、柠檬酸溶液、苹果酸溶液、乳酸溶液中的至少一种，优选为醋酸溶液；
112.优选地，b步骤中，所述酸性溶液的浓度为0.25
‑
0.8mol/l，例如可以为，但不限于0.25mol/l、0.3mol/l、0.4mol/l、0.5mol/l、0.6mol/l、0.7mol/l或0.8mol/l；
113.优选地，c步骤中，采用碱溶液调节b步骤得到的溶液的ph，所述碱包括但不限于naoh、koh、ca(oh)2中的至少一种，优选为naoh；
114.优选地，c步骤中，调节b步骤得到的溶液的ph至13，添加盐溶液至溶液中盐浓度为4
‑
5mol/l，在此条件下，对胶原的分离效果最好。
115.优选地，d步骤中，所述酸性溶液包括但不限于盐酸溶液、醋酸溶液、柠檬酸溶液、磷酸溶液、硫酸溶液中的至少一种，优选为盐酸溶液；
116.优选地，d步骤中，所述酸性溶液的浓度为0.1
‑
10mol/l，例如可以为，但不限于0.1mol/l、0.2mol/l、0.5mol/l、1mol/l、2mol/l、4mol/l、6mol/l、8mol/l或10mol/l，优选为2
‑
5mol/l。
117.本发明的ⅰ型胶原的制备方法具有如下优点：
118.1.以动物跟腱为原料进行胶原的提取，处理过程简单，胶原纯度高；
119.2.提取的胶原纯度很高，达到99％以上，并很好地保持了胶原的三螺旋结构，使其具有低免疫原性；
120.3.高纯胶原是产品优良组织再生性能的基础和保证；
121.4.通过碱处理工艺很好地对病毒进行灭活，使提取的胶原具有良好的生物相容性和安全性。
122.在一些优选的实施方式中，所述抗感染药物包括但不限于酮洛芬、罗红霉素、阿莫西林或环丙沙星中的至少一种，或者本领域技术人员所熟知的其他抗感染药物。
123.第二方面，本发明提供了一种复合生物补片的制备方法，包括如下步骤：
124.将溶有乙基纤维素的有机试剂和羟丙基甲基纤维素水溶液混合，然后将混合溶液涂覆于所述疏水多孔层和所述多孔支架之间并压合，再经过加热处理后制备得到复合生物补片；
125.优选地，所述有机试剂包括但不限于乙醇，或者本领域技术人员所熟知的其他有机试剂；
126.优选地，所述有机试剂中乙基纤维素的浓度为2wt％
‑
5wt％，例如可以为，但不限于2wt％、3wt％、4wt％或5wt％；
127.优选地，所述羟丙基甲基纤维素水溶液的浓度为2wt％
‑
5wt％，例如可以为，但不限于2wt％、3wt％、4wt％或5wt％；
128.优选地，所述溶有乙基纤维素的有机试剂和羟丙基甲基纤维素水溶液混合的体积比为1:(10
‑
15)，例如可以为，但不限于1:10、1:11、1:12、1:13、1:14或1:15；
129.优选地，所述压合的压力为0.4
‑
0.8mpa，例如可以为，但不限于0.4mpa、0.5mpa、0.6mpa、0.7mpa或0.8mpa；
130.优选地，所述压合的时间为40
‑
60min，例如可以为，但不限于40min、45min、50min、55min或60min；
131.优选地，所述加热处理的温度为110
‑
130℃，例如可以为，但不限于110℃、115℃、120℃、125℃或130℃；
132.优选地，所述加热处理的时间为24
‑
36h，例如可以为，但不限于24h、26h、28h、30h、32h、34h或36h；
133.优选地，所述混合溶液涂覆的厚度为0.1
‑
0.5mm，例如可以为，但不限于0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm或0.6mm；
134.优选地，所述复合生物补片的厚度为2
‑
5mm，例如可以为，但不限于2mm、3mm、4mm、5mm或6mm。
135.在本发明中，通过对复合生物补片的制备方法进行进一步优化和调整，进一步提高致密层的致密性以及与疏水多孔层和多孔支架的连接强度。
136.第三方面，本发明提供了一种复合生物补片在脑膜修复、脊膜修复、肩袖修复、疝修补、眼科修复、乳房修复、止血修复或口腔修复中的应用。
137.本发明的复合生物补片具有优异的力学性能、柔韧性高，易贴合于破损处，可免缝合，可有效防止粘连和诱导组织再生；中间连接层与另外两层之间的连接强度好，致密性好，能够防止组织液渗漏，并起到屏障作用；支架层亲水性好，疏水多孔层疏水性好且具有
良好的抗感染及防粘连作用。能够作为脑脊膜补片、肩袖补片、疝补片、眼科补片、乳房补片、止血补片和口腔修复膜进行使用。
138.下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
139.实施例1
140.一种复合生物补片，其制备方法如下：
141.1.疏水多孔层的制备：取一定量的乙基纤维素溶于六氟异丙醇溶剂中，添加比例为1g:6ml，搅拌36h后配制成浓度为9.5％的纺丝液，然后加入抗感染药物酮洛芬，加入比例为乙基纤维素的8％，然后继续搅拌60h，获得含有抗感染药物的纺丝液。将纺丝液装入注射器中，针头连接高压，接收装置为铝箔，纺丝电压为15kv，纺丝速率为0.3ml/h，接受距离为15cm，纺丝时间为3h，获得厚度为1mm的纤维素纳米纤维膜，然后将获得的纳米纤维膜置于真空烘箱中80℃干燥过夜，除去残留溶剂。
142.2.ⅰ型胶原多孔支架的制备：
[0143]ⅰ型胶原的制备：称取一定重量新鲜的牛跟腱材料进行预处理，充分去除掉多余组织、脂肪和其它杂质，将处理后的牛跟腱进行充分粉碎，随后在15％氯化钠盐溶液(牛跟腱与盐溶液质量比：1:75)浸泡6h，用灭菌蒸馏水清洗数次后离心获得预处理的牛跟腱；
[0144]
将处理后的牛跟腱悬浮于酶的醋酸溶液(醋酸浓度0.5mol/l)中进行提取，在提取过程中采用专用的搅拌冷却设备充分提取胶原并维持较低的温度。在搅拌提取1h后离心去除沉淀，保存上清液，随后将去除的沉淀进行再次粉碎和搅拌1h，再次进行离心和去除沉淀，继续重复此过程进行再次提取，再次获得上清液并保存；
[0145]
采用氢氧化钠溶液对获得的上清液进行ph调节至最终ph＝13，然后加入nacl溶液至溶液中nacl浓度为4mol/l，搅拌33h后离心获得沉淀即为高纯胶原半成品；
[0146]
将获得的半成品放入到3mol/l醋酸溶液中进行中和24h，随后对其进行过滤干燥得到高纯度ⅰ型胶原成品(纯度在99％以上)。
[0147]
胶原溶液的制备：采用高纯度的i型胶原溶于0.6mol/l的醋酸溶液，进行强力搅拌24h，获得浓度为1％的均匀的胶原溶液；
[0148]
胶原溶液的冷冻干燥：将获得的胶原溶液进行冷冻干燥。
[0149]
冷冻干燥工艺：首先将胶原溶液放入冷冻室(温度为
‑
30℃～
‑
20℃)进行冷冻3h，随后升高冷冻室温度，使其温度保持在
‑
10℃～0℃之间，保持时间为30h，待冷冻干燥到一定程度后，使冷冻干燥室内的温度逐渐达到室温，保持1.5h，取出即获得具有仿生三维多孔结构的胶原支架材料。
[0150]
3.膜补片的制备：连接层溶液的制备：称取一定量的乙基纤维素溶于无水乙醇溶液中，溶液浓度为3％，同时称取一定量的羟丙基甲基纤维素溶于水中，溶液浓度为3％，接下来取乙基纤维素溶液和羟丙基甲基纤维素溶液进行混合(乙基纤维素溶液和羟丙基甲基纤维素溶液质量比为1:12)，混合后在纤维素纳米纤维膜表面涂覆一层0.3mm厚的混合溶液，然后在其上放置胶原多孔支架，以0.6mpa的压力进行压合50min后放置到真空烘箱中进行热处理(温度：120℃，时间为30h)，获得具有优异力学性能、抗感染性能以及诱导组织再生性良好的膜补片。
[0151]
实施例2
[0152]
一种复合生物补片，其制备方法如下：
[0153]
1.疏水多孔层的制备：取一定量的乙基纤维素溶于溶剂无水乙醇中，添加比例为1g:4ml，搅拌24
‑
48h后配制成浓度为24.1％的纺丝液，然后加入抗感染药物酮洛芬，加入比例为乙基纤维素的5％，然后继续搅拌48h，获得含有抗感染药物的纺丝液。将纺丝液装入注射器中，针头连接高压，接收装置为铝箔，纺丝电压为10kv，纺丝速率为0.1ml/h，接受距离为13cm，纺丝时间为1h，获得厚度为0.5mm的纤维素纳米纤维膜，然后将获得的纳米纤维膜置于真空烘箱中80℃干燥过夜，除去残留溶剂。
[0154]
2.ⅰ型胶原多孔支架的制备：
[0155]ⅰ型胶原的制备方法同实施例1。
[0156]
胶原溶液的制备：采用高纯度的i型胶原溶于0.025mol/l的盐酸溶液，进行强力搅拌24h，获得浓度为0.1％的均匀的胶原溶液；
[0157]
胶原溶液的冷冻干燥：将获得的胶原溶液进行冷冻干燥。
[0158]
冷冻干燥工艺：首先将胶原溶液放入冷冻室(温度为
‑
40℃～
‑
20℃)进行冷冻1h，随后升高冷冻室温度，使其温度保持在
‑
10℃～0℃之间，保持时间为12h，优选为24h，待冷冻干燥到一定程度后，使冷冻干燥室内的温度逐渐达到室温，保持1h，取出即获得具有仿生三维多孔结构的胶原支架材料。
[0159]
3.膜补片的制备：连接层溶液的制备：称取一定量的乙基纤维素溶于无水乙醇溶液中，溶液浓度为2％，同时称取一定量的羟丙基甲基纤维素溶于水中，溶液浓度为2％，接下来取乙基纤维素溶液和羟丙基甲基纤维素溶液进行混合(乙基纤维素溶液和羟丙基甲基纤维素溶液质量比为1:10)，混合后在纤维素纳米纤维膜表面涂覆一层0.1mm厚的混合溶液，然后在其上放置胶原多孔支架，以0.4mpa的压力进行压合40min后放置到真空烘箱中进行热处理(温度：110℃，时间为24h)，获得具有优异力学性能、抗感染性能以及诱导组织再生性良好的膜补片。
[0160]
实施例3
[0161]
一种复合生物补片，其制备方法如下：
[0162]
1.疏水多孔层的制备：取一定量的乙基纤维素溶于溶剂六氟异丙醇溶剂中，添加比例为1g:8ml，搅拌48h后配制成浓度为7.3％的纺丝液，然后加入抗感染药物酮洛芬，加入比例为乙基纤维素的10％，然后继续搅拌72h，获得含有抗感染药物的纺丝液。将纺丝液装入注射器中，针头连接高压，接收装置为铝箔，纺丝电压为20kv，纺丝速率为0.5ml/h，接受距离为20cm，纺丝时间为4h，获得厚度为2mm的纤维素纳米纤维膜，然后将获得的纳米纤维膜置于真空烘箱中80℃干燥过夜，除去残留溶剂。
[0163]
2.ⅰ型胶原多孔支架的制备：
[0164]ⅰ型胶原的制备方法同实施例1。
[0165]
胶原溶液的制备：采用高纯度的i型胶原溶于1mol/l的醋酸溶液，进行强力搅拌24h，获得浓度为2.0％的均匀的胶原溶液，然后对胶原溶液进行抽真空处理，充分去除溶液中的气泡；
[0166]
胶原溶液的冷冻干燥：将获得的胶原溶液进行冷冻干燥。
[0167]
冷冻干燥工艺：首先将胶原溶液放入冷冻室(温度为
‑
20℃～
‑
10℃)进行冷冻6h，随后升高冷冻室温度，使其温度保持在
‑
10℃～0℃之间，保持时间为48h，优选为36h，待冷
冻干燥到一定程度后，使冷冻干燥室内的温度逐渐达到室温，保持2h，取出即获得具有仿生三维多孔结构的胶原支架材料。
[0168]
3.膜补片的制备：连接层溶液的制备：称取一定量的乙基纤维素溶于无水乙醇溶液中，溶液浓度为5％，同时称取一定量的羟丙基甲基纤维素溶于水中，溶液浓度为5％，接下来取乙基纤维素溶液和羟丙基甲基纤维素溶液进行混合(乙基纤维素溶液和羟丙基甲基纤维素溶液质量比为1:15)，混合后在纤维素纳米纤维膜表面涂覆一层0.5mm厚的混合溶液，然后在其上放置胶原多孔支架，以0.8mpa的压力进行压合60min后放置到真空烘箱中进行热处理(温度：130℃，时间为36h)，获得具有优异力学性能、抗感染性能以及诱导组织再生性良好的膜补片。
[0169]
对比例1
[0170]
一种生物补片，与实施例1的区别在于仅进行i型胶原多孔支架的制备，并将制备得到的多孔支架以0.6mpa的压力进行压合50min后放置到真空烘箱中进行热处理(温度：120℃，时间为30h)，获得膜补片。
[0171]
对比例2
[0172]
一种复合生物补片，与实施例1的区别在于，疏水多孔层不负载抗炎药物。
[0173]
对比例3
[0174]
一种复合生物补片，与实施例1的区别在于，将疏水多孔层替换为亲水性纳米纤维素多孔层，亲水性纳米纤维素多空层的制备方法如下：
[0175]
取一定量的醋酸纤维素溶于丙酮和n,n
‑
二甲基乙酰胺的混合溶剂(丙酮和n,n
‑
二甲基乙酰胺的体积比为1:1)中，添加比例为1g:8ml，搅拌36h后配制成浓度为12.6％的纺丝液，然后加入抗感染药物酮洛芬，加入比例为乙基纤维素的8％，然后继续搅拌60h，获得含有抗感染药物的纺丝液。将纺丝液装入注射器中，针头连接高压，接收装置为铝箔，纺丝电压为15kv，纺丝速率为0.3ml/h，接受距离为15cm，纺丝时间为3h，获得厚度为1mm的纤维素纳米纤维膜，然后将获得的纳米纤维膜置于真空烘箱中80℃干燥过夜，除去残留溶剂。
[0176]
试验例1
[0177]
1.药物释放速率：取200mg的实施例1、2、3和对比例3膜补片浸入50ml ph值为7的pbs缓冲液中，置于摇床上，分别在1h、5h、24h、48h、72h、120h、168h、336h取出5ml溶液，同时补充相应体积的pbs缓冲液，然后采用紫外可见分光光度计测定取出溶液在药物相应的紫外波长处的吸光度。然后制备不同浓度的药物溶液，进行相应浓度下的吸光度测试，根据测试结果绘制药物浓度
‑
吸光度标准曲线，根据标准曲线计算药物的体外累计释放率，试验结果如图1所示。
[0178]
根据累计释放率测试结果发现，由于抗感染药物在疏水多孔层中，因此实施例膜补片中药物为缓慢释放，基本在第7天累计释放率达到最高并且达到平衡，最高累计释放率可达60％左右；而对于对比例3中的膜补片，多孔层为亲水性，因此最初释放速率较快，在48h之内就达到最高释放率并已平衡，累计释放率达到80％左右，因此说明多孔层的疏水性有利于药物的缓慢释放，从而达到持续抗感染的目的。
[0179]
2.力学性能：参照gbt3923.1
‑
2013中的方法，将样品裁成20mm宽的样条进行样品的拉伸试验，试验结果如下表所示。
[0180] 拉伸强度(mpa)断裂伸长率(％)
实施例15.35
±
1.2118.35
±
2.33实施例24.76
±
2.0115.67
±
2.51实施例35.93
±
1.8822.17
±
1.89对比例11.02
±
0.587.23
±
1.93对比例25.23
±
2.1017.79
±
2.45对比例35.12
±
2.6917.98
±
3.01
[0181]
根据测试结果发现，中间致密层和疏水多孔层的制备对膜补片的力学性能影响较大，随着致密层和疏水多孔层的引入可明显提高膜补片的力学性能，并且中间致密层中羟丙基纤维素溶液的比例越大，膜补片的抗拉强度越高，因此说明与普通胶原支架相比，制备的膜补片具有优异的力学性能。
[0182]
3.诱导组织再生性及防粘连性：
[0183]
以新西兰白兔为模型，在硬膜缺损部位切开长4cm的伤口，然后植入实施例1和对比例3提供的膜补片，在6个月时取相应的组织标本进行he染色，观察组织再生及粘连情况，实施例1和对比例3的结果分别如图2和图3所示。其中a所指为脑组织，箭头所指为膜补片。
[0184]
根据图片可以看出6个月后，实施例1植入的补片发现已有新的硬脑膜组织生长，替代了最初的植入物，并且硬脑膜缺损部位与脑组织无明显粘连，未见明显炎症反应。对比例3植入的补片虽也有新的硬膜组织生长，但是由于多孔层亲水性很好，易发生粘连，使新生组织紧密连接于脑组织上，容易造成肿瘤等其他疾病。
[0185]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。