杀昆虫蛋白的制作方法

技术特征：
no:17的氨基酸1至氨基酸363，并且所述c末端区域包含seq id no:2的氨基酸346至氨基酸488。5.如权利要求4所述的嵌合杀昆虫蛋白，其中所述嵌合杀昆虫蛋白包含seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:18、seq id no:19或seq id no:22。6.如权利要求1
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5中任一项所述的嵌合杀昆虫蛋白，其中所述昆虫有害生物是鞘翅目昆虫有害生物。7.如权利要求6所述的嵌合杀昆虫蛋白，其中所述鞘翅目昆虫有害生物是根萤叶甲属昆虫有害生物。8.如权利要求7所述的嵌合杀昆虫蛋白，其中所述根萤叶甲属昆虫有害生物选自由以下组成的组：玉米根萤叶甲(diabrotica virgifera virgifera)、巴氏根萤叶甲(diabrotica barberi)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(diabrotica undecimpunctata howardi)和玉蜀黍根萤叶甲(diabrotica zeae)。9.一种核酸分子，所述核酸分子包含(a)编码如权利要求1至8中任一项所述的嵌合杀昆虫蛋白的核酸序列；或者(b)(a)的经密码子优化用于在转基因生物中表达的核苷酸序列。10.如权利要求9所述的核酸分子，其中所述转基因生物是细菌或植物。11.如权利要求10所述的核酸分子，其中所述细菌在芽孢杆菌属、梭菌属、致病杆菌属、发光杆菌属、巴斯德氏芽菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、克雷伯菌属、沙门氏菌属、巴氏杆菌属、黄单胞菌属、链霉菌属、根瘤菌属、红假单胞菌属、嗜甲基菌属、农杆菌属、醋杆菌属、乳杆菌属、节杆菌属、固氮菌属、明串珠菌属或产碱杆菌属中。12.如权利要求10所述的核酸分子，其中所述植物是双子叶植物或单子叶植物。13.如权利要求12所述的核酸分子，其中(a)所述双子叶植物选自由以下组成的组：大豆、向日葵、番茄、芸苔属作物、棉花、甜菜以及烟草；或者(b)所述单子叶植物选自由以下组成的组：大麦、玉蜀黍、燕麦、稻、高粱、甘蔗和小麦。14.如权利要求9所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含seq id no:11
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16、20或21中的任何一个。15.一种嵌合基因，所述嵌合基因包含可操作地连接至如权利要求9
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14中任一项所述的核酸分子的异源启动子。16.如权利要求15所述的嵌合基因，其中所述异源启动子是植物可表达型启动子。17.如权利要求16所述的嵌合基因，其中所述植物可表达型启动子选自下组启动子，该组由以下组成：泛素、夜香树属黄病毒、玉米trpa、osmads 6、玉蜀黍h3组蛋白、噬菌体t3基因9 5'utr、玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脱氢酶1、玉米捕光复合物、玉米热休克蛋白、玉蜀黍mtl、豌豆小亚基rubp羧化酶、稻肌动蛋白、稻亲环蛋白、ti质粒甘露碱合酶、ti质粒胭脂碱合酶、矮牵牛查尔酮异构酶、豆类富甘氨酸蛋白1、马铃薯糖蛋白、凝集素、camv 35s以及s
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e9小亚基rubp羧化酶启动子。18.如权利要求15所述的嵌合基因，其中所述昆虫有害生物是鞘翅目昆虫有害生物。19.如权利要求18所述的嵌合基因，其中所述鞘翅目昆虫有害生物是根萤叶甲属昆虫有害生物。
20.如权利要求19所述的嵌合基因，其中所述根萤叶甲属昆虫有害生物选自由以下组成的组：玉米根萤叶甲、巴氏根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲食根亚种和玉蜀黍根萤叶甲。21.如权利要求15所述的嵌合基因，其中所述转基因生物是细菌或植物。22.一种重组载体，所述重组载体包含如权利要求15所述的嵌合基因。23.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求22所述的重组载体，其中所述宿主细胞是细菌细胞或植物细胞。24.如权利要求23所述的转基因细菌细胞，其中所述细菌细胞在芽孢杆菌属、梭菌属、致病杆菌属、发光杆菌属、巴斯德氏芽菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、克雷伯菌属、沙门氏菌属、巴氏杆菌属、黄单胞菌属、链霉菌属、根瘤菌属、红假单胞菌属、嗜甲基菌属、农杆菌属、醋杆菌属、乳杆菌属、节杆菌属、固氮菌属、明串珠菌属或产碱杆菌属中。25.如权利要求24所述的转基因芽孢杆菌属细胞，其中所述芽孢杆菌属细胞是苏云金芽孢杆菌细胞。26.如权利要求23所述的转基因植物细胞，其中所述植物细胞是双子叶植物细胞或单子叶植物细胞。27.如权利要求26所述的转基因植物细胞，其中(a)所述双子叶植物细胞选自由以下组成的组：大豆细胞、向日葵细胞、番茄细胞、芸苔属作物细胞、棉花细胞、甜菜细胞以及烟草细胞；或(b)所述单子叶植物细胞选自由以下组成的组：大麦细胞、玉蜀黍细胞、燕麦细胞、稻细胞、高粱细胞、甘蔗细胞以及小麦细胞。28.一种转基因植物或植物部分，所述转基因植物或植物部分包含如权利要求27所述的转基因植物细胞。29.如权利要求28所述的转基因植物或植物部分，所述转基因植物或植物部分是转基因玉蜀黍植物或植物部分。30.一种杀昆虫组合物，所述杀昆虫组合物包含如权利要求1至8中任一项所述的嵌合杀昆虫蛋白以及农业上可接受的载剂。31.如权利要求30所述的组合物，其中所述农业上可接受的载剂选自由以下组成的组：粉剂、尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体以及溶液。32.如权利要求31所述的组合物，其中所述组合物通过脱水、冷冻干燥、均化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩苏云金芽孢杆菌菌株的培养物而制备。33.如权利要求32所述的组合物，所述组合物包含按重量计从约1％至约99％的所述杀昆虫蛋白。34.如权利要求30
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33中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含第二杀有害生物剂。35.如权利要求34所述的组合物，其中所述第二杀有害生物剂是生物剂或化学剂。36.如权利要求35所述的组合物，其中(a)所述生物剂是或衍生自苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白、蜡样芽孢杆菌杀昆虫蛋白、致病杆菌属杀昆虫蛋白、光杆菌属杀昆虫蛋白、侧孢短芽孢杆菌杀昆虫蛋白、球形赖氨酸芽胞杆菌杀昆虫蛋白、色杆菌属杀昆虫蛋白、噬虫霉耶尔森菌杀昆虫蛋白、乳状芽孢杆菌杀昆虫蛋白、或梭菌属杀昆虫蛋白；(b)所述生物剂是或衍生自dsrna、cry蛋白、vip蛋白、马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α
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淀粉酶抑制
剂、成孔蛋白、凝集素、工程化抗体或抗体片段、或几丁质酶；(c)所述化学剂是氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、有机磷酸酯、friprole、新烟碱、有机氯化物、沙蚕毒素或其组合；或者(d)所述化学剂包含选自下组的活性成分，该组由以下组成：克百威、胺甲萘、灭多虫、联苯菊酯、七氟菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、λ
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氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、氯氧磷、乐果、灭线磷、马拉硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、特丁磷、叔丁嘧啶磷、氟虫腈、啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉、噻虫嗪、硫丹、杀虫磺及其组合。37.一种用于产生杀昆虫蛋白的方法，所述方法包括在如权利要求23所述的宿主细胞产生所述杀昆虫蛋白的条件下培养所述宿主细胞或包含所述宿主细胞的生物。38.一种产生与对照植物或植物部分相比具有增强的昆虫抗性的转基因植物或植物部分的方法，所述方法包括：(a)向植物或植物部分中引入如权利要求15所述的嵌合基因，其中所述杀昆虫蛋白在所述植物或植物部分中表达，从而产生具有增强的昆虫抗性的植物或植物部分。39.如权利要求38所述的方法，其中所述引入步骤通过以下实现：(a)转化所述植物或植物部分；或者(b)使包含所述嵌合基因的第一植物与不同的第二植物杂交。40.一种控制昆虫有害生物的方法，所述方法包括将有效量的如权利要求1
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8中任一项所述的嵌合杀昆虫蛋白递送至所述昆虫有害生物或其环境。41.如权利要求40所述的方法，其中所述杀昆虫蛋白通过转基因植物或通过局部施用包含所述杀昆虫蛋白的杀昆虫组合物递送。42.如权利要求41所述的方法，其中所述转基因植物或所述杀昆虫组合物包含不同于所述杀昆虫蛋白的第二杀昆虫剂。43.如权利要求42所述的方法，其中所述第二杀昆虫剂是蛋白质、dsrna或化学品。44.如权利要求43所述的方法，其中(a)所述蛋白质选自由以下组成的组：cry蛋白、vip蛋白、马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α
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淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、凝集素、工程化抗体或抗体片段、或几丁质酶；(b)所述化学品是氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、有机磷酸酯、friprole、新烟碱、有机氯化物、沙蚕毒素或其组合；或(c)所述化学品包含选自下组的活性成分，该组由以下组成：克百威、胺甲萘、灭多虫、联苯菊酯、七氟菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、λ
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氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、氯氧磷、乐果、灭线磷、马拉硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、特丁磷、叔丁嘧啶磷、氟虫腈、啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉、噻虫嗪、硫丹、杀虫磺及其组合。45.如权利要求40
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44中任一项所述的方法，其中所述昆虫有害生物是鞘翅目昆虫有害生物。46.如权利要求45所述的方法，其中所述鞘翅目昆虫有害生物是根萤叶甲属物种。47.如权利要求46所述的方法，其中所述根萤叶甲属物种选自由以下组成的组：玉米根萤叶甲、巴氏根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲食根亚种和玉蜀黍根萤叶甲。48.一种降低根萤叶甲属昆虫群体对如权利要求15所述的杀昆虫蛋白的抗性发展的方法，所述方法包括在由所述根萤叶甲属昆虫群体摄食的转基因植物中表达所述杀昆虫蛋白和干扰rna分子，所述干扰rna分子抑制幼虫和成虫根萤叶甲属昆虫中靶基因的表达，从而使所述根萤叶甲属昆虫群体中的抗性发展与仅暴露于所述杀昆虫蛋白的根萤叶甲属昆虫群体相比降低。
49.一种向玉米种植者提供控制玉米作物中根萤叶甲属昆虫有害生物群体的手段的方法，所述方法包括(a)向所述种植者出售或提供包含如权利要求8所述的核酸分子的转基因玉米种子；和(b)向所述种植者宣传所述转基因玉米种子产生控制根萤叶甲属有害生物群体的转基因玉米植物。50.一种制备嵌合杀昆虫蛋白的方法，所述嵌合杀昆虫蛋白包括以n末端至c末端方向融合(a)n末端区域，其包含与以下的氨基酸1至氨基酸338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351或352对应的氨基酸序列：(i)seq id no:1或与seq id no:1具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列；或(ii)seq id no:2或与seq id no:2具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列；或(iii)seq id no:3或与seq id no:3具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列；或(iv)seq id no:4或与seq id no:4具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列，融合至(b)c末端区域，其包含与以下的氨基酸339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352或353到氨基酸488、489或490对应的氨基酸序列：(i)seq id no:1或与seq id no:1具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列；或(ii)seq id no:2或与seq id no:2具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列；或(iii)seq id no:3或与seq id no:3具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列；或c)n末端区域，其包含与seq id no:17的氨基酸1至约氨基酸363对应的氨基酸序列，融合至(i)c末端区域，其包含与seq id no:1的约氨基酸347至约氨基酸489对应的氨基酸序列，或与seq id no:1具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列；或(ii)c末端区域，其包含与seq id no:2的约氨基酸346至约氨基酸488对应的氨基酸序列，或与seq id no:2具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列。51.如权利要求50所述的方法，其中(a)所述n末端区域包含与seq id no:1的氨基酸1至氨基酸345对应的氨基酸序列，并且所述c末端区域包含与seq id no:2的氨基酸346至氨基酸488对应的氨基酸序列；或(b)所述n末端区域包含与seq id no:2的氨基酸1至氨基酸345对应的氨基酸序列，并且所述c末端区域包含与seq id no:1的氨基酸346至氨基酸489对应的氨基酸序列；或(c)所述n末端区域包含与seq id no:4的氨基酸1至氨基酸346对应的氨基酸序列，并且所述c末端区域包含与seq id no:1的氨基酸346至氨基酸489对应的氨基酸序列；或(d)所述n末端区域包含与seq id no:4的氨基酸1至氨基酸346对应的氨基酸序列，并且所述c末端区域包含与seq id no:2的氨基酸346至氨基酸488对应的氨基酸序列；或(e)所述n末端区域包含与seq id no:17的氨基酸1至氨基酸363对应的氨基酸序列，并且所述c末端区域包含与seq id no:1的氨基酸347至氨基酸489对应的氨基酸序列，或(f)所述n末端区域包含与seq id no:17的氨基酸1至氨基酸363对应的氨基酸序列，并且所述c末端区域包含与seq id no:2的氨基酸346至氨基酸488对应的氨基酸序列。52.如权利要求51所述的方法，其中(a)所述n末端区域包含seq id no:1的氨基酸1至氨基酸345，并且所述c末端区域包含seq id no:2的氨基酸346至氨基酸488；或(b)所述n末端区域包含seq id no:2的氨基酸1至氨基酸345，并且所述c末端区域包含seq id no:1的氨基酸346至氨基酸489；或(c)所述n末端区域包含seq id no:4的氨基酸1至氨基酸346，并且所述c末端区域包含seq id no:1的氨基酸346至氨基酸489；或(d)所述n末端区域包含seq id no:4的氨基酸1至氨基酸346，并且所述c末端区域包含seq id no:2的氨基酸346至
氨基酸488；或(e)所述n末端区域包含seq id no:17的氨基酸1至氨基酸363，并且所述c末端区域包含seq id no:1的氨基酸347至氨基酸489，或(f)所述n末端区域包含seq id no:17的氨基酸1至氨基酸363，并且所述c末端区域包含seq id no:2的氨基酸346至氨基酸488。53.如权利要求52所述的方法，其中所述嵌合杀昆虫蛋白包含seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:18、seq id no:19或seq id no:22。

技术总结
披露了用于控制植物有害生物的组合物和方法。特别是，提供了对至少鞘翅目昆虫有害生物具有毒性的新颖嵌合杀昆虫蛋白。还提供了编码所述新颖杀昆虫蛋白的核酸分子。还披露了制备所述杀昆虫蛋白的方法和使用所述杀昆虫蛋白以及编码本发明的杀昆虫蛋白的核酸的方法，例如，在转基因植物中以赋予免于昆虫损害的保护。护。


技术研发人员：C
受保护的技术使用者：先正达参股股份有限公司
技术研发日：2019.10.18
技术公布日：2021/11/19