FBXL2激活剂在制备治疗EGFR驱动的肺癌的药物中的用途的制作方法

fbxl2激活剂在制备治疗egfr驱动的肺癌的药物中的用途
技术领域
1.本发明属于医药领域，具体涉及fbxl2激活剂在制备egfr驱动的癌症中的用途。


背景技术：

2.肺癌是全世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，肺癌可分为非小细胞肺癌(nsclc)和小细胞肺癌(sclc)，非小细胞肺癌占肺癌的85％左右。非小细胞肺癌具有发病隐匿、恶性程度较高、难以早期发现、易复发转移等特点，导致非小细胞肺癌预后非常不好，患者生存率低，生存期短。
3.非小细胞肺癌的病理病机非常复杂，根据发病位置的不同可以分为肺腺癌、肺鳞癌、大细胞癌，根据发病机制不同可以分为很多不同的类型，比如常见的信号通路包括：人表皮生长因子受体2(her2)、表皮生长因子受体(egfr)、fms样的酪氨酸激酶3(flt3)、血小板衍生生长因子受体(pdgfr)、成纤维细胞生长因子受体(fgfr)等等。根据发病机理的不同，给予的治疗药物不同。
4.表皮生长因子受体(egfr)是肺癌最重要的驱动基因之一，egfr可通过信号转导通路调节肿瘤细胞的周期，促进肿瘤细胞增殖，诱导血管生成，促进肿瘤的扩散及转移，同时可降低细胞毒性药物对肿瘤细胞的杀伤作用，从而导致肿瘤的不断生长以及转移。具体地，egfr的活化包括egfr受体与配体结合，激活受体后egfr受体发生二聚化，胞内区酪氨酸激酶相互磷酸化后，磷酸化的酪氨酸部位与胞内的信号传导蛋白结合，形成信号传导蛋白复合物，同时信号传导蛋白被激活，持续活化的egfr通路将向肿瘤细胞内传递生长、增殖和抗凋亡信号。因此，以egfr为靶点可以治疗egfr驱动的非小细胞肺癌。
5.egfr受体酪氨酸激酶抑制剂(egfr
‑
tkis)，是靶向于egfr的药物。其通过选择性结合细胞内酪氨酸激酶区，竞争性抑制了egfr与atp的结合，抑制egfr激酶活性，从而抑制信号转导通路的最终生物学效应，达到治疗egfr驱动的非小细胞肺癌的目的。egfr
‑
tkis包括第一代、第二代和第三代egfr
‑
tkis。第一代酪氨酸激酶抑制剂有吉非替尼(gefitinib)，厄洛替尼(erlotinib)和拉帕替尼(lapatinib)等；为了克服第一代egfr
‑
tkis的耐药性，制药公司开发了第二代egfr
‑
tkis包括阿法替尼(afatinib)，达可替尼(dacomitinib)，凡德他尼(vandetanib)，来那替尼(neratinib)等；第三代egfr
‑
tkis包括奥希替尼(osimertinib)，rociletinib，olmutinib等。
6.egfr
‑
tkis显著地改善了晚期患者的总生存期(overallsurvival，os)和生存质量，但几乎所有患者在接受治疗的同时均出现了耐药。其中，第一代egfr
‑
tki药物包括吉非替尼、厄洛替尼，患者接受治疗后平均10个月左右会出现耐药，这与egfr基因第20号外显子的密码子790位苏氨酸突变为甲硫氨酸(t790m)密切相关，t790m突变主要是通过增加atp对egfr活性位点的亲和力而引起了耐药性，使其在临床应用上受限；第二代不可逆抑制剂阿法替尼(afatinib)和达可替尼(dacotinib)通过亲电麦克加成受体与靠近egfr
‑
atp结合位点的半胱氨酸残基(cys797)发生共价反应，克服了因t790m突变产生的耐药性，但是第二代egfr
‑
tki抑制剂缺乏对野生型egfr的选择性，具有较严重的皮疹和胃肠道不良反应，导致
其治疗窗狭窄而限制临床应用；而第三代egfr
‑
tkis(以奥希替尼为代表)为高度选择性t790m突变小分子抑制剂，但是最新发现使用奥希替尼会出现c797s突变。
7.因此，需要进一步研发新的药物，解决目前egfr
‑
tkis耐药的问题，治疗egfr驱动的非小细胞肺癌。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供治疗egfr驱动的癌症的药物以及降低肺癌耐药的药物。
9.本发明首先提供了fbxl2激活剂在制备egfr抑制剂类药物中的用途。
10.本发明还提供了fbxl2激活剂在制备治疗egfr驱动的癌症的药物中的用途。
11.进一步地，所述药物是治疗egfr驱动的肺癌、食管癌、头颈癌、神经胶质瘤或结直肠癌的药物。
12.进一步地，所述药物是治疗egfr驱动的非小细胞肺癌的药物。
13.进一步地，所述药物是治疗耐药性非小细胞肺癌的药物。
14.进一步地，所述药物是治疗存在egfrt790m突变、l858r突变和/或c797s突变的耐药性非小细胞肺癌的药物。
15.优选地，所述fbxl2激活剂是提高机体fbxl2含量的物质，比如，可以表达fbxl2的重组质粒；或者是激活fbxl2活性的物质，比如nebivolol。
16.本发明还提供了一种治疗egfr驱动的癌症的药物，所述药物是以fbxl2激活剂为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
17.本发明还提供了检测肺组织fbxl2表达水平的试剂在制备肺癌筛查试剂中的用途。
18.其中，所述试剂为酶联免疫吸附试验用试剂、酶联免疫分析试剂、western blot检测方法用试剂或蛋白芯片检测方法用试剂。
19.术语解释：
20.egfr抑制剂类药物：是指能够抑制egfr活性或表达水平的药物，可以用于治疗egfr信号通路异常激活的所有疾病，比如，癌症。
21.egfr驱动的癌症：是指egfr信号通路异常激活的癌症。egfr驱动的癌症包括多种癌症，例如egfr驱动的非小细胞肺癌，egfr驱动的食管癌，egfr驱动的头颈癌等。
22.存在egfrt790m突变、l858r突变和/或c797s突变的耐药性非小细胞肺癌：是指非小细胞肺癌细胞中的egfr存在t790m突变、l858r突变和c797s突变中的任意一种或者任意多种；其中，t790m突变是指egfr蛋白第790位氨基酸从苏氨酸(t)突变为蛋氨酸(m)；l858r突变是指egfr蛋白第858个氨基酸从亮氨酸(l)突变为精氨酸(r)；c797s突变是指egfr蛋白第797个氨基酸从半胱氨酸(c)突变为丝氨酸(s)。
23.降低egfr驱动的癌症的耐药性：是指提高癌症对药物的敏感型。
24.增敏剂：能提高癌症对药物敏感型的药物。
25.fbxl2(f
‑
boxandleucinerichrepeatprotein2)，nm_012157，f
‑
框亮氨酸丰富重复蛋白。
26.fbxl2激活剂：是指能提高机体中fbxl2e3泛素化酶活性的任何物质，包括直接提高fbxl2含量的物质，如提升fbxl2表达水平的物质，还包括激活fbxl2e3泛素化酶活性的物
质。
27.nebivolol：中文名奈必洛尔，cas号:118457
‑
14
‑
0，分子式:c
22
h
25
f2no4分子量:405.43，结构式为
28.grp94，即葡萄糖调节蛋白94，又叫做内质网蛋白99。
29.grp94抑制剂：是指能降低机体中grp94的atpase活性的任何物质，包括直接降低grp94含量的物质，如降低grp94表达水平的物质，还包括抑制grp94活性的物质。
30.ganetespib：是一种热休克蛋白90(hsp90)抑制剂，cas号：888216
‑
25
‑
9。分子式：c
20
h
20
n4o3。结构式如下：
[0031][0032]
erlotinib：厄洛替尼，第一代egfr受体酪氨酸激酶抑制剂
[0033]
gefitinib：吉非替尼，第一代egfr受体酪氨酸激酶抑制剂。
[0034]
osimertinib：奥希替尼，第三代egfr受体酪氨酸激酶抑制剂。
[0035]
本发明首次发现了fbxl2可以作用于egfr，并能有效抑制egfr进而达到干预egfr驱动的癌症的目的，为临床治疗egfr驱动的癌症(尤其是非小细胞肺癌)提供了一种新的选择；fbxl2激动剂还可以有效抑制egfr驱动的癌症的耐药，对于目前临床出现的t790m突变和/或c797s突变型耐药性非小细胞肺癌均有良好的疗效，其可以与现有的egfr受体酪氨酸激酶抑制剂联合使用以治疗耐药性非小细胞肺癌。
[0036]
本发明还发现fbxl2的低表达与egfr的高表达相关，fbxl2表达低，则患非小细胞肺癌的风险更大，同时患者预后也更差，因此可以通过检测待检样本肺组织中的fbxl2的表达水平和/或grp94的表达水平，预测其患癌风险以及预后好坏。
[0037]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0038]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0039]
图1fbxl2以egf非依赖性方式靶向egfr进行多泛素和蛋白酶体介导的降解
[0040]
(a)在h1299(野生型egfr)、pc
‑
9(egfr
19del
)或h1975(egfr
l858r/t790m
)细胞中稳定表达针对fbxl2(shfbxl2
‑
#1或shfbxl2
‑
#2)或gfp的shrnas，然后进行western blot分析；
[0041]
(b)稳定表达ha
‑
fbxl2的pc
‑
9细胞，在无血清培养基中培养12小时，然后用或者不用100ng/ml egf处理10分钟，然后收集细胞进行western blot分析；
[0042]
(c
‑
d)稳定表达空载或ha
‑
fbxl2的h1975细胞，在有血清(10％)或无血清的情况下生长12小时，然后用50μg/ml的放线菌酮(chx)在指定的时间间隔内处理。收集细胞裂解液进行western blot分析，并对egfr蛋白水平进行了定量分析，绘制蛋白半衰期的曲线图；
[0043]
(e)稳定表达ha
‑
fbxl2的h292或h1975细胞，利用20μm的mg132(中文名称:蛋白酶体抑制剂；cas号:133407
‑
82
‑
6；分子式:c
26
h
41
n3o5)处理6小时，然后进行western blot分析；
[0044]
(f)将fbxl2与空载对照质粒、野生型ha
‑
egfr、ha
‑
egfr
l858r
或ha
‑
egfr
t790m
表达质粒共转染hek293t细胞，然后细胞培养过夜，利用20μmmg132处理细胞4小时，进行ip(免疫沉淀)
‑
western分析；
[0045]
(g)稳定表达flag
‑
egfr的h1299细胞，利用20μm的mg132处理4小时，进行ip
‑
western分析；
[0046]
(h)用mg132处理h1975细胞4小时，对内源性fbxl2蛋白用fbxl2抗体或者正常兔igg特异性抗体进行免疫沉淀，然后用western blot检测fbxl2和egfr；
[0047]
(i)在稳定表达ha
‑
fbxl2的h1299细胞中，利用mg132处理4小时，然后收集细胞进行ip
‑
western分析；
[0048]
(j)将flag
‑
egfr、fbxl2或野生型ha
‑
ubiquitin、lys48或lys63突变表达质粒共转染hek293t细胞。细胞培养过夜，用mg132处理4小时，然后进行ip
‑
western分析；
[0049]
(k)在体外泛素化试验中，共转染flag
‑
egfr表达质粒与ha
‑
fbxl2或ha
‑
fbxl2
△
f
表达质粒到hek293t细胞中。细胞培养过夜，用mg132处理4小时，免疫沉淀的ha
‑
fbxl2或ha
‑
fbxl2
△
f
蛋白，添加到由重组e1和e2s、atp组成的反应混合液中，添加或不添加泛素(ub)和醛泛素，反应混合物用于免疫印迹分析。
[0050]
图2fbxl2与egfr的激酶结构域相互作用，进而导致egfr蛋白降解
[0051]
(a)本研究构建的egfr缺失突变体的示意图；
[0052]
(b)fbxl2表达质粒和flag
‑
egfr表达质粒共转染hek293t细胞，细胞培养过夜后，用20μm mg132处理4小时，然后进行ip
‑
western分析；
[0053]
(c)用bli法测定重组fbxl2/skp1蛋白与egfr激酶的亲和力，用k
d
值表示；
[0054]
(d)本研究中使用的fbxl2缺失突变体的示意图；
[0055]
(e)将flag
‑
egfr与ha
‑
fbxl2表达质粒共转染hek293t细胞。细胞培养过夜后，利用20μm mg132处理4小时，然后进行ip
‑
western分析；
[0056]
(f)对稳定表达vector空载、ha
‑
fbxl2或ha
‑
fbxl2
c420s
的h292细胞、h1975细胞或pc
‑
9细胞进行western blot分析；
[0057]
(g)稳定表达ha
‑
fbxl2、ha
‑
fbxl2
c420s
或载体对照的h1299细胞或h1975细胞，利用mg132处理4小时，用于ip
‑
western分析；
[0058]
(h)对稳定表达vector空载、ha
‑
fbxl2或ha
‑
fbxl2
c420s
的h1299或h1975细胞进行细胞质(cyto)和质膜(pm)分离，然后进行western blot分析；
[0059]
(i)稳定表达flag
‑
fbxl2或flag
‑
fbxl2
c420s
的h1299细胞用mg132处理6小时，flag(红色)和内源性egfr(绿色)免疫染色，用dapi复染，比例尺＝25μm。
[0060]
图3fbxl2抑制egfr过表达或egfr
l858r/t790m
驱动的nsclc生长，其表达与egfr表达呈负相关
[0061]
(a)对h292稳定细胞进行免疫印迹或mts分析，数据用平均数
±
sd表示，***p<0.001；
[0062]
(b
‑
c)稳定表达ha
‑
fbxl2、ha
‑
fbxl2
c420s
或载体对照的h292细胞，利用(b)western blot分析或(c)异种移植肿瘤生长测定(n＝5/组)；在接种后第19天对小鼠实施安乐死，解剖肿瘤并观察其生长情况；绘制肿瘤生长曲线显示；数据以平均数
±
sem表示，**p<0.01，***p<0.001；
[0063]
(d
‑
g)利用转基因小鼠rosa26
‑
lsl
‑
egfr
l858r/t790m
，检测fbxl2对egfr
t790m
介导的tki耐药的影响；(d)显示了代表性的micro
‑
ct图像(左面板)，卡其色、绿红色或紫色红色分别代表心脏、肺或肿瘤，肺被解剖、固定，并检查肿瘤个结节的表面(右面板)；(e)是肺表面可见结节的数目，数据以平均数表示
±
sem，***p<0.001；(f
‑
g)石蜡包埋肺，分别进行(f)h&e染色或(g)ihc检测egfr和p
‑
egfr蛋白的表达检测；数据通过aod统计，数据以平均数
±
sem表示，***p<0.001；
[0064]
(h)fbxl2在人肺腺癌(luad)中的表达与egfr呈负相关；采用人luad连续组织微阵列切片，对ihc进行egfr和fbxl2的皮尔逊相关分析；用aod定量统计egfr阳性组织；
[0065]
(i)应用tcga数据库(luad和lusc)分析了egfr突变的nsclc和正常肺组织中fbxl2的mrna水平，数据用平均数
±
sd表示；
[0066]
(j)用fbxl2的mrna表达水平对肺癌患者的总生存率(os)进行kaplan
‑
meier图的分层分析。
[0067]
图4grp94与fbxl2竞争结合egfr，抑制grp94可促进fbxl2介导的egfr降解，进而抑制egfr
‑
tki耐药性肺癌的生长
[0068]
(a)利用western blot方法检测在pc
‑
9或h1975细胞中沉默grp94(shgrp94
‑
1或shgrp94
‑
2)对egfr蛋白的影响；
[0069]
(b)将flag
‑
egfr、myc
‑
grp94、ha
‑
fbxl2表达质粒共转染hek293t细胞，然后用mg132处理细胞4小时后进行ip
‑
western分析；
[0070]
(c)将稳定表达ha
‑
fbxl2和/或myc
‑
grp94的pc
‑
9细胞进行western blot分析；
[0071]
(d)将flag
‑
egfr
t790m
和ha
‑
fbxl2质粒共转染hek293t细胞，然后利用ganetespib(8nm)处理细胞12小时，用mg132处理细胞4小时后进行ip
‑
western分析；
[0072]
(e)在稳定表达ha
‑
fbxl2或载体对照的h1975细胞中，利用ganetespib(8nm)处理处理细胞12小时，然后进行western blot分析；
[0073]
(f
‑
h)异种移植瘤生长测定；在稳定表达ha
‑
fbxl2或空载的pc
‑
9细胞中转染表达egfr或myc
‑
grp94的重组慢病毒，然后将该细胞(2.5
×
106)进行异种移植瘤生长试验(n＝5/组)；根据实验结果绘制生长曲线和肿瘤重量，肿瘤被固定，石蜡包埋，切片，进行ihc检测egfr和p
‑
egfr；数据通过aod方法进行统计，数据以平均数
±
sem表示；**p<0.01，***p<0.001；
[0074]
(i
‑
j)在balb/c裸鼠(n＝5/组)上接种(5
×
105)稳定过表达fbxl2或/和沉默grp94的h1975细胞；测量肿瘤生长曲线和肿瘤重量；数据通过aod方法进行统计，数据以平均数
±
sem表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；
[0075]
(i
‑
m)使用生物发光成像检测异种移植瘤生长，在balb/c裸鼠(n＝5/组)上接种(5
×
105)稳定表达ha
‑
fbxl2或空载体的h1975细胞，使用或不使用erlotinib或ganetespib治
疗；检测生物发光成像、生长曲线和肿瘤重量，肿瘤被固定，石蜡包埋，切片，进行ihc检测egfr和p
‑
egfr；数据通过aod方法进行统计，数据以平均数
±
sem表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
[0076]
图5nebivolol是fbxl2的激活剂，可促进egfr降解并抑制肿瘤生长
[0077]
(a)h1975细胞稳定表达shfbxo3
‑
1或shfbxo3
‑
2，利用western blot分析egfr蛋白及其下游信号通路的表达；
[0078]
(b)nebivolol的化学结构，以及nebivolol和fbxo3
‑
apag分子对接模型；
[0079]
(c)通过ligplot
80
分析fbxo3
‑
apag结构域中残基(t367、t368、e341、i333和f369)和nebivol的相互作用示意图，氢键或静电相互作用分别以绿色或蓝色划线突出显示，疏水相互作用被认为是短辐射红线；
[0080]
(d)将flag
‑
fbxl2和ha
‑
fbxo3表达质粒共转染hek293t细胞；细胞过夜培养，用20μm mg132处理4h，进行ip
‑
wstern分析；
[0081]
(e)将ha
‑
fbxo3和flag
‑
fbxl2表达质粒共转染hek293t细胞，并与10μm nebivolol处理36小时，不处理组为对照组，再用20μm mg132处理4小时，进行ip
‑
wstern分析；
[0082]
(f)用不同剂量nebivolol处理h1975细胞，然后进行western blot检测；
[0083]
(g)稳定沉默fbxl2(shfbxl2)或gfp(shgfp)的h1299细胞，利用10μm nebivolol处理48h后，进行western
‑
blot实验；
[0084]
(h)pc
‑
9或h1975细胞用nebivolol或bc
‑
1215处理72小时，然后利用mts法测定细胞活力，并绘制曲线图和ic50；数据以平均数
±
sd表示；
[0085]
(i
‑
l)用转基因小鼠(roa26
‑
lsl
‑
egfr
l858r/t790m
)(n＝5/组)评估nebivolol对肺癌egfr表达和egfr
‑
tkis耐药的影响；(i)显示了对照组或nebivolol治疗组小鼠肺的代表性荧光图像(左图)和照片(右图)，红色荧光显示egfr高表达；(j)肺表面可见结节的数目；(k
‑
l)石蜡包埋肺切片，(k)h&e染色或(l)ihc检测fbxl2和egfr；数据通过aod方法进行统计,数据以平均数
±
sem表示；**p<0.01，***p<0.001；
[0086]
(m)将h1975细胞(5
×
105)皮下注射于balb/c裸鼠右侧(n＝5/组)；从第5天开始，小鼠通过腹腔注射ganetespib(50mg/kg)，每周一次，和/或nebivolol(10mg/kg)，每周六次。药物治疗19天后，对小鼠实施例安乐死，解剖肿瘤。绘制生长曲线和测定肿瘤重量；数据以平均数
±
sem表示，*p<0.05。
[0087]
图6fbxl2的激活可克服nsclc对osimertinib的耐药性
[0088]
(a)将ha
‑
fbxl2和flag
‑
egfr
c797s
或flag
‑
egfrt
790m/c797s
表达质粒共转染hek293t细胞，36小时后，进行western blot实验；
[0089]
(b
‑
c)hek293t细胞在ha
‑
fbxl2或载体对照的存在下，与flag
‑
egfr
t790m/c797s
共转染36小时，然后用50μg/ml的环己酰亚胺(chx)处理，细胞裂解物进行western blot分析；对egfr蛋白水平进行了定量分析，并绘制代表蛋白质半衰期的曲线图；
[0090]
(d
‑
g)在稳定表达空载、ha
‑
fbxl2或ha
‑
fbxl2
c420s
的pc
‑9‑
flag
‑
egfr
t790m/c797s
细胞中分别进行(d)western blot实验或(e
‑
g)异种移植肿瘤生长实验(n＝6/组)；对小鼠实施安乐死，解剖肿瘤并拍照；绘制生长曲线和肿瘤重量；肿瘤被固定，石蜡包埋，切片，进行ihc检测egfr和p
‑
egfr；数据通过aod方法进行统计，数据以平均数
±
sem表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；
[0091]
(h)用ha
‑
fbxl2的慢病毒感染稳定表达egfrct
790m/c797s
(pc
‑
9/azdr)的pc
‑
9细胞，利用osimertinib处理细胞72小时进行mts实验，重复三次，数据用平均数
±
sd表示，***p<0.001；
[0092]
(i)pc
‑
9/azdr细胞用osimertinib处理，或同时用50μm的nebivolol处理48h处理，进行mts分析；重复三次，数据用平均数
±
sd表示，*p<0.05，***p<0.001；
[0093]
(j
‑
k)pc
‑
9/azdr细胞(2
×
105)用于异种移植肿瘤生长实验(n＝5/组)；单独使用nebivolol或者与osimertinib联合使用，检测其对肿瘤生长的影响；绘制生长曲线和测定肿瘤重量，数据以平均数
±
sem表示，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；
[0094]
(l)工作模型，e3泛素连接酶fbxl2靶向egfr和egfr突变体，使蛋白酶体降解，从而抑制肿瘤生长和nsclc的tki抵抗；grp94结合并保护egfr免受fbxl2介导的降解；fda批准的药物nebivolol可以破坏fbxo3
‑
fbxl2相互作用以稳定fbxl2，并降解egfr，从而抑制nsclc生长和tki耐药性。
[0095]
图7fbxl2以egf非依赖性方式靶向egfr进行蛋白酶体降解
[0096]
(a)将h1299或h1975细胞在无血清dmem中培养12h，并用20μg/ml的mg132处理6小时或45μm的chloroquine(clq)处理24小时，用100ng/ml的egf处理10min，然后进行western blot分析；
[0097]
(b)用f
‑
box家族e3连接酶的慢病毒shrnas混合物感染h1299细胞，然后进行western blot实验；
[0098]
(c)对稳定表达空载质粒或ha
‑
fbxl2的h1299、h292、pc
‑
9或h1975细胞进行western blot实验；
[0099]
(d)fbxl2抑制egfr蛋白的表达，与egf刺激无关；将稳定表达vector或ha
‑
fbxl2的h1299或h1975细胞，在有或没有血清(10％)的培养基中培养12小时，然后无血清培养的细胞用或者不用100ng/ml egf一起处理10分钟，然后收获细胞进行western blot实验分析；
[0100]
(e
‑
f)利用mg132或氯喹(clq)处理稳定表达ha
‑
fbxl2或空载质粒的h1299、h292、pc
‑
9或h1975细胞，然后进行western blot实验分析；
[0101]
(g)重组纯化fbxl2/skp1蛋白与重组纯化egfr激酶蛋白部分(aa695
‑
1022；egfr
‑
k)，纯化的重组egfr激酶部分进行生物素化标记；
[0102]
(h)egfr和fbxl2均定位于细胞质膜和er；上图：h1299细胞用egfr抗体(绿色)和er示踪剂(红色)进行免疫荧光染色，用dapi(蓝色)复染，下图：稳定表达flag
‑
fbxl2的h1299用flag抗体(绿色)和grp78抗体(红色)进行免疫荧光染色，并用dapi(蓝色)进行复染；(i)在稳定表达flag
‑
fbxl2、flag
‑
fbxl2
c420s
或载体对照的h1299细胞进行flag(红色)和内源性egfr(绿色)免疫荧光染色，比例尺＝25μm。
[0103]
图8fbxl2以egfr信号依赖的方式抑制肺肿瘤细胞增殖
[0104]
(a
‑
b)fbxl2不能抑制含有活化ras的nsclc细胞的增殖；对a549(含有k
‑
ras
g12s
)或h1299(含有n
‑
ras
q61k
)稳定细胞株进行免疫印迹和mts分析，重复三次，数据用平均数
±
sd表示，***p<0.001。
[0105]
图9fbxl2抑制egfr
‑
tkis耐药性nsclc的生长
[0106]
(a)对稳定沉默fbxl2(shfbxl2
‑
#1或shfbxl2
‑
#2)或gfp(
‑
)的h1975细胞进行western blot分析；
[0107]
(b
‑
d)稳定表达ha
‑
fbxl2(wt)、ha
‑
fbxl2
δf
或ha
‑
fbxl2
4a
的h1975细胞进行(b)western blot分析；(c)实时无标记动态细胞分析技术(rtca)或(d)克隆形成分析，数据以平均数表示
±
sd，*p<0.05，**p<0.01；
[0108]
(e)用于构建rosa26
‑
lsl
‑
egfrl
858r/t790m
转基因小鼠(c57bl/6)的质粒的示意图；用于研究ha
‑
fbxl2在tki耐药性肺肿瘤生长中的作用的实验流程图；adecre(2.5
×
107pfu)；lenti
‑
ha
‑
fbxl2(3
×
106pfu)；
[0109]
(f
‑
g)将图3d所示的肺固定，石蜡包埋，切片，置于ihc中检测egfr、p
‑
egfr、ha、ki67和切割的caspase
‑
3(cc3)，数据以aod进行统计，并以平均数
±
sem表示，***p<0.001；
[0110]
(h)fbxl2在肺鳞癌中的表达与egfr呈负相关，从lusc获得的连续组织微阵列切片进行ihc分析，以确定egfr和fbxl2的pearson相关性，采用平均光密度(aod)法对egfr阳性组织进行定量分析；
[0111]
(i)nsclc细胞fbxl2与egfr的相关性研究，对人支气管上皮细胞beas
‑
2b和nsclc细胞h1299、h292、pc
‑
9或h1975进行western blot分析。
[0112]
图10grp94抑制剂可增强fbxl2抑制tki耐药性肿瘤生长的功能
[0113]
(a
‑
b)利用tcga数据库分析肺腺癌(luad)和肺鳞癌(lusc)中fbxl2和grp94的mrna水平；数据以平均数
±
sd表示；
[0114]
(c)图4f所示肿瘤固定，石蜡包埋，切片，ihc检测egfr、p
‑
egfr和ha；
[0115]
(d)稳定表达flag
‑
egfr
t790m
和ha
‑
fbxl2或空载质粒的pc
‑
9细胞，使用ganetespib(8nm)处理48小时后，然后进行mts实验；数据以平均数
±
sd表示，***p<0.001；(e
‑
f)图4i所示肿瘤固定，石蜡包埋，切片和ihc检测egfr、p
‑
egfr、ha、ki67和剪切的半胱氨酸蛋白酶
‑
3(cc3)；数据通过aod统计，并以平均数
±
sem表示，***p<0.001。
[0116]
图11nebivolol通过上调fbxl2表达以抑制细胞增殖
[0117]
(a)用于drugbank数据库小分子抑制性分子的虚拟筛选的流程图；
[0118]
(b)显示了计算机预测分数(vina分数和cyscore)和对接图三个得分最高的化学结构；
[0119]
(c)pc
‑
9细胞用nebivolol，flibanserin或raltegravir处理24小时后，然后进行western blot分析；
[0120]
(d)pc
‑
9细胞用nebivolol处理24小时，然后进行western blot分析；
[0121]
(e)h1975细胞利用5μm或15μm的nebivolol治疗24小时后，然后利用mg132处理6小时或氯喹处理12小时，然后进行western blot实验；
[0122]
(f)pc
‑
9或a549细胞利用10μm nebivolol处理后，进行western blot分析(左图)或mts分析(右图)。实验重复三次，数据用平均数
±
sd表示，***p<0.001。
[0123]
图12nebivolol抑制erlotinib耐药性nsclc的生长
[0124]
(a
‑
b)将图5i所示的肺固定，石蜡包埋，切片，并进行ihc以检测egfr、fbxl2、ki67和切固定，石蜡包埋，切片，进行ihc检测egfr、fbxl2、ki67、剪切的caspase
‑
3(cc3)；数据通过aod方法进行统计，数据以平均数
±
sem表示，***p<0.001；
[0125]
(c)用nebivolol(10μm)或ganetespib(8nm)处理h1975细胞，单独或联合处理36h，然后进行western blot分析；
[0126]
(d
‑
h)利用h1975细胞(5
×
105)进行异种移植肿瘤生长实验(n＝5/组)；将肿瘤固
定，石蜡包埋，切片，利用ihc检测egfr、p
‑
egfr(try1068)、fbxl2、ki67和剪切的caspase
‑
3(cc3)的表达，测定小鼠体重；数据通过aod方法进行统计。数据以平均数
±
sem表示，**p<0.01，**p<0.001。
[0127]
图13激活fbxl2可抑制osimertinib耐药性nsclc的生长
[0128]
(a)将ha
‑
fbxl2与野生型flag
‑
egfr或flag
‑
egfr突变体表达质粒共转染hek293t细胞，培养36小时后，进行western blot实验；
[0129]
(b)将fbxl2和egfr表达质粒共转染hek293t细胞；细胞培养过夜，用20μm mg132处理4h后，进行ip
‑
western分析；
[0130]
(c)稳定表达flag
‑
egfr
t790m/c797s
(pc
‑9‑
flag
‑
egfr
t790m/c797s
)的pc
‑
9细胞利用用6nm osimertinib处理36小时后，进行western blot分析或mts分析；
[0131]
(d)对稳定表达ha
‑
fbxl2或ha
‑
fbxl2
c420s
的pc
‑9‑
flag
‑
egfr
t790m/c797s
细胞进行mts分析，实验重复三次，数据用平均数
±
sd表示，***p<0.001；
[0132]
(e)稳定表达flag
‑
egfr
t790m/c797s
或载体对照的pc
‑
9细胞用osimertinib(6nm)或nebivolol(10μm)处理36小时，或指定的时间间隔，然后进行western blot分析或mts分析。实验重复三次，数据用平均数
±
sd表示，***p<0.001；
[0133]
(f)使用nebivolol(10μm)或grp94抑制剂
‑
1(igrp94
‑
1，15μm)单独或联合使用处理稳定表达flag
‑
egfr
t790m/c797s
的pc
‑
9细胞，然后进行western blot分析或mts分析；
[0134]
(g)图6e所示的肿瘤固定，石蜡包埋，切片，进行ihc检测egfr和p
‑
egfr；数据通过aod方法进行统计；数据以平均数
±
sem，***p<0.001；
[0135]
图14激活fbxl2可克服非小细胞肺癌对erlotinib或gefitinib的耐药性
[0136]
(a)用ha
‑
fbxl2慢病毒或载体对照感染表达egfr
t790m
(pc
‑
9/dr
t790m
)的pc
‑
9细胞，然后利用erlotinib或gefitinib处理细胞72小时后，进行mts分析；实验重复三次，数据用平均数
±
sd表示，***p<0.001；
[0137]
(b)pc
‑
9或pc
‑
9/dr
t790m
细胞用erlotinib或gefitinib处理72小时后，进行mts分析；实验重复三次，数据用平均数
±
sd表示，***p<0.001。
具体实施方式
[0138]
本发明具体实施方式中使用的原料、试剂、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。比如，过表达ha
‑
fbxl2野生型的载体、过表达fbxl2膜定位点突变c420s的载体、过表达grp94的载体、沉默grp94的载体，各种细胞株等，均可通过购买获得。
[0139]
本技术如下实验用到的引物或者基因片段的序列如下：
[0140][0141]
实验1fbxl2靶向egfr进行多泛素和蛋白酶体介导的降解
[0142]
1、实验方法
[0143]
在h1299(野生型egfr)、pc
‑
9(egfr
19del
)或h1975(egfr
l858r/t790m
)细胞中稳定表达针对fbxl2(shfbxl2
‑
#1或shfbxl2
‑
#2，即核苷酸序列表中的humanshfbxl2
‑
1以及humanshfbxl2
‑
2)、针对gfp的shrnas、过表达fbxl2的质粒、过表达野生型egfr、egfr
l858r
或egfr
t790m
的质粒(采用核苷酸序列表中的引物扩增相应的片段)，利用western blot、免疫共沉淀或体内外泛素化实验，检测fbxl2对egfr野生型或其突变蛋白的多泛素化降解的作用。
[0144]
利用免疫共沉淀的方法检测fbxl2和egfr蛋白相互作用的结构域。并利用免疫荧光染色和质膜分离实验检测fbxl2的膜定位在调控egfr表达中的作用。
[0145]
2、实验结果
[0146]
如图1所示，过表达fbxl2可抑制野生型egfr，egfr
l858r/t790m
或egfr
19del
突变蛋白的表达。具体的分子机制是：fbxl2可与egfr结合，进而促进egfr蛋白的多泛素化降解，且此过程不依赖于egf的诱导。
[0147]
如图2所示，egfr结合在fbxl2的9
‑
13lrr结构域，而egfr的激酶区是其与fbxl2结合所必须的。进一步研究发现，fbxl2的膜定位突变蛋白fbxl2
c420s
不能与egfr结合，而且丧
失抑制egfr表达的功能。以上结果，表明fbxl2的膜定位是其调控egfr表达所必须的。
[0148]
实验结果说明，在肺癌细胞中，过表达fbxl2可以抑制野生型egfr，egfr
l858r/t790m
或egfr
19del
突变蛋白的表达。
[0149]
实验2fbxl2可抑制egfr高表达或者egfr
l858r/t790m
介导的nsclc(非小细胞肺癌)的生长，以及在nsclc中fbxl2与egfr表达呈负相关。
[0150]
一、fbxl2对egfr驱动的非小细胞腺癌细胞的影响
[0151]
1、实验方法
[0152]
在h292细胞系(nsclc，人非小细胞肺癌细胞系，淋巴结转移，高表达egfr)上，检测fbxl2对细胞增殖及肿瘤生长的作用，具体步骤如下：
[0153]
(1)fbxl2对h292细胞增殖的影响
[0154]
利用慢病毒包装和感染技术，在h292细胞中稳定过表达空载(plvx
‑
puro)，ha
‑
fbxl2野生型(ha
‑
fbxl2，nm_012157.5(cds))或fbxl2膜定位点突变c420s。然后利用mts检测fbxl2对细胞增殖的影响。
[0155]
(2)检测fbxl2对肿瘤生长的影响(h292裸鼠异质瘤实验)
[0156]
将2
×
106个h292稳定细胞株(过表达空载，ha
‑
fbxl2野生型或ha
‑
fbxl2
c420s
)注射到裸鼠(5～6周雌性小鼠)右颈皮下，每3天利用游标卡尺测量肿瘤体积。实验终点时，取出肿瘤，称取重量。
[0157]
2、实验结果
[0158]
如图3a所示，在h292细胞中过表达野生型fbxl2，可以显著抑制egfr蛋白表达以及其下游信号通路蛋白的磷酸化，例如p
‑
akt或p
‑
erk。
[0159]
如图3b
‑
c所示，过表达野生型fbxl2可显著抑制h292细胞增殖，还可以抑制h292细胞抑制瘤的生长；但过表达e3泛素连接酶失活突变(
△
f或者4a突变(f
‑
box结构域中的lpk
‑
w突变为aaaa))的fbxl2，则无法抑制h292细胞增殖。
[0160]
以上结果表明，过表达fbxl2可抑制egfr蛋白的表达并抑制egfr驱动的非小细胞肺癌(nsclc)的生长，这一过程依赖于fbxl2的e3泛素连接酶的活性。
[0161]
二、fbxl2抑制细胞增殖是否依赖于egfr信号通路的抑制
[0162]
由于报道k
‑
ras是egfr信号通路的关键下游效应蛋白，ras激活突变的细胞增殖可不受egfr信号通路的调控。因此，我们接下来在h1299(n
‑
ras
q61k
)和a549(k
‑
ras
g12s
)细胞中验证了fbxl2对细胞增殖的影响。
[0163]
1、实验方法
[0164]
利用慢病毒包装和感染技术，在h1299(n
‑
ras
q61k
)和a549(k
‑
ras
g12s
)细胞中稳定过表达fbxl2。
[0165]
2、实验结果
[0166]
如图8a
‑
b所示，过表达fbxl2对h1299和a549细胞增殖无显著影响。结果表明，fbxl2抑制癌细胞增殖依赖于egfr信号通路。
[0167]
三、体内验证fbxl2对egfr
l858r/t790m
介导的肿瘤生长的影响
[0168]
1、实验方法
[0169]
构建lsl
‑
egfr
l858r/t790m
转基因小鼠(图9e)。与北京百奥赛图公司合作，在小鼠rosa26位点稳定插入loxp
‑
stop
‑
loxp
‑
egfr
l858r/t790m
。小鼠6周左右的时候，利用鼻腔滴入的
方法将adeno
‑
cre滴入小鼠肺部，特异性的诱导肺癌发生。一周后，再利用鼻腔滴入的方法将过表达ha
‑
fbxl2的慢病毒在小鼠肺部特异性表达来验证fbxl2的功能。
[0170]
检测肿瘤的大小以及数量，同时通过免疫组化检测egfr、ki67、llc3的水平。
[0171]
2、实验结果
[0172]
实验结果表明，过表达fbxl2，可显著抑制肺部肿瘤的大小及数量(图3d
‑
f)。免疫组化(ihc)实验表明fbxl2可显著抑制egfr以及ki67的表达，但对llc3无显著调控作用(图3g和图9f
‑
g)。
[0173]
以上结果表明，fbxl2可以抑制egfr
l858
r/t790m驱动的肺癌的生长，说明fbxl2可以有效抑制存在l858r突变以及t790m突变的egfr驱动肺癌，也就是可以有效抑制耐药性的肺癌。
[0174]
综上，本实施例通过体内体外实验，提高fbxl2的表达水平，可以降解egfr，降低癌细胞中egfr的表达水平，进而抑制egfr驱动的肺癌(包括非小细胞肺癌)的生长，包括存在l858r突变以及t790m突变的egfr驱动的耐药性肺癌，但是，fbxl2的e3泛素连接酶失活突变则无法降解egfr，说明fbxl2降解egfr依赖于其e3泛素连接酶的功能。
[0175]
实验3grp94可与fbxl2竞争性结合egfr，抑制grp94可以增强fbxl2抑制tki耐药性nsclc生长的功能(hsp90家族内质网定位蛋白grp94调控egfr蛋白表达)
[0176]
1、实验方法
[0177]
(1)沉默grp94、过表达grp94对egfr蛋白表达的影响
[0178]
在在pc
‑
9和h1975细胞中，利用慢病毒包装和感染技术，构建稳定过表达grp94或空载(载体为plvx
‑
puro，插入的的片段为：nm_003299.3(cds区))，或者稳定沉默grp94(plko.1，序列为：shgrp94
‑
1：
[0179]
ccggtcgcctcagtttgaacattgattcagagatcaatgttcaaactgaggcgatttttg；shgrp94
‑
2：
[0180]
ccggaagttgatgtggatggtacattcaagagatgtaccatccacatcaactttttttg。)或对照的稳定细胞株；
[0181]
(2)grp94抑制剂ganetespib对egfr蛋白的影响
[0182]
利用grp94抑制剂ganetespib(8nm)处理细胞12小时，然后利用western blot检测egfr蛋白的变化(h1975细胞株)。
[0183]
(3)裸鼠异质瘤实验
[0184]
为了研究grp94在fbxl2介导的肿瘤(pc
‑
9细胞介导的肺癌移植瘤中)生长抑制中的功能，进行了裸鼠异质瘤实验。
[0185]
2、实验结果
[0186]
(1)沉默grp94、过表达grp94对egfr蛋白表达的影响
[0187]
实验结果表明，在pc
‑
9和h1975细胞中，沉默grp94可显著抑制egfr蛋白的表达(图4a)，而且grp94可以与egfr蛋白形成稳定复合体(图4b)。
[0188]
进一步发现grp94可与fbxl2竞争性结合egfr(图4b)。过表达grp94可抑制fbxl2介导的egfr蛋白的降低(图4c)。
[0189]
(2)grp94抑制剂ganetespib对egfr蛋白的影响
[0190]
利用grp94抑制剂ganetespib可显著促进fbxl2与egfr
t790m
的结合，进而促进fbxl2
对egfr蛋白的降解作用(图4d
‑
e)。
[0191]
以上结果表明grp94可与fbxl2竞争选性结合egfr，而且抑制grp94可促进fbxl2对egfr蛋白的降解功能。
[0192]
(3)裸鼠异质瘤实验
[0193]
过表达grp94或egfr，都会显著抑制fbxl2介导的抑制肿瘤生长的功能(图4f
‑
h和图10c)。沉默grp94或者利用ganetespib抑制grp94，则可显著增强fbxl2介导的抑制细胞增殖及肿瘤生长的功能(图4i
‑
l和图10d)。ganetespib可显著增强fbxl2介导的ki67 细胞的减少，还可以增加凋亡的细胞个数(cc3 )(图4m和图10e
‑
f)。
[0194]
本实施例的实验证明：grp94是egfr介导的相关肿瘤的治疗靶点，抑制grp94可显著增强fbxl2介导的egfr降解，并进一步抑制egfr驱动的肺癌。
[0195]
实验4fbxl2激活剂(nebivolol)促进egfr蛋白的降解以及抑制nsclc的生长的实验
[0196]
由于fbxl2可促进egfr
l858r/t790m
耐药蛋白的降解，因此，我们推测靶向fbxl2可能是治疗tkis耐药性nsclc的新策略。因此，我们旨在寻找fbxl2的激活剂。根据文献报道fbxo3可结合并促进fbxl2蛋白的降解，而且fbxo3
‑
apag结构域是其与fbxl2结合所必需的。
[0197]
因此，我们计划通过虚拟筛选小分子化合物文库，寻找到小分子化合物可以与fbxo3
‑
apag结合，进而干扰fbxo3
‑
fbxl2的结合，使得fbxl2蛋白增加，从而促进egfr蛋白的降解。
[0198]
一、沉默fbxo3导致egfr蛋白降低的实验
[0199]
1、实验方法
[0200]
利用慢病毒包装和感染技术，在h1975细胞中稳定表达fbxo3的shrna(shfbxo3
‑
1aggaagatacattgaccatta；shfbxo3
‑
2：
[0201]
cctgggttctatgtgacacta)或对照(shctrl)，然后利用western blot检测fbxo3对egfr蛋白的影响。
[0202]
2、实验结果
[0203]
实验结果表明在h1975细胞中，沉默fbxo3可显著促进fbxl2蛋白的表达，进而导致egfr
l858r/t790m
降低(图5a)。
[0204]
二、抑制fbxl2药物的筛选
[0205]
1、实验方法
[0206]
通过虚拟筛选drugbank数据库(2373个fda批准的药物)，寻找可与fbxo3
‑
apag结合的小分子化合物(图11a)。
[0207]
通过进一步的生物验证实验(利用western blot实验检测这些小分子对egfr的调控作用)以及分子对接实验(通过计算机虚拟筛选的方法将fbxo3
‑
apag结构与小分子对接)进一步验证筛选得到的化合物的性质。
[0208]
2、实验结果
[0209]
筛选出3个化合物，分别是nebivolol，flibanserin和reltegravir(图11b和图5b)。
[0210]
进一步的生物验证表明，nebivolol可显著抑制egfr蛋白的表达(图11c)。进一步利用分子对接实验表明，fbxo3
‑
apag的5个氨基酸，e341，t367，t368和f369是与nebivolol
结合所必需的(图5b
‑
c)且我们利用co
‑
ip实验结果表明这五个氨基酸的突变可显著抑制fbxl2与fbxo3的结合(图5d)。
[0211]
以上实验结果表明nebivolol是抑制fbxo3
‑
fbxl2结合的潜在小分子化合物。
[0212]
三、nebivolol的效果验证
[0213]
1、实验方法
[0214]
1)nebivolol干扰fbxo3
‑
fbxl2结合中的作用的实验方法
[0215]
利用nebivolol处理hek293t细胞，然后利用免疫共沉淀的方法检测fbxo3和fbxl2蛋白结合情况。
[0216]
2)细胞实验(pc
‑
9和h1975)
[0217]
在pc
‑
9和h1975细胞中，利用nebivolol处理不同时间或利用不同浓度的nebivolol处理细胞。western blot实验结果显示nebivolol可以呈时间梯度或浓度梯度抑制egfr蛋白的表达。并利用ic50实验检测nebivolol对细胞增殖的影响。
[0218]
3)裸鼠异质瘤实验
[0219]
将h1975细胞(5x105个/100μl/只)接种在裸鼠右颈部，然后利用腹腔注射单独或联合给予nebivolol或genetespib。
[0220]
2、实验结果
[0221]
1)利用co
‑
ip实验表明nebivolol可以抑制fbxo3
‑
fbxl2的结合(图5e)，而且nebivolol可呈时间梯度和浓度梯度显著促进fbxl2蛋白的表达以及抑制egfr蛋白的表达(图5f和图11d)，与fbxl2相似，nebivolol可促进egfr的蛋白酶体途径的降解(图11e)；另一方面，沉默fbxl2后，nebivolol无法抑制egfr蛋白的表达(图5g)。
[0222]
以上结果表明，nebivolol可以干扰fbxo3
‑
fbxl2蛋白的结合，进而促使fbxl2蛋白的上调，降解egfr蛋白。
[0223]
2)利用ic50实验发现nebivolol对nsclc细胞生存具有抑制功能(图5h)，比如，nebivolol可以显著抑制pc
‑
9细胞的增殖，但是均是抑制egfr驱动的肺癌，对a549细胞的增殖无调控作用(图11f)。
[0224]
以上结果说明nebivolol抑制肺癌细胞增殖依赖于egfr信号通路，只对egfr驱动的肺癌有效。
[0225]
3)进一步探究了nebivolol在抑制egfr
l858r/t790m
介导的肺癌生长中的作用。在lsl
‑
egfr
l858r/t790m
小鼠中，nebivolol可以抑制egfr
l858r/t790m
介导的肺癌生长及数目(图5i
‑
k)。进一步的ihc实验结果表明nebivolol可显著上调fbxl2蛋白的表达，并抑制egfr蛋白的表达(图5l和图12a)。与过表达fbxl2一致的是，nebivolol处理可显著减少ki67阳性的细胞，而对cc3 的细胞无影响(图12b)。
[0226]
4)接下来我们在h1975裸鼠移植瘤实验中验证grp94抑制剂与nebivolol联合使用的情况。实验结果表明grp94抑制剂ganetespib可显著增强nebivolol介导的egfr
l858r/t790m
下调，以及抑制肿瘤生长的功效(图12c
‑
h和图5m)。
[0227]
以上结果表明，nebivolol作为fbxl2的激活剂，可以有效抑制egfr，进而显著抑制tkis耐药的egfr驱动的非小细胞肺癌的生长，进一步地，其与grp94抑制剂联合使用的效果良好。
[0228]
实验5激活fbxl2的表达克服osimertinib的耐药性(联合用药)
[0229]
egfr
‑
tkis耐药性一直是nsclc治疗的瓶颈问题，而且目前对于osimertinib耐药的nsclc没有可用的治疗方案。因此，我们接下来探索了fbxl2在osimertinib耐药性nsclc中的作用。
[0230]
一、fbxl2对egfr的osimertinib耐药突变蛋白表达的影响
[0231]
1、实验方法
[0232]
1)通过构建egfr的osimertinib的耐药突变蛋白(egfr
t790m/c797s
)，将egfr耐药突变蛋白与fbxl2或vector共同转染到hek
‑
293t细胞，36小时后，收集细胞，利用western blot检测fbxl2对egfrosimertinib耐药突变蛋白的影响。
[0233]
2)利用免疫共沉淀的方法检测fbxl2与egfrosimertinib耐药突变蛋白结合的情况。
[0234]
2、实验结果
[0235]
实验结果表明fbxl2可以显著抑制egfrosimertinib耐药突变蛋白的表达，包括g796d，c797s，l718q和l972h突变蛋白(图13a)。此外，fbxl2也可抑制egfre709k，l798i和l844v突变蛋白，它们都是第三代tkiswz4002和co1686耐药突变蛋白(图13a)。重要的是，fbxl2可以显著抑制egfr
t790m/c797s
突变蛋白的表达以及降低其蛋白稳定性(图6a
‑
c)。egfr
t790m/c797s
突变蛋白对目前临床上所有的egfr
‑
tkis均耐药。而且fbxl2可与egfr
c797s
和egfr
t790m/c797s
蛋白形成稳定复合体(图13b)。
[0236]
以上结果表明fbxl2可显著抑制egfr的osimertinib耐药突变蛋白的表达。
[0237]
二、fbxl2在osimertinib耐药的nsclc生长中的作用
[0238]
1、实验方法
[0239]
利用慢病毒感染技术，在pc
‑
9细胞中稳定过表达egfr
t790m/c797s
，构建osimertinib耐药的细胞株(pc
‑
9/azdr)，然后利用mts检测单独使用nebivolol或联合使用nebivolol和ganetespib对pc
‑
9/azdr生长的影响。
[0240]
2、实验结果
[0241]
pc
‑
9细胞中稳定过表达egfr
t790m/c797s
，构建osimertinib耐药的细胞株(pc
‑
9/azdr)(图13c)。nebivolol处理或过表达fbxl2均可显著抑制egfr
t790m/c797s
的表达以及其下游信号通路的激活，并同时抑制细胞增殖(图6d和图13d
‑
e)。
[0242]
在pc
‑
9/azdr细胞中，ganetespib可增强nebivolol介导的抑制细胞增殖的功能(图13f)。
[0243]
我们接下来在小鼠体内检测了fbxl2对osimertinib耐药的nsclc肿瘤生长中的作用。
[0244]
三、裸鼠移植瘤实验
[0245]
1、实验方法
[0246]
利用慢病毒感染技术将ha
‑
fbxl2，ha
‑
fbxl2
c420s
或vector在pc
‑
9/azdr细胞中稳定表达。然后将2
×
106个上述稳定细胞株接种到小鼠右颈皮下，每隔3天测量小鼠体积。
[0247]
2、实验结果
[0248]
在pc
‑
9/azdr介导的裸鼠移植瘤实验中，过表达野生型fbxl2，而不是fbxl2
c420s
，可显著抑制肿瘤生长，以及减少ki67 的细胞(图6g和图13g)。以上实验结果表明，激活fbxl2可以有效抑制osimertinib耐药的nsclc生长。在pc
‑
9/azdr裸鼠移植瘤中，联合使用
nebivolol和osimertinib可显著抑制osimertinib耐药性nsclc的生长(图6j
‑
k)。
[0249]
四、激活fbxl2在egfr
‑
tkis耐药中的作用。
[0250]
1、实验方法
[0251]
①
在pc
‑
9/azdr细胞中，利用ic50实验检测nebivolol在osimertinib耐药中的作用。
[0252]
②
利用慢病毒感染技术将ha
‑
fbxl2或空载体在pc
‑
9/azdr细胞中稳定表达。然后利用ic50实验检测fbxl2在osimertinib耐药中的作用。
[0253]
2、实验结果
[0254]
ic50实验结果表明，过表达fbxl2或nebivolol处理，可显著抑制nsclc细胞株对erlotinib，gefitinib(利用ic50实验检测)和osimertinib的耐药性(图6h
‑
i和14a
‑
b)。
[0255]
本实施例实验结果说明，fbxl2可显著抑制egfr的osimertinib耐药突变蛋白的表达；过表达fbxl2或nebivolol处理可显著抑制对erlotinib，gefitinib和osimertinib的耐药的egfr驱动的非小细胞肺癌，将nebivolol与osimertinib联合使用可以有效治疗耐药的egfr驱动的非小细胞肺癌。
[0256]
实验6fbxl2和egfr蛋白在肺癌中的相关性检测
[0257]
1、实验方法
[0258]
用肺癌组织芯片分析肺腺癌和肺鳞癌组织(组织来源是肺癌病人的组织样本)中fbxl2和egfr蛋白在肺癌中的相关性。进一步利用tcga数据分fbxl2mrna与nsclc的关系。
[0259]
2、实验结果
[0260]
结果表明，fbxl2和egfr的表达在肺鳞癌和肺腺癌中呈负相关(图3h和图9h)。与正常肺细胞相比，在nsclc细胞中fbxl2低表达，而egfr高表达(图9i)。
[0261]
进一步利用tcga数据分析发现，fbxl2mrna在nsclc中低表达(图3i)。而且fbxl2的低表达与肺癌患者总生存期短密切相关(图3j)。
[0262]
tcga数据库分析表明在肺腺癌和肺鳞癌中fbxl2低表达，而grp94高表达(图10a
‑
b)。
[0263]
以上结果表明，fbxl2的低表达、grp94高表达与egfr的高表达相关，fbxl2表达低、grp94表达高，则患非小细胞肺癌的风险更大，同时患者预后也更差，因此可以通过检测待检样本肺组织中的fbxl2的表达水平和/或grp94的表达水平，预测其患癌风险以及预后好坏。
[0264]
综上，egfr驱动的癌症，包括egfr驱动的肺癌与egfr息息相关，本技术实验证实了fbxl2可以egf非依赖性方式靶向egfr，与egfr激酶结构域结合，通过e3泛素连接酶降解egfr；进一步通过体内体外实验证明了，过表达fbxl2的确能降低癌细胞中egfr的表达水平，进而抑制egfr驱动的非小细胞肺癌的生长，包括存在l858r突变以及t790m突变的egfr驱动的耐药性非小细胞肺癌；
[0265]
发明人还设计了找到了fbxl2的抑制剂nebivolol，并通过实验证实了nebivolol作为fbxl2激动剂，可以有效抑制egfr驱动的耐药性非小细胞肺癌，尤其是可以显著抑制tkis耐药的egfr驱动的非小细胞肺癌的生长；
[0266]
进一步的机制实验发现，fbxl2可显著抑制egfr的osimertinib耐药突变蛋白的表达；过表达fbxl2或nebivolol处理均可显著抑制对erlotinib，gefitinib和osimertinib的
耐药(即存在egfrt790m突变或c797s突变)的egfr驱动的非小细胞肺癌，将nebivolol与osimertinib联合使用可以有效治疗耐药的egfr驱动的非小细胞肺癌。
[0267]
最后，发明人还发现fbxl2的低表达与egfr的高表达相关，fbxl2表达低，则患非小细胞肺癌的风险更大，同时患者预后也更差，因此可以通过检测待检样本肺组织中的fbxl2的表达水平，预测其患癌风险以及预后好坏。