一种益生菌组合物和使用方法与流程

一种益生菌组合物和使用方法
1.交叉引用
2.本技术要求2019年2月5日提交的美国临时申请no.62/801,307的优先权，其内容通过引用合并入本技术。
3.序列表
4.本技术包括一个序列表，该序列表通过efs
‑
web以ascii格式提交，并通过引用将其全部合并到本技术中。创建于2020年2月4日的ascii 副本名为“x30027
‑
seqlisting_st25.txt”，大小为121kb。
技术领域
5.本发明涉及改善动物健康的益生菌组合物和方法。所述益生菌组合物包括一个或多个分离的乳酸杆菌菌株，所述菌株定植于胃肠道以改善动物健康。


背景技术：

6.直接饲喂微生物(dfms，通常也称为益生菌)是定殖于动物胃肠道并为该动物提供一些有益效果的微生物。所述微生物可以是诸如来自杆菌 (bacillus)、乳酸杆菌(lactobacillus)、乳酸乳球菌(lactococcus)和肠球菌(enterococcus)属的细菌种类。所述微生物也可以是酵母菌或者甚至可以是霉菌。所述微生物可以经口或经粘膜提供给动物，就鸟类而言，是提供给受精卵(即卵内)。
7.dfm提供的有益活性可以是合成宿主动物健康代谢所需的维生素或其他营养分子。dfm还可以保护宿主动物免受其他病原微生物引起的疾病、紊乱或临床症状的影响。例如，dfm可自然产生对某些种类的致病菌(例如有害或致病细菌)具有抑制或细胞毒性活性的因子。
8.本领域需要益生菌组合物和方法，以改善有益分子向动物胃肠道的递送并改善动物健康。


技术实现要素：

9.本发明提供了改善动物健康的组合物和方法。
10.在一种实施方式中，本发明提供了一种组合物，所述组合物具有分离的第一罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteris)菌株和分离的第二罗伊氏乳杆菌菌株中的至少一种，其中，与未施用所述组合物的动物相比，当向动物施用有效剂量时，所述组合物增强了动物健康。
11.在一种实施方式中，第一分离的第一罗伊氏乳杆菌菌株包括以下至少一种：具有与seq id no:26至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，具有与seq id no:1至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，具有与seq id no:3至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少 99％序列一致性的核苷酸序列，具有与seq id no:8至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或
至少99％序列一致性的核苷酸序列。
12.在一种实施方式中，第二分离的第二罗伊氏乳酸杆菌菌株包括以下至少一种：具有与seq id no:25至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，具有与seq id no:27至少 95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，具有与seq id no:28至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，具有与seq id no:29至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。
13.在一个实施方式中，本发明提供了一种改善动物健康的方法。所述方法包括向动物施用有效剂量的上述组合物。
附图说明
14.图1描绘了罗伊氏乳杆菌菌株3630的杀菌效果。菌株3630周围清晰的“圈”证明，罗伊氏乳杆菌菌株3630能够杀死致病菌，但不杀死非致病性嗜酸性乳杆菌。所示致病菌为革兰氏阳性致病菌产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、乳房链球菌、猪链球菌；革兰阴性致病菌为大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和空肠弯曲菌。
15.图2描绘了罗伊氏乳杆菌菌株3632的杀菌效果。菌株3632周围清晰的“圈”证明，罗伊氏乳杆菌菌株3632能够杀死致病菌，但不杀死非致病性嗜酸性乳杆菌。所示致病菌为产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、乳房链球菌、猪链球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、坏死梭杆菌和空肠弯曲菌。
16.图3描绘了通过口服施用途径在鸡体内罗伊氏乳杆菌菌株3632的定殖。左边显示了实验时间线。右侧显示菌落形成和pcr及序列确认。
17.图4描述了通过卵内施用途径，在鸡中使用罗伊氏乳杆菌菌株3632 的时间线。在第3天和第7天收获雏鸡，并对该菌株进行表征。
18.图5描绘了第3天处死的雏鸡的菌落。孵化后第3天，在雏鸡的组织中发现了菌株3632，而对照菌株的定殖在第3天后下降。
19.图6描绘了第7天处死的雏鸡的菌落。孵化后7天，在雏鸡的组织中发现了菌株3632，而对照菌株的cfu数在第7天后下降。
20.图7描绘了罗伊氏乳杆菌菌株3630和3632通过卵上(喷雾)和卵内施用途径在雏鸡体内的定殖。左边显示了实验时间线。右边显示的是第3 天和第7天处死鸡罗伊氏乳杆菌菌株3630和3632的cfu数。
21.图8描绘了第0天接种球虫病疫苗并从第0天到第42天，在10
7 cfus/kg饲料或bmd_55的条件下喂食罗伊氏乳杆菌的数据。与服用 bmd_55(亚甲基双水杨酸杆菌肽)的鸡相比，施用罗伊氏乳杆菌3632 的鸡饲料转化率最高。
22.图9描绘了罗伊氏乳杆菌菌株3632对产气荚膜梭菌的体内灭杀效果的定量结果。在共培养实验中，罗伊氏乳杆菌在产气荚膜菌中似乎增长了 4个数量级。在bhi肉汤中共培养24小时后测定cfu数。罗伊氏乳杆菌在mrs琼脂平板上计数，产气荚膜梭菌在opsp板上计数。该数据来自 3个重复的代表性实验。共培养
‑
罗伊氏乳杆菌，用罗伊氏乳杆菌特异性培养基从共培养样品中回收的罗伊氏杆菌。共培养
‑
产气荚膜梭菌，用产气荚膜梭菌特异性培养基从共培养样品中回收的产气荚膜梭菌。
23.图10描绘了益生元对罗伊氏乳杆菌菌株3630和3632生长的影响。测试的益生元包括低聚果糖(fos)、阿拉伯木聚糖低聚糖(axos)、甘露寡糖(mos)或低聚半乳糖(gos)。观察到用gos生长增加。
24.图11a
‑
11b描绘了两种罗伊氏乳杆菌菌株的生化代谢概况。该图表示通过单独培养和共同培养的两株罗伊氏乳杆菌的主成分分析(pca)获得的代谢数据。图11a表示培养物的细胞颗粒，1_p
‑
30表示菌株3630的颗粒，2_p
‑
32表示菌株3632的颗粒，3_p
‑
30
‑
32表示菌株3630和菌株3632 的共培养物的颗粒。图11b表示培养物的上清液，1_s
‑
30表示菌株3630 的上清液，2_s
‑
32为菌株3632的上清液，3_s
‑
30
‑
32为菌株3630与菌株3632共培养的上清液。4_培养基1为不含葡萄糖，但含0.5％gos的 aof
‑
mrs培养基对照。
25.对于图12
‑
19，数据表示分泌到上清液中的目标分子。1)罗伊氏乳杆菌菌株3630，2)罗伊氏乳杆菌菌株3632，3)罗伊氏乳杆菌菌株3630和罗伊氏乳杆菌菌株3632的共培养，以及4)培养基对照。对数据进行标度化，以便将所有样本的测定中值设置为1.0。
26.图12描绘了罗伊氏乳酸杆菌菌株分泌的二甲基甘氨酸、别苏氨酸和 1
‑
甲基
‑4‑
咪唑乙酸盐的水平。
27.图13描绘了罗伊氏乳酸杆菌菌株分泌的4
‑
咪唑乙酸盐、赖氨酸和n6
‑ꢀ
甲基赖氨酸的水平。
28.图14描绘了罗伊氏乳酸杆菌菌株分泌的n6,n6
‑
二甲基赖氨酸、5
‑
氨基戊酸和酪氨酸的水平。
29.图15描绘了罗伊氏乳酸杆菌菌株分泌的4
‑
羟基苯丙酮酸、吲哚乙酸和γ
‑
谷氨酰谷氨酰胺的水平。
30.图16描绘了罗伊氏乳酸杆菌菌株分泌的葡萄糖
‑6‑
磷酸、4
‑
羟基
‑2‑
氧戊二酸和肌醇的水平。
31.图17描绘了罗伊氏乳杆菌菌株分泌的尿苷5'
‑
单磷酸(ump)、胞苷 5'
‑
单磷酸(5'
‑
cmp)和3'
‑
5'
‑
尿苷酰尿苷的水平。
32.图18描绘了罗氏乳杆菌菌株分泌的o
‑
磺基
‑
l
‑
酪氨酸、吲哚
‑3‑
乙酰胺和吲哚
‑2‑
酮的水平。
33.图19描绘了罗伊特乳杆菌菌株分泌的大豆苷元水平。
具体实施方式
34.本发明提供了一种改善动物健康的组合物和方法。
35.在一种实施方式中，本发明提供了一种组合物，所述组合物具有分离的第一罗伊氏乳杆菌菌株和分离的第二罗伊氏乳杆菌菌株中的至少一种。
36.在一种实施方式中，分离的第一个罗伊特乳杆菌菌株为菌株3632。如本发明所述，菌株3632具有包括以下至少一个的核酸或氨基酸序列： seq id no：1～24和26、与seq id no：1～24和26中的至少一种有着至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或至少99％的序列一致性的序列。
37.在一种实施方式中，分离的第二罗伊氏乳酸杆菌菌株为菌株3630。如本发明所述，菌株3630具有核酸序列，菌株3632具有包括以下至少一个的核酸或氨基酸序列：seq id no：25和27～43、与25和27～43中的至少一种有着至少95％、至少96％、至少97％、至少
98％，或至少99％的序列一致性的序列。
38.本发明的分离菌株未通过重组或基因工程手段进行遗传修饰。
39.在一些实施方式中，本发明公开的组合物包括比例约为0.75～1.5:1的分离的第一罗伊氏乳杆菌菌株和分离的第二罗伊氏乳杆菌菌株。在优选的实施方式中，组合物包括大约等量的分离的第一罗伊氏乳杆菌菌株和分离的第二罗伊氏乳杆菌菌株。
40.本发明公开的组合物可配制成动物饲料、饲料添加剂、食品成分、水添加剂、水混合添加剂、消耗性溶液、消耗性喷雾添加剂、消耗性固体、消耗性凝胶、注射剂或其组合。在一种实施方式中，所述组合物包括水。
41.本发明公开的组合物包括约102～108cfu/kg组合物的、约104～10
7 cfu/kg组合物的、约103～105cfu/kg组合物的、约102cfu/kg组合物的、约103cfu/kg组合物的，或约107cfu/kg组合物的分离的第一罗伊氏乳杆菌菌株。
42.与其最接近的天然存在的对应物相比，本发明的组合物表现出显著不同的功能和/或结构特征/特性。例如，本发明的罗伊氏乳杆菌菌株在结构上不同于天然存在于胃肠道中的罗伊氏乳杆菌菌株。具体而言，可以分离和纯化罗伊氏乳杆菌菌株，使罗伊氏乳杆菌在胃肠道环境中不存在、罗伊氏乳杆菌菌株可以以胃肠道中不存在的浓度存在、罗伊氏乳杆菌菌株可以与不存在于胃肠道中的可接受载体相关联、罗伊氏乳杆菌菌株可制成耐储藏的并存在于胃肠道外，并且所述微生物可以与不存在于胃肠道中浓度的其他微生物结合。此外，本发明的罗伊氏乳杆菌菌株在功能上不同于天然存在于胃肠道中的罗伊氏乳杆菌菌株。具体而言，罗伊氏乳杆菌菌株以分离和纯化的形式应用时，可以调节胃肠道微生物、加快体重增长，增加饲料利用率、减少微生物致病菌的数量、以及减少致病菌相关的胃肠道损伤。
43.方法
44.本发明还提供了改善动物健康的方法，其中所述方法包括向动物施用有效剂量的组合物。
45.与未施用所述组合物的动物相比，本发明及以上公开的组合物通过在施用动物时提供积极的健康益处来改善动物健康。本发明所述“动物”包括鸟类、家禽、人类或非人类哺乳动物。具体的例子包括鸡、火鸡、狗、猫、牛和猪。鸡可以是肉鸡或产蛋(egg
‑
laying)鸡或产蛋(egg
‑
producing)鸡。
46.积极的健康益处包括降低饲料转化率、增加体重、增加瘦体重、减少胃肠道中致病菌相关损伤的形成、减少致病菌定殖、减少炎症和降低死亡率。
47.在一些实施方式中，本发明公开的组合物使饲料转化率降低至少1％、至少5％、至少25％或至少50％。在一些实施方式中，本发明公开的组合物使家禽重量增加至少1％、至少5％、至少25％或至少50％。在一些实施方式中，本发明公开的组合物使胃肠道中致病菌相关的损伤形成减少至少1％、至少5％、至少25％或至少50％。在一些实施方式中，本发明公开的组合物使致病菌定殖减少至少1％、至少5％、至少25％或至少50％。在一些实施方式中，本发明公开的组合物将炎症减少至少1％、至少5％、至少25％或至少50％。在一些实施方式中，本发明公开的组合物使死亡率降低至少1％、至少5％、至少25％或至少50％。
48.在一些实施方式中，以下值可以以任何方式组合以产生用于降低饲料转化率、增加家禽重量、增加瘦体重、减少胃肠道中致病菌相关损伤形成、减少致病菌定殖、降低死亡
率1％、5％、25％、50％和75％的最小值、最大值或范围。
49.例如，致病菌相关损伤形成的减少可减少约1％至5％，更优选约5％至50％之间。
50.本发明所述致病菌包括沙门氏菌(salmonella)、梭菌(clostridium)、弯曲菌(campylobacter)、葡萄球菌(staphylococcus)、链球菌 (streptococcus)和大肠杆菌(e.coli)。致病菌的其他示例包括鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、婴儿沙门氏菌(salmonella infantis)、哈达尔沙门氏菌(salmonella hadar)、肠炎沙门氏菌(salmonella enteritidis)、新港沙门氏菌(salmonella newport,)、肯塔基沙门氏菌 (salmonella kentucky)、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、乳房链球菌(streptoccus uberis)、猪链球菌(streptococcus suis)、大肠杆菌(escherichia coli)、空肠弯曲菌(campylobacterjejuni)和坏死梭杆菌(fusobacterium necrophorum)。
51.所述组合物可以口服、肠胃外、鼻腔或粘膜施用。
52.在一些方面，施用包括饲喂家禽或喷洒到家禽上。在其他方面，施用包括卵上施用或卵内施用，
53.在一些方面，动物施用同时接种疫苗。动物可以在施用本发明公开的组合物之前接种疫苗。动物可以接种球虫病疫苗。球虫病疫苗是本领域已知的，例如coccivac。
54.在一些实施方式中，施用是通过注射或输注的方式。在一个实施方式中，所述组合物通过乳房内输注的方式施用于母牛。
55.本发明公开的菌株表现出某些表型特性。不受理论束缚，据信这些表型特性至少有助于改善动物健康。
56.在一些实施方式中，分离的菌株分泌环状二肽(环(组氨酸
‑
苯丙氨酸)和环(苯丙氨酸
‑
脯氨酸))、短链脂肪酸(2
‑
羟基
‑3‑
甲基戊酸和α
‑ꢀ
羟基异己酸)、甜菜碱、二甲基甘氨酸中的至少一种、必需氨基酸(例如，别苏氨酸、磷酸苏氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和半胱氨酸s
‑
硫酸盐)、核苷酸(例如，腺苷5'
‑
单磷酸(amp)、尿苷5'
‑
单磷酸)(ump)、胞苷5'
‑
单磷酸(5'
‑
cmp)和胞苷2'3'
‑
环单磷酸)、肌醇和吲哚
‑2‑
酮。上述分子中的一些为宿主提供了有益的特性，包括体重增加、促炎效应和抗生素作用。
57.在一些实施方式中，包括分离的第一罗伊氏乳杆菌菌株(菌株3632) 和分离的第二罗伊氏乳杆菌菌株(菌株3630)组合的组合物将比单独培养时更大量地分泌某些有益分子。例如，参见图12
‑
19。
58.在一些实施方式中，施用组合物的动物表现出胃肠道微生物含量的变化。例如，与未施用本发明所述组合物的动物相比，已施用本发明所述组合物的动物肠道中类杆菌科细菌的量可能增加。
59.在一些实施方式中，本发明提供了通过向有需要的动物施用本发明公开的组合物来治疗动物坏死性肠炎、改善其作用或预防坏死性肠炎的方法。
60.在一些实施方式中，本发明提供了治疗、改善牛乳腺炎的作用或预防牛乳腺炎的方法。所述方法包括向有需要的动物施用本发明公开的组合物。
61.本发明所述“分离的”是指目标分离物已与其在特定环境中相关联的至少一种材料分离。
62.因此，“分离物”在其自然存在的环境中不存在；相反，正是通过本发明所述的各种
技术，微生物已从其自然环境中移除并处于非自然存在的存在状态中。因此，分离的菌株或分离的微生物可以作为(例如)与可接受的载体结合的生物学纯培养物存在。
63.本发明所述“个体分离物”应被认为是指在与一种或多种其他微生物分离后包括优势微生物的单一属、种或菌株的组合物或培养物。该短语不应被视为表示微生物已被分离或纯化的程度。然而，“个体分离物”可基本上仅包括微生物的一个属、种或菌株。
64.在本发明的某些方面，分离的罗伊氏乳杆菌菌株作为分离的和生物纯培养物存在。本领域技术人员应理解，特定罗伊氏乳杆菌菌株的分离的和生物学纯培养物表示所述培养物基本上不含(在科学理性范围内)其他活生物体并且仅包括所述的个体罗伊氏乳杆菌菌株。培养物可含有不同浓度的所述分离的罗伊氏乳杆菌菌株。本发明指出，分离的和生物学纯微生物通常必然不同于纯度较低或不纯的材料。
65.在本发明的实施方式中，组合物包括两种分离的罗伊氏乳杆菌菌株的组合。
66.本发明所述“载体”、“可接受的载体”或“药物载体”是指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、配料或赋形剂。这种载体可以是无菌液体，例如水和油(包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等)。水或水溶液盐溶液和葡萄糖水溶液和甘油水溶液优选用作载体，在一些实施方式中用作可注射溶液。或者，载体可以是固体剂型载体，包括但不限于粘合剂(用于压制丸剂)、助流剂、包封剂、食用香料和着色剂中的一种或多种。载体的选择可以根据预期的施用途径和标准的药物实践进行选择。参见hardee和baggo(1998.development and formulationofveterinary dosage forms.2nd ed.crc press.504pg.)；以及e.w.martin (1970.remington’s pharmaceutical sciences.17th ed.mack pub.co.)。
67.本发明所述“递送”或“施用”是指向宿主提供有益活性的行为。所述递送可以是直接的或间接的。可以通过口服、鼻腔或粘膜途径施用。例如但不限于，口服途径可以是通过饮用水施用，鼻施用途径可以是通过喷雾或蒸气，粘膜施用途径可以是通过与粘膜组织的直接接触。粘膜组织是一种富含粘液腺的膜，例如排列在鼻子、嘴巴、食道、气管、肺、胃、肠道、肠和肛门内表面的粘膜。就鸟类而言，施用可以是卵内施用，即施用于受精卵。卵内施用可以通过液体喷洒到蛋壳表面，或通过蛋壳注射。
68.本发明所述术语“治疗”(treating)、“治疗”(to treat)或“治疗
”ꢀ
(treatment)包括抑制、减缓、停止、减少、改善或逆转现有症状、病症、紊乱或疾病的进展或严重性。还可以预防性地治疗以预防或减少临床症状、紊乱、状况或疾病的发生率、发生、风险或严重程度。
69.除非有相反的明确说明，“或”指的是包含性的“或”，而不是排除性的“或”。例如，条件a或b满足以下任一条件：a为真(或存在)且b为假(或不存在)，a为假(或不存在)且b为真(或存在)，并且a和b 都为真(或存在)。
70.本发明给出的任何实施例或说明不应以任何方式被视为对使用它们的任何术语的限定、限制或表达定义。相反，这些实施例或说明应被视为对于一个特定实施例进行描述，仅是说明性的。本领域的普通技术人员应理解，与这些示例或说明一起使用的任何一个或多个术语将涵盖其他实施例，这些实施例可能会或可能不会在说明书中或其他地方给出，并且所有这些实施例旨在包括于本说明书该术语的范围之中。指定此类非限制性示例和说明的语言包括但不限于：“例如”(for example)、“例如”(forinstance)、“例如”(e.g.)和“在一个实施方式中”。在本说明书中，描述了包括多个成员的各种参数组。在一组
参数中，每个成员可以与任何一个或多个其他成员组合以形成额外的子组。例如，如果组的成员是a、b、c、 d和e，则特别考虑的附加子组包括成员中的任意一个、两个、三个或四个，例如a和c；a、d和e；b、c、d和e等等。
71.本发明整个说明书中，数量由范围以及范围的下限和上限界定。每个下限可以与每个上限组合以定义一个范围。下限和上限应分别视为一个单独的元素。可以组合两个下限或两个上限来界定范围。
72.序列表
73.seq id no:1 美杀菌素
‑
e1 cdna
[0074][0075]
seq id no:2 美杀菌素
‑
e1氨基酸(天然的)
[0076]
1 mdkeelekiv gnnfeemslq kmteiqgmge yqvdstpaas aisratiqvs rassgkclsw
[0077]
61 gsgaafsayf thkrwc
[0078]
seq id no:3 美杀菌素
‑
e2 cdna
[0079][0080]
seq id no:4 美杀菌素
‑
e2氨基酸(天然的)
[0081]
1 meekelegvi gnsfesmtve emtkiqgmge yqvdstpgyf mesaafsalt anitrhamhh
[0082]
61 h
[0083]
seq id no:5 卷曲霉啶合成酶(天然的)
[0084][0085][0086]
seq id no:6 大肠杆菌素v产生蛋白(天然的)
[0087][0088]
seq id no:7 凝集素受体前体
‑
1(arp
‑
1)(天然的)
[0089][0090]
seq id no:8 凝集素受体前体
‑
2(arp
‑
2)(天然的)
[0091]
[0092][0093]
seq id no:9 5
‑
磷酸木酮糖磷酸酮醇酶启动子(天然的)
[0094][0095][0096]
seq id no:10 延伸因子tu启动子(天然的)
[0097][0098]
seq id no:11 3
‑
磷酸甘油醛脱氢酶启动子(天然的)
[0099][0100]
seq id no:12 6
‑
磷酸葡萄糖脱氢酶启动子(天然的)
[0101][0102]
seq id no:13 l
‑
乳酸脱氢酶启动子(天然的)
[0103][0104][0105]
seq id no:14 tuf启动子(天然的)
[0106]
[0107]
seq id no:15 c蛋白α
‑
抗原前体(天然的)
[0108]
[0109]
[0110][0111]
seq id no:16 阿拉伯半乳聚糖内切1,4
‑
β
‑
半乳糖苷酶(天然的)
[0112]
[0113][0114]
seq id no:17 染色体分离蛋白(天然的)
[0115][0116]
seq id no:18 d
‑
γ
‑
谷氨酰
‑
内消旋
‑
二氨基庚二酸内肽酶cwls(天然的)
[0117]
[0118]
seq id no:19 n
‑
乙酰胞壁酰
‑
l
‑
丙氨酸酰胺酶sle1前体(天然的)
[0119][0120]
seq id no:20肽酶家族m23(天然的)
[0121]
[0122][0123]
seq id no:21染色体分配蛋白(天然的)
[0124][0125]
seq id no:22 cwls内肽酶启动子(天然的)
[0126]
[0127]
seq id no:23染色体分离蛋白启动子(天然的)
[0128][0129]
seq id no:24染色体分配蛋白smc启动子(天然的)
[0130][0131]
seq id no:25罗伊氏乳杆菌3630 f116s
[0132][0133][0134]
seq id no:26罗伊氏乳杆菌3632 f116s
[0135]
[0136]
seq id no:27罗伊氏乳杆菌3630_00184
[0137][0138]
seq id no:28罗伊氏乳杆菌3630_00491
[0139][0140]
seq id no:29罗伊氏乳杆菌3630_00497
[0141][0142]
seq id no:30 罗伊氏乳杆菌3630_00533
[0143]
[0144]
[0145]
[0146][0147]
seq id no:31 罗伊氏乳杆菌3630_00804
[0148][0149]
seq id no:32 罗伊氏乳杆菌3630_00827
[0150][0151]
seq id no:33 罗伊氏乳杆菌3630_00947
[0152][0153]
seq id no:34 罗伊氏乳杆菌3630_01261
[0154][0155][0156]
seq id no:35罗伊氏乳杆菌3630_01695
[0157][0158]
seq id no:36 罗伊氏乳杆菌3630_01889
[0159]
[0160][0161]
seq id no:37 罗伊氏乳杆菌3630_01932
[0162][0163]
seq id no:38 罗伊氏乳杆菌3630_02243
[0164][0165][0166]
seq id no:39 罗伊氏乳杆菌3630_02365
[0167][0168]
seq id no:40 罗伊氏乳杆菌3630_02435
[0169][0170]
seq id no:41 罗伊氏乳杆菌3630_02436
[0171][0172]
seq id no:42罗伊氏乳杆菌3630_02437
[0173][0174]
seq id no:43 罗伊氏乳杆菌3630_02438
[0175]
[0176][0177]
[0178]
参考下述的实施例可以更好地理解本发明。提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制备和评价本发明要求保护的化合物、组合物和/或方法的完整公开和描述，旨在纯粹性示例，而不是限制本发明。
[0179]
实施例1.罗伊氏乳杆菌的鉴定
[0180]
7种罗伊氏乳杆菌菌株分离自汉诺威研究中心较老的鸟类，来自汉诺威大学家禽诊所的盲肠内容物。所有七种菌株经16s rrna测序都被鉴定为罗伊氏乳杆菌。
[0181]
虽然需氧条件下大多数菌株在mrs肉汤和琼脂中生长有限(de man, j.d.；rogosa,m.；and sharpe,m.e.“a medium for the cultivation oflactobacilli”.japplbad.23：130
‑
135(1960))，在39℃厌氧条件下，所有菌株在mrs琼脂和mrs肉汤上均表现出良好的生长。在厌氧条件下，在血液琼脂上培养细菌菌株主要导致有限的生长。这些菌株都不能在厌氧条件下在米勒顿(mueller hinton)肉汤中生长。对于所有进一步的分析，细菌菌株在39℃的厌氧条件下在mrs培养基中生长。
[0182]
使用平板测试细菌分离物的抗菌敏感性。所有的菌株都抗大肠杆菌素、多西环素、恩诺沙星、红霉素、新霉素、苯唑西林、青霉素 g、联磺甲氧苄啶、四环素、替米考星和泰乐菌素。除了菌株3632之外，所有菌株都耐受链霉素，除了菌株2098之外都抗泰妙菌素。另外，菌株 2091、2095、2097和3630耐受头孢泊肟酯；菌株2091、2095和2097耐受头孢噻肟；菌株3630和3632耐受林可霉素。在测试浓度下，未发现菌株耐受阿莫西林、头孢噻呋、红霉素d、林可霉素
‑
大观霉素和利福平。
[0183]
实施例2.罗伊氏乳杆菌菌株的选择及抗感染活性
[0184]
为了选择进一步应用的最佳菌株，测试了罗伊氏乳杆菌分离物各种期望的益生菌抗感染性性质，例如生长动力学、产生过氧化氢的能力、自凝集、酶谱、在牛胆汁和胰酶存在下的存活率以及对热休克和ph变化的敏感性。还使用溶血试验对罗伊氏乳杆菌菌株进行了安全性测试。
[0185]
总体来看，所有菌株在益生菌性质方面表现得非常相似，包括生长动力学和产生过氧化氢的能力，除了菌株3632显示出一些独特的性质，包括在液体培养基中的自凝集能力(与良好表征的人益生菌株罗伊氏乳杆菌 atcc23272相当)。除自凝集外，罗伊氏乳杆菌3632似乎还会产生一种橙色色素，其颜色类似于β胡萝卜素。其他菌株，包括人类罗伊氏乳杆菌菌株atcc23272和嗜酸乳杆菌，均不产生橙色色素。发现这些菌株都没有在血液琼脂平板上溶血，表明这些分离物不太可能对人致病。
[0186]
用测序(扩增子表达)对罗伊氏乳杆菌菌株2091、3632， 3630和一株独立分离的罗伊氏乳杆菌菌株170331进行了全基因组测序。表1总结了测序、组装和注释统计信息。被测菌株之间的基因组结构和组织有所不同。
[0187]
表1
[0188][0189]
实施例2.5.罗伊氏乳杆菌3632在16天龄胚胎中的定殖
[0190]
本研究的目的是测试罗伊氏乳杆菌3632是否定殖于16天龄胚胎的肠道中。为此，从查尔斯河获得16天大的胚胎，并通过气囊、卵黄囊和尿囊途径接种108cfu/胚胎的罗伊氏乳杆菌3632。在第18天处死胚胎，收获肠并接种在mrs琼脂平板上。未接种组作为对照。从大多数胚胎的肠道中回收到了罗伊氏乳杆菌，表明罗伊氏乳杆菌3632定殖于16天龄胚胎的肠道。即使在液体培养中富集2天后，也未从任何对照(未接种)胚胎中回收到罗伊氏乳杆菌3632。
[0191]
实施例3.在脑心浸液(bhi)肉汤中共培养罗伊氏乳杆菌和产气荚膜梭菌。
[0192]
在bhi肉汤中培养罗伊氏乳杆菌和产气荚膜梭菌。在bhi肉汤中共培养24小时后测定cfu数。罗伊氏乳杆菌在mrs琼脂平板上计数，产气荚膜梭菌在opsp平板上计数。该数据来自一个有3次重复的代表性实验。共培养的罗伊氏乳杆菌，使用罗伊氏乳杆菌特异性培养基从共培养样品中回收罗伊氏乳杆菌。共培养的产气荚膜梭菌，使用产气荚膜梭菌特异性培养基从共培养样品中回收的产气荚膜梭菌。参见图9。
[0193]
实施例4.罗伊氏菌的体内效果
[0194]
家禽在第0天接种coccivac，并在第0天至第42天以107cfu/kg 饲料饲喂罗伊氏乳杆菌。用添加有亚甲基二水杨酸酯杆菌肽(bmd_55) 的饲料喂养单独的一组鸟。
[0195]
计算饲料转化率和欧洲肉鸡指数。与喂食bmd_55的鸡相比，喂食罗伊氏乳杆菌的鸡只表现出饲料转化率和欧洲肉鸡指数的降低。参见图8。
[0196]
实施例4.益生元对罗伊氏乳杆菌生长的影响。
[0197]
罗伊氏乳杆菌菌株3630和3632在几种不同的益生元(包括低聚果糖 (fos)、低聚阿拉伯木聚糖(axos)、低聚甘露聚糖(mos)或低聚半乳糖(gos))存在下单独和组合生长。
[0198]
如图10所示，与在fos、axos或mos存在下生长的菌株相比，在gos存在下生长的菌株表现出生长增强。
[0199]
实施例5.罗伊氏菌的体内效果
[0200]
只有当鉴定的菌株能够定殖宿主胃肠道时，所述菌株才能有效地充当直接饲喂微生物。罗伊氏乳杆菌菌株定殖鸡的能力按照不同的施用途径进行评估。
[0201]
罗伊氏乳杆菌口服施用于10日龄的雏鸡。在接种后的不同时间处死雏鸡并测定消化物(crop)、小肠和盲肠中罗伊氏乳杆菌的存在。菌株3632 能够在所有三种组织中定殖并保持可检测至少18天。
[0202]
罗伊氏乳杆菌在孵化前3天通过卵内接种(即注射到鸡蛋中)进行施用。在孵化后第3天和第7天，在雏鸡的组织中发现了菌株3632，而对照菌株的定植在第3天后下降。
[0203]
通过将含有细菌的液体喷洒到鸡蛋表面，在卵内施用罗伊氏乳杆菌。同样，菌株3630和3632能够定殖并在孵化后3天和7天存在于雏鸡中。喷雾接种与卵注射一样有效，但需要较少的孵化蛋的操作。
[0204]
表2显示了罗伊氏乳杆菌3632治疗对存活的影响的量化。菌株3632 与对照之间的差值为3.3，bmd与对照之间的差值为2.5。与bmd处理的雏鸡相比，菌株3632提供了更高的存活率。
[0205]
表2
[0206][0207]
实施例6.坏死性肠炎
[0208]
罗伊氏乳杆菌每天以108cfu/只在蛋内和饮用水中施用。在第14天给家禽口服灌胃巨型艾美球虫(e.maxima)。在第18、19和20天给家禽灌胃产气荚膜梭菌，每只禽类108cfus。
[0209]
[0210]
[0211][0212]
实施例7
[0213]
对罗伊氏乳杆菌菌株3632和3630进行了全代谢组学分析。这些菌株单独和组合生长，并分析细胞沉淀和培养物上清液中的各种分子。菌株在不含葡萄糖但含有0.5％gos的aof
‑
mrs培养基对照中生长。上清液中的分子代表细胞分泌的分子。
[0214]
样本进行了全非靶向代谢分析。welch t检验和主成分分析(pca)用于分析数据。主成分分析(pca)是一种数学程序，可降低数据的维数，同时保留数据集中的大部分变化。这种方法允许对样品之间的相似性和差异进行视觉评估。预计不同的群体会分开分组，反之亦然。
[0215]
数据如图12
‑
19所示。
[0216]
本发明的实施方式
[0217]
1、一种组合物，包括至少一种：分离的第一罗伊氏乳杆菌菌株和分离的第二罗伊氏乳杆菌菌株；
[0218]
其中与未施用所述组合物的动物相比，当向动物施用有效剂量时，所述组合物改善动物健康。
[0219]
2、根据实施方式1所述的组合物，其中所述第一罗伊氏乳杆菌菌株包括至少一种：
[0220]
与seq id no:26具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，
[0221]
与seq id no:1具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，
[0222]
seq id no:3具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，以及
[0223]
编码与seq id no:8具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列；
[0224]
其中分离的第二罗伊氏乳杆菌菌株包括至少一种：
[0225]
与seq id no：25具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核酸序列，
[0226]
与seq id no:27具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核酸序列，
[0227]
与seq id no:28具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核酸序列，以及
[0228]
与seq id no:29具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核酸序列。
[0229]
3、根据实施方式1～2中任一项所述的组合物，其中所述分离的第一罗伊氏乳杆菌菌株包括与seq id no:26具有至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％或至少99％序列一致性的核酸序列。
[0230]
4、根据实施方式1～3中任一项所述的组合物，其中所述分离的第二罗伊氏乳杆菌菌株包括与seq id no:25具有至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％或至少99％序列一致性的核酸序列。
[0231]
5、根据实施方式1～4中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括分离的第一罗伊氏乳杆菌菌株，所述分离的第一罗伊氏乳杆菌菌株包括与 seq id no:25具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少 99％序列一致性的核酸序列；和包括与seq id no:1具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核酸序列。
[0232]
6、根据实施方式1～5中任一项所述的组合物，其中所述分离的第一罗伊氏乳杆菌菌株包括与seq id no:26具有至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％或至少99％序列一致性的核酸序列；并且
[0233]
其中所述分离的第二罗伊氏乳杆菌菌株包括与seq id no:25具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核酸序列。
[0234]
7、根据实施方式1～6中任一项所述的组合物，其中所述第一乳杆菌菌株和所述第二乳杆菌菌株中的至少一种分泌环状二肽、短链脂肪酸、甜菜碱、二甲基甘氨酸、必需氨基酸、核苷酸、肌醇和和吲哚
‑2‑
酮中的至少一种。
[0235]
8、根据实施方式1～7中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括比率为0.75～1.5:1的分离的第一罗伊氏乳杆菌菌株与分离的第二罗伊氏乳杆菌菌株。
[0236]
9、根据实施方式1～8中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括约等量的分离的第一罗伊氏乳杆菌菌株和分离的第二罗伊氏乳杆菌菌株。
[0237]
10、根据实施方式1～9中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制成动物饲料、饲料添加剂、食品成分、水添加剂、水混合添加剂、消耗性溶液、消耗性喷雾添加剂、消耗性固体、消耗性凝胶、注射剂、或其组合。
[0238]
11、根据实施方式1～10中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括动物饲料。
[0239]
12、根据实施方式11所述的组合物，其中所述组合物包括约102～10
8 cfu/kg组合物的、约104～107cfu/kg组合物的，或大约103～105cfu/kg 组合物的分离的第一罗伊氏乳杆菌菌株。
[0240]
13、根据实施方式10～12中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括约102～108cfu/kg组合物量的、约104～107cfu/kg组合物量的，或大约103～105cfu/kg组合物量的分离的第二罗伊氏乳杆菌菌株。
[0241]
14、根据实施方式10～13中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括约107cfu/kg组合物量的分离的第一罗伊氏乳杆菌菌株。
[0242]
15、根据实施方式10～14中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括约107cfu/kg组合物量的分离的第二罗伊氏乳杆菌菌株。
[0243]
16、根据实施方式1～15中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括水。
[0244]
17、根据实施方式1～16中任一项所述的组合物，其中所述动物是鸟类、家禽、人或非人哺乳动物。
[0245]
18、根据实施方式1～17中任一项所述的组合物，其中所述动物是家禽，增进家禽健康包括降低饲料转化率、增加体重、增加瘦体重、减少胃肠道中致病菌相关损伤的形成、减少致病菌的定殖和降低死亡率中的一种。
[0246]
19、根据实施方式18的组合物，其中所述增进家禽健康包括降低饲料转化率至少1％、至少5％、至少25％或至少50％。
[0247]
20、根据实施方式17～19中任一项所述的组合物，其中所述增进家禽健康包括增加家禽重量至少1％、至少5％、至少25％或至少50％。
[0248]
21、根据实施方式17～20中任一项所述的组合物，其中所述增进家禽健康包括使胃肠道中致病菌相关的损伤形成减少至少1％、至少5％、至少 25％或至少50％。
[0249]
22、根据实施方式17～21中任一项所述的组合物，其中所述增进家禽健康包括将死亡率降低至少1％、至少5％、至少25％或至少50％。
[0250]
23、根据实施方式18～22中任一项所述的组合物，其中所述致病菌包括沙门氏菌、梭菌、弯曲菌、葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌中的至少一种。
[0251]
24、根据实施方式18～23中任一项所述的组合物，其中所述致病菌包括鼠伤寒沙门氏菌、婴儿沙门氏菌、哈达尔沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、新港沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、乳房链球菌、猪链球菌、大肠杆菌、空肠弯曲菌和坏死梭杆菌中的至少一种。
[0252]
25、根据实施方式17～24中任一项所述的组合物，其中所述施用包括卵内施用。
[0253]
26、根据实施方式17～25中任一项所述的组合物，其中所述施用包括喷雾施用。
[0254]
27、根据实施方式17～26中任一项所述的组合物，其中所述家禽是鸡。
[0255]
28、根据实施方式17～27中任一项所述的组合物，其中所述家禽是肉鸡。
[0256]
29、根据实施方式17～27中任一项所述的组合物，其中所述家禽是产蛋鸡。
[0257]
30、根据实施方式1～29中任一项所述的方法，其中与未施用所述组合物的动物相比，施用所述组合物的动物进一步表现出至少一种改善的肠道特征；其中所述改善的肠道特征包括：
[0258]
增加的环二肽、增加的短链脂肪酸、增加的甜菜碱、增加的二甲基甘氨酸、增加的必需氨基酸、增加的核苷酸和增加的肌醇。
[0259]
31、根据实施方式1～30中任一项所述的组合物，其中施用所述组合物的动物表现出胃肠道微生物含量的转变。
[0260]
32、根据实施方式31所述的方法，其中所述转变包括拟杆菌科细菌的量的增加。
[0261]
33、根据实施方式1～32中任一项所述的组合物，其中所述施用包括施用疫苗。
[0262]
34、根据实施方式1～33中任一项所述的组合物，其中所述动物是家禽，在施用所述组合物之前对所述家禽施用疫苗。
[0263]
35、根据实施方式1～34中任一项所述的组合物，其中所述动物是家禽，在所述施用的同时对所述家禽施用疫苗。
[0264]
36、根据实施方式33～35中任一项所述的组合物，其中所述动物是家禽，所述家禽施用疫苗，其中所述疫苗包括有助于预防球虫病的疫苗。
[0265]
37、根据实施方式1～36中任一项所述的组合物，其中所述施用包括施用低聚半乳糖(gos)。
[0266]
38、根据实施方式1～37中任一项的组合物在治疗中的应用。
[0267]
39、根据实施方式1～38中任一项的组合物在改善动物健康中的应用。
[0268]
40、根据实施方式1～39中任一项的组合物在减少动物被致病菌定殖中的应用。
[0269]
41、根据实施方式1～40中任一项的组合物在制备减少动物被致病菌定殖的药物中的应用。
[0270]
42、一种增进动物健康的方法，所述方法包括：
[0271]
向动物施用有效剂量的实施方式1～41中任一项的组合物。
[0272]
43、根据实施方式42的方法，其中所述动物是家禽。
[0273]
44、根据实施方式42～43中任一项所述的方法，其中所述增进动物健康包括减少胃肠道中致病菌相关损伤的形成、减少致病菌的定殖和降低死亡率。
[0274]
45、一种通过向有需要的家禽施用实施方式1～29中任一项的组合物来治疗家禽中坏死性肠炎、改善其作用或预防家禽中坏死性肠炎的方法。