使用长读长测序的染色质作图测定和试剂盒1.本技术要求2019年2月11日提交的美国临时申请序号62/803,829的权益，其全部内容通过引用并入本文。
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：2.本发明涉及用于进行染色质作图测定的方法，该方法使用酶在靶向基因组区域掺入条形码dna，然后进行长读长测序(例如，第三代测序(tgs))。该方法能够使用tgs对染色质靶标作图，且可用于各种各样的元件或特征，包括组蛋白翻译后修饰、染色质相关蛋白、核小体定位和染色质可及性。本发明还涉及用于在包括一个或多个细胞的染色质样品上进行所述方法的试剂盒和试剂。3.发明背景4.基因组作图测定被广泛用于研究染色质的结构和功能。这些包括分析染色质修饰的基因组位置和丰度、染色质相关蛋白(chap)、染色质可及性和核小体定位的测定。染色质修饰包括那些添加到组蛋白或dna的残基上的修饰。核小体上的组蛋白残基可以用多种化学部分进行翻译后修饰(ptm)，包括赖氨酸甲基化、赖氨酸酰化、精氨酸甲基化、丝氨酸磷酸化等，而dna残基则被修饰为具有许多不同的甲基化变体(例如，5‑甲基胞嘧啶、5‑羟甲基胞嘧啶、5‑甲酰基胞嘧啶等)。chap包括与染色质直接相互作用的任何蛋白质，包括与dna直接结合的转录因子和与组蛋白和/或dna相互作用或修饰组蛋白和/或dna的“读取器(reader)”蛋白质和酶。chap还包括通过与调节染色质功能的大分子复合物(如转录调节和染色质重塑复合物)相互作用而间接与染色质相互作用的蛋白质。无核小体的基因组区域与基因转录和激活相关，因为这些染色质区域是转录机制“可及”的，而具有高核小体密度的基因组区域通常与基因失活相关。5.通常使用染色质免疫沉淀，然后进行下一代测序(chip‑seq)来对组蛋白修饰和chap进行全基因组作图。值得注意的是，还开发了超越chip的其他染色质作图方法，包括那些将酶拴系到基因组区域的方法，其导致靶物质的释放、富集和随后分析(例如damid、chic、chec、cut&run和cut&tag)[1‑3]。例如，相关的chic(染色质免疫切割[4,5])和cut&run(使用核酸酶靶向切割和释放(cleavageundertarget&releaseusingnuclease))方法使用ptm特异性或因子特异性抗体将蛋白a和蛋白g‑微球菌核酸酶(pag‑mnase)的融合物拴系到完整细胞或提取的细胞核中的基因组结合位点，然后通过添加钙将其激活以切割dna。pag‑mnase为针对任何ptm或chap的抗体提供切割拴系系统。通过使用固体支持物(例如，凝集素包被的磁珠)来粘附细胞(或细胞核)，简化了cut&run方案(与chic相比)。相似地，cut&tag使用与高活性转座酶(pa‑tn5)拴系的蛋白a，随后控制tn5的激活，为双端测序递送测序衔接子。通过去除文库制备步骤，该方法超灵敏和快速，为来自单细胞的所选靶标的染色质作图提供了一种易驾驭的方法[6]。[0006]有几种商业上可用的用于染色质可及性的全基因组分析的测定。早期的测定使用dnasei，然后进行测序(dnase‑seq)，以鉴定全基因组的核小体耗尽区域(称为dnasei超敏位点；dhs)[7,8]。还开发了一种使用微球菌核酸酶i(mnasei)的相关方法来对核小体定位[9]、染色质可及性的相反面(inverse)作图。虽然这些方法对天然(即未固定的)和固定的细胞均有效，但它们需要大量的酶优化和高细胞需求。dnasei方案的最新进展使用单细胞的dhs作图使得更低的细胞需求是可能的；然而，dhs对＜2％的参考基因组作图，极大限制了其实用性[10]。faire‑seq(甲醛辅助分离调控元件测序)是一种富集核小体耗尽区域的高敏感性方法，但是顾名思义，它需要甲醛固定[11]。atac‑seq使用tn5转座酶，该转座酶优先靶向其测序衔接子有效载荷并相对于不可及区域将其测序衔接头有效载荷传递到可及染色质[12]。该方法由于其简便、快速和细胞需求低而在本领域迅速获得采纳。事实上，atac‑seq测定可在一天内完成，证明了这种方法在临床应用中的潜在用途[13]。[0007]高活性转座酶在染色质作图测定(例如cut&tag和atac‑seq)中的应用极大地提高了测定通量并增强了测定灵敏度。在这些测定中，将包含工程化的dna条形码的转座子在体外激活，其随后可使用pcr扩增，并使用大规模并行第二代测序进行分析[13]。天然转座子编码侧翼有两个19bp序列的转座酶基因，这两个19bp序列通过与转座酶蛋白的相互作用被激活而进行基因组靶向(图1a)。当前的基因组测定(例如，atac‑seq、cut和tag)使用修饰的转座子，这些转座子缺少连接结合激活的转座酶的dna寡聚体的内部dna区域，导致染色质靶向后的双链断裂和dna片段的释放(图1b)[13]。这种修饰有利于第二代大规模平行测序，因为它将染色质分解成更小的dna片段。有关典型cut&tag工作流程的示例见图2。[0008]第三代测序(tgs)平台以相对较低的成本从天然dna生成长读段，从而促进了标准方法无法实现的新应用。tgs平台，如oxford(ont)和pacific(pacbio)，正在从根本上改变基因组学研究领域，增加测序技术的可及性，并提供对人类疾病的重要见解[14]。在纳米孔测序中，dna长片段通过纳米孔，这些平台利用电脉冲的变化来指示不同的dna核苷酸[14]。dna长片段的使用是tgs平台独有的，并且可以对重复区域和复杂dna序列作图[14,15]。事实上，ont纳米孔测序仪可以生成>1mb的读段[16]，并已用于检测乳腺癌[17]和胰腺癌[18]的结构变异。最近的研究还以单细胞分辨率将纳米孔测序应用于小鼠b淋巴细胞的转录组分析[19,20]，显示了tgs可能应用于超低细胞输入。重要的是，由于无需pcr扩增步骤，tgs能够直接检测独特的碱基修饰，包括dna甲基化(5mc)，这对于使用标准第二代测序直接测量来说是挑战性的(图4，左图)[21,22]。这些丰富的数据集使得“多组学”分析(例如，dna序列变异与5mc相结合)是可能的，这有助于描述不同类型的脑肿瘤[23]。结合降低的成本、提高的覆盖率和实时测序能力[23‑26]，tgs正在重新定义现代基因组学研究的界限。然而，该方法不适合大多数染色质作图研究，其导致染色质片段化，且因此最适合于第二代测序。需要实现染色质作图研究的新方法，该方法保持样品完整性并适用于tgs。这些进展将提供低成本测序解决方案以及新型多组学分析(包括dna甲基化和染色质图谱化(chromatinprofiling)分析)。此外，tgs在单细胞应用中的使用可能导致每个细胞的基因组覆盖率增加，这是当前基于sgs的单细胞测定的一个主要限制[22]。[0009]发明概述[0010]当前本领域已知的染色质作图测定在样品处理期间导致染色质片段化(如chip‑seq、atac‑seq、cut&tag等)，使它们非常适合于短读长第二代测序(sgs)。因此，除dna甲基化外，当前的方法与tgs不兼容[27]。保持染色质完整性(即非破坏性)的新作图方法适用于通过tgs对染色质元件(如组蛋白ptm、chap、核小体定位和染色质可及性)作图。与当前的sgs方法相比，这些测定将具有显著优势，包括增强染色质作图测定的可及性而无需昂贵的第二代测序仪(如纳米孔测序仪)，无pcr偏倚，以及下一代多组学分析，如dna甲基化与其他基因组特征(如组蛋白ptm、chap和染色质可及性)的整合。[0011]本发明涉及使用tgs进行染色质作图测定的新方法。该方法使用酶通过非破坏性方式修饰dna来纳入独特的分子标识符，该标识符可用于确定基因组元件的位置以及用于批量(即，一个以上的细胞)或单细胞分析的样品多路复用(samplemultiplexing)。然后可对所得染色质样品进行tgs处理，例如纳米孔或单分子实时测序，其中所述基因组元件的定位(例如组蛋白ptm、chap、核小体位置、染色质可及性等)通过将条形码dna选择性整合到样品染色质中进行作图。可使用pcr扩增的染色质或天然染色质对样品进行测序。样品基因组dna可能来自单个或多个细胞，且在全基因组测序之前，可通过合并样品(每个样品由唯一的dna条形码区分)进行单独或多路复用分析。本文所述方法可用于本领域已知的任何使用酶进行染色质作图研究的全基因组测定，包括但不限于atac‑seq[13]、cut&tag[6]和chil‑seq[28]。该方法将导致长测序读段，从而对基因组中难以映射的区域(如重复区域)获得更好的序列覆盖率。当输入染色质有限时(如单细胞应用)，长读段也将导致更大的测序覆盖率；可在测序前对这些样品进行pcr扩增以增加染色质输入。此外，tgs允许使用含有dna修饰的天然样品，该dna修饰可使用tgs直接测量。这使得多组学分析成为可能，其中在其他基因组元件，例如组蛋白ptm或染色质可及性的背景下评估dna甲基化；这些样品不会被pcr扩增以保留天然dna修饰。值得注意的是，当前基于sgs的方法在pcr扩增后通常会丢失dna甲基化信息。[0012]在一些实施方案中，修饰的tn5可用于对染色质可及性作图。在这些测定中，对高活性tn5加载携带独特标识符序列的转座子，利用tn5酶的典型功能将其dna条形码化有效载荷插入开放染色质处。插入后，使用本领域已知的分子生物学技术(例如，一种使用t4dna聚合酶和t4dna连接酶的联合处理(如先前所做的)[28])修复dna，并使用tgs(例如，pacbio或纳米孔)进行测序。最后，插入的条形码dna被用来映射具有高可及性的染色质位点(类似于atac‑seq)，并可用于在单个测定中分析一个或更多个细胞。在一些实施方案中，将tn5转座子文库组装起来，每个转座子由独特的dna条形码表示。这种文库可用于处理不同的批量样品(即，一个以上的细胞)，然后可对这些样品进行合并、测序并使用其独特的dna条形码去卷积(即，多路复用分析)。使用组合索引方法，这种文库还可用于单细胞分析[29]，其中所述测定在细胞群上进行，然后将该细胞群分到多孔板(如96、384、1536孔)中，每个孔包含约20个细胞。然后，对每个孔进行处理以使用包括第二条形码的衔接子进行天然染色质测序，或者对每个孔使用包括第二条形码的引物进行pcr扩增并使用tgs进行测序。这种方法提供了双条形码签名，该双条形码签名可用于将读段分配至特定的单细胞(sc)。在一些实施方案中，可以使用基于单细胞液滴的方法例如可通过10xgenomics或biorad获得的方法对测定进行配置。在一些实施方案中，对天然染色质进行测序。这些测定可用于进行多组学分析，其中dna修饰与染色质可及性被一起分析。在一些实施方案中，在测序前对样品进行pcr扩增。在一些实施方案中，将使用修饰染色质的其他酶例如整合酶或dna甲基转移酶代替tn5。[0013]在一些实施方案中，修饰的tn5可用于对组蛋白ptm、chap或核小体定位(如pag‑tn5)作图。在这些测定中，，对高活性tn5加载携带独特标识符序列的转座子，利用tn5酶的典型功能插入其dna条形码化有效载荷。与用于染色质可及性作图的修饰的tn5不同，这种修饰的tn5与抗体结合部分融合以实现抗体靶向(如cut&tag[pag‑mtn5]中使用的修饰形式的pag‑tn5)。本测定中使用的抗体可以靶向任何染色质元件或结合蛋白，如组蛋白ptm、核小体、chap和dna甲基化。插入后，使用本领域已知的分子生物学技术(例如，一种使用t4dna聚合酶和t4dna连接酶的联合处理(如先前所做的)[28])修复dna，并使用tgs(例如，纳米孔或单分子实时测序)进行测序。最后，插入条形码化dna用于对抗体靶向的染色质区作图，生成类似于cut&tag的染色质图，且可用于在单个测定中分析一个或更多个细胞。关于可如何使用修饰的pag‑tn5(pag‑mtn5)将条形码整合到染色质中，然后进行dna修复和tgs的工作流程示例见图4。tn5可以与任何蛋白结合部分，如蛋白a、蛋白g、生物素、gst等融合。在一些实施方案中，组装了pag‑mtn5转座子的文库，每个转座子由独特的dna条形码表示。这种文库可用于处理多个批量样品(即，一个以上的细胞)，然后可以对这些样品进行合并、测序，并可使用每个样品dna条形码对数据去卷积(即，多路复用分析)。dna条形码用于指示抗体靶向的基因组区域，如ptm或chap。使用组合索引方法，这种文库还可用于单细胞分析[29]，其中所述测定在细胞群上进行，然后将细胞群分到多孔板(如96、384、1536孔)中，每个孔包含约20个细胞。然后，对每个孔使用包含第二条形码(即分子标识符)的引物进行pcr扩增，并使用tgs进行测序。这种方法提供了双条形码签名，该双条形码签名可用于将读段分配至特定的sc。在一些实施方案中，可以使用基于单细胞液滴的方法，例如可通过10xgenomics或biorad商业化获得的方法对测定进行配置。在一些实施方案中，对天然染色质进行测序。这些测定可用于进行多组学分析，其中dna修饰与其他染色质特征(例如，组蛋白ptm或chap)被一起分析。在一些实施方案中，将样品在测序前进行pcr扩增，这可能对低细胞输入或单细胞应用有用。在一些实施方案中，使用修饰染色质的其他酶例如整合酶或dna甲基转移酶代替tn5。[0014]因此，本发明的一个方面涉及一种合成转座子，其包含在其5'和3'端连接到由转座酶识别的侧翼区域的dna条形码区域，其中所述合成转座子不编码转座酶。[0015]本发明的另一方面涉及转座体，其包括本发明的合成转座子和结合到每个末端反向重复序列的转座酶。[0016]本发明的另一方面涉及包含两个或更多个本发明的合成转座子和/或两个或更多个本发明的转座体的文库，其中所述每个合成转座子包含独特的dna条形码。[0017]本发明的另一方面涉及试剂盒，其包括本发明的合成转座子、转座体或文库。[0018]本发明的另一方面涉及用于染色质作图的方法，其包括：[0019]a)使酶靶向样品中染色质的特定特征；[0020]b)激活所述酶以改变或标记所述特征的局部dna；[0021]c)制备用于测序的染色质；[0022]d)使用长读长测序对所述染色质进行测序；和[0023]e)基于改变的或标记的dna的位置对染色质特征的位置作图。[0024]在一些实施方案中，这些方法可用于对染色质可及性作图。在一些实施方案中，这些方法可用于对染色质修饰、染色质相关蛋白或核小体定位作图。在一些实施方案中，这些方法是多组学测定的一部分。[0025]在一些实施方案中，本发明所述的方法还可包括使用测序结果来比较健康组织和疾病组织之间的染色质特征的步骤、预测疾病状态、监测对治疗的响应，和/或分析肿瘤异associates,inc.andjohnwiley&sons,inc.,newyork)。[0038]本文提及的所有出版物、专利申请、专利、核苷酸序列、氨基酸序列和其他参考文献均通过引用以其整体并入本文。[0039]如在本发明的说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确说明。[0040]如本文使用的，“和/或”涉及并涵盖一个或更多个相关所列项目的任一个和所有可能的组合，以及当在替代方案中解释时无组合(“或”)。[0041]而且，本发明还考虑到，在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文所述的任何特征或特征的组合。[0042]此外，当指可测量的值如本发明的化合物或剂的量、剂量、时间、温度等时，本文所用的术语“约”意指涵盖指定量的±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。[0043]本文所用的与核酸、蛋白质相关的术语“主要由……组成”意指核酸或蛋白质不包含除所述元件以外的显著改变(例如，超过约1％、5％或10％)该核酸或蛋白质的感兴趣的功能的任何元件。[0044]如本文使用的，术语“多肽”涵盖肽和蛋白质二者，除非另有说明。[0045]“核酸”或“核苷酸序列”是核苷酸碱基序列，且可以是rna、dna或dna‑rna杂交序列(包括天然存在和非天然存在的核苷酸)，但优选单链或双链dna序列。[0046]如本文使用的，“分离的”核酸或核苷酸序列(例如，“分离的dna”或“分离的rna”)是指与天然存在的微生物或病毒的至少一些其他成分分离或基本上不含与天然存在的微生物或病毒的至少一些其他成分的核酸或核苷酸序列，所述天然存在的微生物或病毒的至少一些其他成分例如细胞或病毒的结构组分，或通常发现的与所述核酸或核苷酸序列缔和的其他多肽或核酸。[0047]同样，“分离的”多肽是指与天然存在的微生物或病毒的至少一些其他组分分离或基本上不含天然存在的微生物或病毒的至少一些其他组分的多肽，所述天然存在的微生物或病毒的至少一些其他组分例如细胞或病毒的结构组分，或通常发现的与所述多肽缔和的核酸或其他多肽。[0048]所谓“基本上保留”一种特性(例如，活性或其他可测量特征)，是指保留了该特性的至少约75％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。[0049]术语“合成的”是指自然界中不存在的化合物、分子或复合物。[0050]术语“dna条形码”指可用于明确识别其所位于其中的dna分子的核酸序列。条形码的长度决定了1个文库中可以存在多少个独特序列。例如，1个核苷酸(nt)的条形码可以为4个文库成员提供代码，2nt条形码为16个变体提供代码，3nt条形码为64个变体提供代码，4nt条形码为256个变体提供代码，5nt条形码为1024个变体提供代码等等。条形码可以是单链(ss)dna或双链(ds)dna或其组合。[0051]本发明的第一个方面涉及合成转座子，其主要由或由在其5'和3'端连接到转座酶识别的侧翼区域的dna条形码区域组成，其中所述合成转座子不编码转座酶。转座酶“识别”的侧翼区域是由同源转座酶特异性结合的区域，且其功能是将转座子插入到dna中。在一些实施方案中，侧翼区域与天然存在的dna转座子中发现的区域相同或来源于该区域，例如tn5的19bp混合末端(me)。在一些实施方案中，侧翼区域可具有7‑40个核苷酸的长度，例如，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40个核苷酸或其中的任何范围。在一些实施方案中，侧翼区域包括末端反向重复序列，其侧翼是短的正向重复序列。在一些实施方案中，侧翼区域包括dna条形码。dna条形码可具有少于400、300、200或50个核苷酸的长度。在一些实施方案中，dna条形码可具有至少6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，可对侧翼区域中的一个或更多个核苷酸进行修饰，例如通过甲基化或例如用生物素标记。[0052]本发明的另一方面涉及转座体，其包括本发明的合成转座子和结合到每个末端反向重复序列的转座酶。在一些实施方案中，转座酶可以是野生型转座酶，例如tn5、mu、is5、is91、tn552、ty1、tn7、tn/o、mariner、pelement、tn3、tn1o或tn903。在一些实施方案中，转座酶由野生型转座酶修饰而来，例如突变的高活性转座酶。此类修饰的转座酶在本领域是已知的。在一些实施方案中，转座酶是tn5或修饰的tn5，例如包括一种或多种突变e54k、m56a或l372p的高活性tn5。[0053]本发明的另一方面涉及包含两个或更多个本发明的合成转座子和/或两个或更多个本发明的转座体的文库，其中每个合成转座子包含独特的dna条形码。在一些实施方案中，文库可包括5、10、50、100、250、500、1000、5000个或更多个转座子和/或转座体，每个转座子和/或转座体具有独特的dna条形码。[0054]本发明的另一方面涉及试剂盒，其包含本发明的合成转座子、转座体和/或文库。在一些实施方案中，试剂盒还包括识别合成转座子序列的一种或更多种转座酶。试剂盒还可包括用于实施本发明所述方法的其它组分，包括但不限于酶、抗体、核苷酸、珠、缓冲液、容器、说明书等。[0055]本发明的另一方面涉及用于染色质作图的方法，其包括：[0056]a)使酶靶向样品中染色质的特定特征；[0057]b)激活所述酶以改变或标记所述特征的局部dna；[0058]c)制备用于测序的染色质；[0059]d)使用长读长测序对染色质进行测序；和[0060]e)基于改变的或标记的dna的位置对染色质特征的位置作图。[0061]待在本发明的测定中被作图的染色质可以来自任一来源，包括器官、组织、细胞或无细胞成分。由于测定的灵敏度，待用染色质的量可能会有很大差异。在一些实施方案中，样品包括来自少于1000、500、100、10或5个细胞的染色质。在一些实施方案中，样品包括来自1个细胞的染色质。[0062]根据样品的大小，本发明的方法可以在任一规模上进行。在一些实施方案中，这些步骤在多孔板的孔中进行。在一些实施方案中，例如使用基于单细胞液滴的方法或组合索引方法，这些步骤在单细胞规模上进行。[0063]包括待在本发明的测定中作图的染色质的样品可以包括包含染色质的细胞或细胞核。在一些实施方案中，将细胞或细胞核附着于固体支持物，以便于在该方法的步骤期间被操作。固体支持物可以是但不限于孔或珠，例如磁珠。在一些实施方案中，不将细胞或细胞核附着于固体支持物。[0064]在一些实施方案中，将细胞或细胞核透化以增强组分触及染色质。例如，将细胞用洋地黄皂甙(例如约0.01％洋地黄皂甙)透化。在一些实施方案中，未将细胞或细胞核透化。[0065]在一些实施方案中，样品包括已从细胞或细胞核分离的染色质。[0066]包括待作图的染色质的样品可以来自任一来源。在一些实施方案中，染色质从生物样品中获得。生物样品可以是但不限于血液、血清、血浆、尿液、唾液、精液、前列腺液、乳头抽吸液、泪液、汗液、粪便、颊拭子、脑脊液、细胞裂解物样品、羊水、胃肠液、活检组织、淋巴液或脑脊液。[0067]在一些实施方案中，染色质来自病变组织或样品。在一些实施方案中，染色质来自非病变组织或样品。在一些实施方案中，染色质来自外周组织或细胞，例如外周血单核细胞。[0068]在一些实施方案中，染色质来自培养的细胞，例如细胞系或原代细胞。在一些实施方案中，染色质来自疾病或障碍的动物模型。在一些实施方案中，染色质来自患有或疑似患有疾病或障碍的受试者，例如患者。[0069]本发明的方法可用于进行任一类型的染色质作图，例如，对任一种感兴趣的特定特征，包括但不限于染色质修饰的基因组位置和丰度、染色质相关蛋白(chap)、染色质可及性和核小体定位作图。[0070]在一方面，本发明所述的方法包括用于染色质可及性作图的方法。用于染色质可及性作图的酶可以是任一能够在可接近的地方可检测地改变或标记dna的酶。在一种实施方案中，酶是整合酶或dna甲基转移酶。在一种实施方案中，在染色质可及性作图中使用的酶是转座酶。在一些实施方案中，转座酶可以是野生型转座酶，例如tn5、mu、is5、is91、tn552、ty1、tn7、tn/o、mariner、p元件(pelement)、tn3、tn1o或tn903。在一些实施方案中，转座酶由野生型转座酶修饰而来，例如突变的高活性转座酶。这些修饰的转座酶在本领域是已知的。在一些实施方案中，转座酶是tn5或修饰的tn5。[0071]在一些实施方案中，该方法包括在可将合成转座子插入染色质的条件下，将包含染色质的样品与本发明的合成转座子、转座体或文库接触。[0072]在一些实施方案中，步骤b)中酶的活化包括添加酶活性所需的因子，例如，通过添加诸如钙或镁的离子。一旦激活，酶改变或标记所述特征的局部dna。本文中的术语“局部”是指该特征内5‑30个核苷酸(例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30或其中的任一范围，例如小于6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29，或30个核苷酸)或3‑18nm(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18nm或其中的任一范围，例如，小于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18nm)的dna。[0073]在一些实施方案中，该方法还包括在测序之前，例如使用dna聚合酶(如dna聚合酶i)和dna连接酶(如t4dna连接酶)修复转座子连接位点。[0074]在对染色质可及性作图的方法的一些实施方案中，使两个或更多个样品与合成转座子接触，并使每个样品与包含独特dna条形码的不同合成转座子接触。在一些实施方案中，使2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、250、500或1000个或更多种样品各自与包含独特dna条形码的不同合成转座子接触。在一些实施方案中，在步骤b)之后可合并两个或更多个样品。[0075]在一方面，本发明所述的方法包括用于对染色质修饰、染色质相关蛋白或核小体定位作图的方法。在一些实施方案中，染色质修饰是组蛋白修饰(例如，翻译后修饰)、组蛋白变体或dna修饰(例如，转录后修饰)。[0076]组蛋白ptm可以是任何想要测量的ptm。在一些实施方案中，组蛋白ptm是但不限于，丝氨酸和丙氨酸的n‑乙酰化；丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化；赖氨酸的n‑巴豆酰化、n‑酰基化；赖氨酸的n6‑甲基化、n6,n6‑二甲基化、n6,n6,n6‑三甲基化；精氨酸的ω‑n‑甲基化、对称‑二甲基化、不对称‑二甲基化；精氨酸的瓜氨酸化；赖氨酸的泛素化；赖氨酸的类泛素化；丝氨酸和苏氨酸的o‑甲基化，精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的adp核糖基化，或其任意组合。[0077]本领域已知几种天然存在的组蛋白变体，且它们中的任一种或多种均可包括在核小体中。组蛋白变体包括但不限于h3.3、h2a.bbd、h2a.z.1、h2a.z.2、h2a.x、mh2a1.1、mh2a1.2、mh2a2、th2b或其任何组合。[0078]dna转录后修饰可以是任何想要测量的修饰。在一些实施方案中，dna转录后修饰是5‑甲基胞嘧啶、5‑羟甲基胞嘧啶、5‑甲酰基胞嘧啶、5‑羧基胞嘧啶、3‑甲基胞嘧啶或其任意组合。[0079]染色质相关蛋白可以是任一想要测量的染色质相关蛋白。在一些实施方案中，染色质相关蛋白是转录因子、组蛋白结合蛋白或dna结合蛋白。[0080]在对染色质修饰、染色质相关蛋白或核小体定位作图的方法中，使酶靶向样品中染色质的特定特征的步骤包括使染色质与特异性结合该特征的抗体、适体或识别剂接触。本发明的方法中使用的抗体、适体或识别剂可以是特异性识别并结合靶标(例如抗原)的任一试剂。术语“抗体”包括其抗原结合片段，如scfv、fab、fv、fab’、f(ab’)2片段、dab、vhh、纳米抗体(nanobody)、v(nar)或最小识别单位。[0081]对于对染色质修饰、染色质相关蛋白或核小体定位作图的方法，酶与结合抗体、适体或识别剂的蛋白质，例如抗体结合蛋白连接。在一些实施方案中，抗体结合蛋白可以是但不限于蛋白a、蛋白g、蛋白a和蛋白g的融合物、蛋白l或蛋白y。[0082]在对染色质修饰、染色质相关蛋白或核小体定位作图时使用的酶可以是任一能够在可接近的地方可检测地改变或标记dna的酶。在一种实施方案中，酶是整合酶或dna甲基转移酶。在一种实施方案中，用于染色质可及性作图的酶是转座酶。在一些实施方案中，转座酶可以是野生型转座酶，例如tn5、mu、is5、is91、tn552、ty1、tn7、tn/o、mariner、p元件、tn3、tn1o或tn903。在一些实施方案中，转座酶由野生型转座酶修饰而来，例如突变的高活性转座酶。这些修饰的转座酶在本领域是已知的。在一些实施方案中，转座酶是tn5或已修饰的tn5。[0083]在一些实施方案中，该方法包括在可将合成转座子插入染色质的条件下，使包含染色质的样品与本发明的合成转座子、转座体或文库接触。[0084]在一些实施方案中，步骤b)中酶的激活包括添加酶活性所需的因子，例如，通过添加诸如钙或镁的离子。[0085]在一些实施方案中，该方法还包括在测序之前例如使用dna聚合酶(如dna聚合酶i)和dna连接酶(如t4dna连接酶)修复转座子连接位点。[0086]在对染色质修饰、染色质相关蛋白或核小体定位作图的方法的一些实施方案中，使两个或更多个样品与合成转座子接触，并使每个样品与包含独特dna条形码的不同合成转座子接触。在一些实施方案中，使2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、250、500或1000个或更多个样品各自与包含独特dna条形码的不同合成转座子接触。在一些实施方案中，在步骤b)之后可合并两个或更多个样品。[0087]对于本发明的所有方法，这些方法可以使用组合细胞索引技术进行。在一些实施方案中，该方法可以在细胞群上进行，并且步骤c)包括将细胞群分组，并处理细胞以使用包括第二条形码的衔接子进行测序，或者使用包括第二条形码的引物进行pcr扩增，使得每个细胞包括双条形码签名。在一些实施方案中，每组细胞可包括少于约1000、500、250、100或50个细胞，例如约10至约30个细胞，例如约20个细胞。[0088]对于本发明的所有方法，这些方法可以作为多组学过程的一部分进行，其中例如，基于长读长测序信息，在相同的样品上进行其他分析。在一些实施方案中，这些方法还包括分析染色质中的dna修饰，例如dna甲基化。[0089]如本文所定义，“长读长测序”是指在单分子水平上工作并提供至少10kb(例如，至少50kb或100kb)的序列读长的第三代测序技术。长读长测序可以通过本领域已知的任一方法进行。在一些实施方案中，长读长测序包括纳米孔测序，例如可从oxford(ont)获得的技术。在一些实施方案中，长读长测序包括单分子实时测序，例如可从pacific获得的技术。[0090]在本发明的方法的一些实施方案中，这些方法还包括在测序前对样品进行机械或酶切剪切的步骤。在其它实施方案中，测序前不进行剪切。[0091]在本发明的方法的一些实施方案中，这些方法还包括在测序前扩增样品的步骤。在其他实施方案中，测序前不进行扩增，从而能够分析天然dna修饰。[0092]从本发明的方法获得的结果可用于任一目的，其中关于染色质结构和/或修饰的信息(例如表观遗传变化)将是有用的。在一些实施方案中，这些方法还可包括使用测序结果比较健康组织和疾病组织之间染色质特征的步骤。在一些实施方案中，这些方法还可包括使用测序结果预测疾病状态的步骤。在一些实施方案中，这些方法还可包括使用测序结果监测对治疗的响应的步骤。在一些实施方案中，这些方法还可包括使用测序结果分析肿瘤异质性的步骤。[0093]本发明的方法可用于检测和定量染色质中表观遗传修饰的存在。特异性结合表观遗传修饰的抗体、适体或识别剂可用于检测和定量多个基因组位点的染色质元件或修饰。[0094]本发明的方法可用于确定和定量患有疾病或障碍的受试者的染色质表观遗传状态。特异性结合一种或多种可能与受试者的疾病或障碍有关的表观遗传修饰的抗体、适体或识别剂可用于检测和定量多个基因组位点的染色质元件或修饰。通过这种方法，人们可以确定患有疾病或障碍(例如肿瘤)的受试者是否具有已知与肿瘤类型相关的表观遗传修饰。[0095]本发明的方法可用于监测受试者的染色质表观遗传状态随时间的变化。该方法可用于确定表观状态是否随时间而改善、稳定或恶化。该方法的步骤可以根据需要重复多次，以监测表观遗传修饰状态的变化，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、50或100次或更多次。该方法可以定期(例如，每天、每周、每月、每年)或根据需要重复。该方法可以例如，在受试者的治疗性治疗之前、期间和/或之后、在诊断受试者的疾病或障碍之后、作为确定受试者的疾病或障碍诊断的一部分、在确定受试者发展疾病或障碍的风险后重复，或想要监测多个基因组位点的染色质元件或修饰的可能变化的任何其它情况。[0096]本发明的方法可用于测量表观遗传靶向药物的中靶活性。这些方法可在施用表观遗传靶向药物之前、期间和/或之后实施，以确定药物改变受试者表观遗传状态的能力。[0097]本发明的方法可用于监测表观遗传疗法在患有与表观遗传修饰相关的疾病或障碍的受试者中的有效性。[0098]表观遗传疗法是那些旨在改变蛋白质(如组蛋白)或dna的表观遗传状态的疗法。表观遗传疗法的一个实例包括赖氨酸脱乙酰酶抑制剂(以前称为组蛋白脱乙酰酶抑制剂)(例如，伏立诺他(辛二酰苯胺异羟肟酸)、ci‑994(tacedinaline)、ms‑275(恩替诺特)、bmp‑210、m344、nvp‑laq824、lbh‑529(帕比司他)、mgcd0103(莫替司他)、pxd101(贝利司他)、cbha、pci‑24781、itf2357、丙戊酸、曲古抑菌素a和丁酸钠)，其用于治疗皮肤t细胞淋巴瘤(ctcl)或用于治疗血液肿瘤和实体瘤，包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肾癌和膀胱癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤的临床试验。表观遗传疗法的另一个实例是组蛋白乙酰基转移酶抑制剂(例如，表没食子儿茶素‑3‑没食子酸酯、山竹子素(garcinol)、漆树酸、cpth2、姜黄素、mb‑3、mg149、c646和罗米地辛)。表观遗传疗法的另一个实例是dna甲基转移酶抑制剂(例如，氮杂胞苷、地西他滨、泽布拉林(zebularine)、咖啡酸、绿原酸、表没食子儿茶素、肼苯哒嗪、普鲁卡因胺、普鲁卡因和rg108)，其已经批准用于治疗急性髓系白血病、骨髓异常增生综合征和慢性髓单核细胞白血病以及用于实体瘤治疗的临床试验。其他表观遗传疗法包括但不限于，赖氨酸甲基转移酶(例如，pinometostat、他泽司他(tazometostat)、cpi‑1205)；赖氨酸去甲基化酶(如ory1001)；精氨酸甲基转移酶(如epz020411)；精氨酸脱亚胺酶(如gsk484)；和异柠檬酸脱氢酶(例如，恩西地平(enasidenib)、艾伏尼布(ivosidenib))。参见fischle等人,acschem.biol.11:689(2016)；dewoskin等人,naturerev.12:661(2013)；campbell等人,j.clin.invest.124:64(2014)；和brown等人,futuremed.chem.7:1901(2015)；每篇均通过引用整体并入本文。[0099]该方法的步骤可以根据需要重复多次，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、50或100次或更多次，以监测治疗的有效性。该方法可以定期(例如，每天、每周、每月、每年)或根据需要重复，例如，直至治疗性治疗结束。该方法可以例如在受试者的治疗性治疗之前、期间和/或之后重复，例如在每次给予治疗之后重复。在一些实施方案中，治疗持续进行，直到本发明的方法显示治疗有效。[0100]本发明的方法可用于基于受试者中染色质的表观遗传状态，为患有与表观遗传修饰相关的疾病或障碍的受试者选择合适的治疗。[0101]这些方法可以应用于例如已诊断为患有或疑似患有与表观遗传修饰相关的疾病或障碍的受试者。表位的表观遗传状态的确定可以指示，表位的状态已被修饰，并且应给予受试者表观遗传治疗以纠正该修饰。相反，确定表位的状态未被修饰将指示表观遗传疗法预计不会有效，且应避免。例如，确定一个特定基因组位点已经乙酰化或脱乙酰化可能指示用组蛋白脱乙酰酶抑制剂治疗是合适的。同样，确定特定基因组位点已被高甲基化或低甲基化可能指示用dna甲基转移酶抑制剂治疗是合适的。[0102]本发明的方法可用于基于受试者染色质的表观遗传状态，确定患有与表观遗传修饰相关的疾病或障碍的受试者的预后。[0103]在某些情况下，表位的表观遗传状态指示与表观遗传修饰相关的疾病或障碍的预后。因此，确定已诊断为患有或疑似患有与表观遗传修饰相关的疾病或障碍的受试者的表位表观遗传状态可能有助于确定受试者的预后。许多这样的实例在本领域是已知的。一个实例是前列腺癌和谷胱甘肽s转移酶p1(gstp1)基因启动子、腺瘤性息肉病大肠杆菌(apc)基因、基因pitx2、c1orf114和gabre～mir‑452～mir‑224，以及三基因标志物组aox1/c1orf114/hapln3和13基因标记物组gstp1、grasp、tmp4、kcnc2、tbx1、zdhhc1、capg、rarres2、sac3d1、nkx2‑1、fam107a、slc13a3、filip1l的高甲基化。另一个实例是前列腺癌和组蛋白ptm，包括但不限于与前列腺肿瘤复发的显著更高的风险相关的增加的h3k18乙酰化和h3k4二甲基化，与肿瘤分期相关h4k12乙酰化和h4r3二甲基化，以及与有肿瘤复发风险的低级别前列腺癌患者相关h3k9二甲基化。另一个实例是乳腺癌患者的总生存率与基因creb5、exph5、znf775、adcy3和adma8中cpg的甲基化状态之间的联系。另一个实例是胶质母细胞瘤和基因如egfr、pten、nf1、pik3r1、rb1、pdgfra和qki的内含子区域的高甲基化。另一个实例是结肠癌的不良预后和cnrip1、fbn1、ina、mal、snca和spg20基因的启动子的甲基化状态。[0104]本发明的方法可用于基于受试者的染色质表观遗传状态，鉴定与表观遗传修饰相关的疾病或障碍的生物标志物。[0105]在该方法中，病变组织的生物样品可以取自许多患有疾病或障碍的患者，并确定一个或更多个表位的表观遗传状态。然后可以使用本领域已熟知的分析技术鉴定表位状态与发生、阶段、亚型、预后等之间的相关性。[0106]在任一种本发明的方法中，与表观遗传修饰相关的疾病或障碍可以是癌症、中枢神经系统(cns)疾病、自身免疫疾病、炎性疾病或传染病。[0107]癌症可以是任何良性或恶性的异常生长的细胞，包括但不限于听神经瘤、急性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、腺癌、肾上腺癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、间变型星形细胞瘤、血管肉瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、支气管癌、宫颈癌、宫颈增生、脊索瘤、绒毛膜癌、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、囊腺癌、胚胎癌、子宫内膜癌、内皮肉瘤、室管膜瘤、上皮癌、食管癌、原发性血小板增多、尤文氏肿瘤(ewing’stumor)、纤维肉瘤、泌尿生殖系统癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质肉瘤、毛细胞白血病、头颈癌、成血管细胞瘤、肝癌、霍奇金氏病、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、白血病、脂肪肉瘤、肺癌、淋巴管内皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、淋巴管肉瘤、淋巴瘤、恶性类癌、恶性高钙血症、恶性黑色素瘤、恶性胰腺胰岛瘤、肥大细胞瘤、髓样癌、髓母细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿、骨髓瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、少突胶质细胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状腺肉瘤、乳头状肉瘤、松果体瘤、真性红细胞增多症、原发性脑癌、原发性巨球蛋白血症、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、皮脂腺肉瘤、精原细胞瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、汗腺癌、滑膜瘤、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌和肾母细胞瘤。[0108]cns疾病包括遗传性疾病、神经变性疾病、精神疾病和肿瘤。cns的示例性疾病包括但不限于，阿尔茨海默氏病、帕金森病、享廷顿病、卡纳万病、利氏病、雷夫叙姆病、图雷特综合征、原发性侧索硬化、肌萎缩侧索硬化、进行性肌萎缩、皮克氏病、肌营养不良症、多发性硬化、重症肌无力、宾斯旺格病、脊髓或头部损伤所致创伤、泰‑萨克斯病、莱施‑奈恩病(lesch‑nyandisease)、癫痫、脑梗塞、精神障碍包括心境障碍(例如抑郁症、双相情感障碍、持续性情感障碍、继发性心境障碍、躁狂症、躁狂性精神病)、精神分裂症、分裂情感障碍、类精神分裂症、药物依赖(例如，酒精中毒和其它物质依赖)、神经症(例如，焦虑、强迫症、躯体形式障碍、分离性障碍、悲伤、产后抑郁症)、精神病(例如，幻觉和错觉、未另作说明的精神病(精神病nos))、痴呆、衰老、妄想症、注意力缺陷障碍、性心理障碍、睡眠障碍、疼痛障碍、进食或体重障碍(例如，肥胖症、恶病质、神经性厌食症和贪食症)、累及视网膜、后束和视神经的眼科疾病(例如色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病和其他视网膜变性疾病、葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性、青光眼)以及cns的癌症和肿瘤(例如垂体瘤)。[0109]自身免疫性和炎性疾病和障碍包括但不限于，心肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、亚急性细菌性心内膜炎、抗肾小球基底膜肾炎、间质性膀胱炎、狼疮性肾炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎，抗合成酶综合征、鼻窦炎、牙周炎、动脉粥样硬化、皮炎、变态反应、过敏性鼻炎、过敏性气道炎症、慢性阻塞性肺疾病、嗜酸粒细胞性肺炎、嗜酸细胞性食管炎、嗜酸性粒细胞增多综合征、移植物抗宿主病、特应性皮炎、结核病、哮喘、慢性消化性溃疡、斑秃、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性黄体酮皮炎、自身免疫性荨麻疹、大疱性类天疱疮、瘢痕性类天疱疮、疱疹样皮炎、盘状红斑狼疮、获得性大疱性表皮松解、结节性红斑、妊娠性类天疱疮、化脓性汗腺炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、线状iga病、硬斑病、寻常型天疱疮、急性痘疮样苔藓样糠疹(pityriasislichenoidesetvarioliformisacuta)、穆‑哈二氏病(mucha‑habermanndisease)、银屑病、系统性硬皮病、白癜风、阿狄森氏病、自身免疫性多内分泌腺病综合征1型、自身免疫性多内分泌腺病综合征2型、自身免疫性多内分泌腺病综合征3型、自身免疫性胰腺炎、1型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、ord's甲状腺炎、graves病、自身免疫性卵巢炎、子宫内膜异位症、自身免疫性睾丸炎、干燥综合征、自身免疫性肠病、乳糜泻、克罗恩病、肠易激综合征、憩室炎、显微镜结肠炎、溃疡性结肠炎、抗磷脂综合征、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性淋巴增生综合征、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性血小板减少性紫癜、冷凝集素病、原发性混合冷球蛋白血症、evans综合征、恶性贫血、纯红细胞再生障碍、血小板减少症、痛性肥胖症、成人发作的斯提耳氏病、强直性脊柱炎、crest综合征、药物诱导的狼疮、附着点炎相关的关节炎、嗜酸细胞性筋膜炎、费尔蒂综合征、igg4相关疾病、青少年关节炎、莱姆病(慢性)、混合性结缔组织病、回纹型风湿症、parry‑romberg综合征、牧师特纳综合征(parsonage‑turnersyndrome)、银屑病关节炎、反应性关节炎、复发性多软骨炎、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施尼茨勒综合征、系统性红斑狼疮、未分化结缔组织病、皮肌炎、纤维肌痛、肌炎、重症肌无力、神经性肌强直、副肿瘤性小脑变性、多发性肌炎、急性播散性脑脊髓炎、急性运动轴突神经病、抗n‑甲基‑d‑天冬氨酸受体脑炎、balo同心圆性硬化、bickerstaff脑炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、格林‑巴利综合征、桥本脑病、特发性炎性脱髓鞘疾病、lambert‑eaton肌无力综合征、多发性硬化症、oshtoran综合征、链球菌感染相关的儿童自身免疫性神经精神障碍(pandas)、进行性炎性神经病、不宁腿综合征、僵人综合征、sydenham舞蹈病、横贯性脊髓炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性葡萄膜炎、科根综合征、graves眼病、中间葡萄膜炎、木样结膜炎、蚕蚀性角膜溃疡(mooren’sulcer)、视神经脊髓炎、眼球阵挛‑肌阵挛综合征、视神经炎、巩膜炎、susac综合征、交感性眼炎、tolosa‑hunt综合征、自身免疫性内耳疾病、梅尼埃病、白塞病、嗜酸性肉芽肿性多血管炎、巨细胞动脉炎、肉芽肿性血管炎(granulomatosiswithpolyangiitis)、iga血管炎、川崎病、白细胞破坏性脉管炎、狼疮血管炎、类风湿性血管炎、显微镜下多血管炎、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、荨麻疹性血管炎、血管炎和原发性免疫缺陷。[0110]本文使用的术语“传染病”是指与致病因子(infectiousagent)感染相关的任何疾病。致病因子的实例包括但不限于病毒和微生物(例如细菌、寄生虫、原生动物、隐孢子虫)。病毒包括但不限于，嗜肝dna病毒科(hepadnaviridae)，包括甲型、乙型、丙型、丁型、戊型、己型、庚型肝炎等；黄病毒科(flaviviridae)，包括人丙型肝炎病毒(hcv)、黄热病病毒(yellowfevervirus)和登革热病毒(dengueviruses)；逆转录病毒科(retroviridae)，包括人类免疫缺陷病毒(hiv)和人类嗜t淋巴细胞病毒(htlv1和htlv2)；疱疹病毒科(herpesviridae)，包括单纯疱疹病毒(hsv‑1和hsv‑2)、eb病毒(ebv)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)、水痘‑带状疱疹病毒(vzv)、人疱疹病毒6(hhv‑6)、人疱疹病毒8(hhv‑8)和疱疹b病毒(herpesbvirus)；乳多空病毒科(papovaviridae)，包括人乳头瘤病毒(humanpapillomaviruses)；弹状病毒科(rhabdoviridae)，包括狂犬病病毒(rabiesvirus)；副粘病毒科(paramyxoviridae)，包括呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus)；呼肠孤病毒科(reoviridae)，包括轮状病毒(rotaviruses)；布尼亚病毒科(bunyaviridae)，包括汉坦病毒(hantaviruses)；丝状病毒科(filoviridae)，包括埃博拉病毒(ebolavirus)；腺病毒科(adenoviridae)；细小病毒科(parvoviridae)，包括细小病毒b‑19(parvovirusb‑19)；沙粒病毒科(arenaviridae)，包括拉沙病毒(lassavirus)；正粘病毒科(orthomyxoviridae)，包括流感病毒(influenzaviruses)；痘病毒科(poxviridae)，包括orf病毒、传染性软疣病毒(molluscumcontageosumvirus)、天花病毒(smallpoxvirus)和猴痘病毒(monkeypoxvirus)；披膜病毒科(togaviridae)，包括委内瑞拉马脑炎病毒(venezuelanequineencephalitisvirus)；冠状病毒科(coronaviridae)，包括冠状病毒(coronaviruses)，如严重急性呼吸综合征(sars)病毒；和小核糖核酸病毒科(picornaviridae)，包括脊髓灰质炎病毒(polioviruses)；鼻病毒(rhinoviruses)；环形病毒属(orbiviruses)；微小脱氧核糖核酸病毒(picodnaviruses)；脑心肌炎病毒(emv)；副流感病毒(parainfluenzaviruses)、腺病毒(adenoviruses)、柯萨奇病毒(coxsackieviruses)、埃可病毒(echoviruses)、麻疹病毒(rubeolavirus)、风疹病毒(rubellavirus)、人乳头状瘤病毒(humanpapillomaviruses)、犬瘟热病毒(caninedistempervirus)、犬传染性肝炎病毒(caninecontagioushepatitisvirus)、猫杯状病毒(felinecalicivirus)、猫鼻气管炎病毒(felinerhinotracheitisvirus)、tge病毒(tgevirus)(猪)、口蹄疫病毒(footandmouthdiseasevirus)、猿猴病毒5、人副流感病毒2型、人偏肺病毒(humanmetapneuomovirus)、肠道病毒(enteroviruses)和任何其他现在已知或以后鉴定的致病病毒(参见，例如，fundamentalvirology，fields等人，编辑，第三版，lippincott‑raven，纽约，1996年，其全部内容通过引用并入本文以用于获取致病病毒的教导)。[0111]病原微生物包括但不限于立克次体(rickettsia)、衣原体(chlamydia)、嗜性衣原体(chlamydophila)、分枝杆菌(mycobacteria)、梭菌属(clostridia)、棒状杆菌(corynebacteria)、支原体(mycoplasma)、脲原体(ureaplasma)、军团菌属(legionella)、志贺氏菌属(shigella)、沙门氏菌属(salmonella)、致病性大肠杆菌(escherichiacoli)的种、bordatella、奈瑟氏球菌属(neisseria)、密螺旋体属(treponema)、芽孢杆菌属(bacillus)、嗜血杆菌属(haemophilus)、莫拉菌属(moraxella)、弧菌属(vibrio)、葡萄球菌属的种(staphylococcusspp.)、链球菌属的种(streptococcusspp.)、弯曲杆菌属的种(campylobacterspp.)、疏螺旋体属的种(borreliaspp.)、钩端螺旋体属的种(leptospiraspp.)、埃立克体属的种(erlichiaspp.)、克雷伯氏杆菌属的种(klebsiellaspp.)、假单胞菌属的种(pseudomonasspp.)、螺杆菌属的种(helicobacterspp.)以及现在已知或以后鉴定的任何其它病原微生物(参见，例如，microbiology，davis等人，编辑，第4版，lippincott，纽约，1990年，其全部内容通过引用并入本文以用于获取病原微生物的教导)。微生物的具体实例包括但不限于幽门螺杆菌(helicobacterpylori)、肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae)、沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)、解脲脲原体(ureaplasmaurealyticum)、肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)、肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)、绿色链球菌(streptococcusviridans)、粪肠球菌(enterococcusfaecalis)、脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseriameningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(neisseriagonorrhoeae)、梅毒螺旋体(treponemapallidum)、炭疽芽孢杆菌(bacillusanthracis)、伤寒沙门氏菌(salmonellatyphi)、霍乱弧菌(vibriocholera)、鼠疫巴斯德氏菌(pasteurellapestis)(鼠疫耶尔森氏菌(yersiniapestis))、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、空肠弯曲菌(campylobacterjejuni)、艰难梭菌(clostridiumdifficile)、肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)、结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)、伯氏疏螺旋体(borreliaburgdorferi)、杜克雷嗜血杆菌(haemophilusducreyi)、白喉杆菌(corynebacteriumdiphtheria)、百日咳杆菌(bordetellapertussis)、副百日咳博德特氏菌(bordetellaparapertussis)、支气管败血博德特氏菌(bordetellabronchiseptica)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenza)、单核细胞增生李斯特菌(listeriamonocytogenes)、福氏志贺氏菌(shigellaflexneri)、嗜吞噬细胞无形体(anaplasmaphagocytophilum)、产肠毒素大肠杆菌(escherichiacoli)和埃及血吸虫(schistosomahaematobium)。[0112]在一些实施方案中，疾病或障碍包括但不限于肥胖、糖尿病、心脏病、自闭症、脆性x综合征、atr‑x综合征、天使人综合征、普拉德‑威利综合征、韦伯综合征(beckwithwiedemannsyndrome)、雷特综合征、rubinstein‑taybi综合征、科勒综合征(coffin‑lowrysynthrome)、免疫缺陷‑着丝粒不稳定‑面部异常综合征、α‑地中海贫血、白血病、德朗热综合征(corneliadelanguesyndrome)、歌舞伎综合征(kabukisyndrome)、进展型系统性硬化病和心脏肥大。[0113]已经描述了本发明，将在以下实施例中更详细地解释本发明，本文包含的实施例仅用于说明的目的，并不旨在限制本发明。实施例[0114]实施例1：使用长读长测序的染色质可及性测定[0115]本实施例描述了使用本发明进行染色质可及性测定的操作方案。[0116]第一部分：cona珠活化[0117]1.轻轻重悬cona珠(伴刀豆球蛋白a)，并将11μl/样品转移至1.5ml管中进行分批处理。[0118]2.将管放在磁铁上，直到浆液变清，然后用移液管去除上清液(supe)。[0119]3.加入100μl/样品的冷珠活化缓冲液，并用移液管混合。将管放在磁铁上，直到浆液变清，然后用移液管去除上清液。[0120]4.重复上一步，共洗涤两次。[0121]5.将珠重悬于11μl/样品的冷珠活化缓冲液中。针对不同的细胞类型和/或抗体，将活化的cona珠分到不同的试管中。[0122]6.将10μl/样品的活化珠浆等分至8联排管(8‑striptube)中。将珠保持在冰上，直到需要。[0123]第二部分：使细胞与活化珠结合[0124]7.在1.5ml管中于室温下以600g离心3分钟，收获50万个细胞/样品，并轻轻倒出上清液。[0125]8.将细胞重悬于100μl/样品的rt洗涤缓冲液中；在rt以600g离心3分钟；轻轻倒出上清液。[0126]9.重复上一步，用洗涤缓冲液共进行两次洗涤。[0127]10.将细胞以100μl/样品重悬于rt洗涤缓冲液中，并将100μl洗涤的细胞等分至每个8联排管(含有10μl活化珠)中。轻轻涡旋(设置#7)以混合。[0128]11.在rt孵育细胞：珠的浆10分钟(细胞将吸附到活化的cona珠上)。[0129]12.将管放在磁铁上，直到浆液变清，然后用移液器去除上清液。[0130]13.当珠在磁铁上时，将200μl冷的洗涤缓冲液直接加入到每个样品的珠上，然后用移液器去除上清液。[0131]14.重复上一步，共洗涤2次，并去除上清液。[0132]15.向每个8联排管中加入50μl冷wash300缓冲液，用移液器混合。[0133]第三部分：结合条形码化pag‑mtn5[0134]16.向每个样品中加入2.5μl条形码化pag‑mtn5，并轻轻涡旋。[0135]17.将样品在振动器(nutator)上在rt孵育1小时。[0136]18.使管在冰上的磁铁中冷却，直到浆液变清，并用移液器去除上清液。[0137]19.当珠在磁铁上时，将200μl冷wash300缓冲液直接加入到每个样品的珠上，然后用移液管去除上清液。[0138]20.重复上一步，共洗涤两次，并去除上清液。[0139]第四部分：靶向染色质标记[0140]21.向每个样品加入5μl冷tagmg10缓冲液，并用移液管混合。[0141]22.将8联排管在热循环仪上37℃孵育1小时。[0142]23.将管放在磁铁上，直到浆液变清，并用移液管去除上清液。[0143]24.加入5.5μltagstop缓冲液[0144]第五部分：dna修复和连接[0145]25.使用100μl0.2％sds洗涤样品，然后使用1xpbs洗涤，共洗涤2次。[0146]26.在4℃以1000g离心5分钟，并去除上清液。[0147]27.将样品于含10udna聚合酶i(neb#m0209s)和30μmdntp的200μldna修复和连接缓冲液中37℃孵育2小时。[0148]28.通过向反应中加入20μl的0.5medta和2μg的rnasea来终止反应，并在37℃孵育30分钟。[0149]29.在4℃以1000g离心5分钟，并去除上清液。[0150]第六部分：用于纳米孔测序的高mw基因组dna纯化(使用qiagengenomic‑tips试剂盒；货号10223)[0151]30.向每个样品加入1ml缓冲液g2，并用移液管混合。[0152]31.加入25μl的qiagen蛋白酶储备液(货号19157)，并在50℃孵育30‑60分钟。[0153]32.用1ml缓冲液qbt平衡qiagengenomic‑tip20/g，并允许通过重力流排空qiagengenomictip。[0154]33.以最大速度涡旋样品10秒，并将其应用于平衡的qiagengenomic‑tip。使其通过重力流进入树脂。[0155]34.用3x1ml缓冲液qc洗涤qiagengenomic‑tip。[0156]35.用2x1ml缓冲液qf(预热至50℃)洗脱基因组dna。[0157]36.通过向洗脱的dna中加入1.4ml(0.7体积)室温异丙醇来沉淀dna。[0158]37.立即混合并在4℃以4300g离心至少15分钟。小心去除上清液。[0159]38.用1ml的冷70％乙醇洗涤离心后的dna沉淀。短暂涡旋，并在4℃以4400g离心10分钟。小心去除上清液，不要搅动沉淀。风干5‑10分钟。[0160]39.将0.1‑2ml的dna重悬于1ml无菌te(10mmtris‑hcl，1mmedta，ph8.0)中，于室温在平台振荡器上过夜。[0161]第七部分：dna的质量控制检查[0162]40.使用nanodrop测定dna纯度。od260/280比率应为至少1.8，且od260/230应在2.0‑2.2之间。[0163]41.使用2100生物分析仪和适当的生物分析仪试剂盒(如agilentdna7500或12000，货号5067‑1508)测定平均片段大小。[0164]42.使用荧光分析法(invitrogen)测定dna质量；如果在oxford纳米孔测序仪上测序，则应为至少1μg(或100‑200fmol)。[0165]第八部分：用于纳米孔测序的dna文库的制备(使用牛津纳米孔连接测序试剂盒，货号sqk‑lsk109和操作说明书gde_9063_v109_revq_14aug2019，以及用于oxfordnanopore连接测序的配套模块，货号e7180s)[0166]43.将1mgdna转移至dnalobind管的终体积50ml无核酸酶的水中。[0167]44.进行末端制备和dna修复。将47mldna与来自用于oxfordnanopore连接测序的配套模块(货号e7180s)的dna修复酶和缓冲液相结合。[0168]45.按照牛津纳米孔技术操作说明书(gde_9063_v109_revq_14aug2019)所述，使用ampurexp珠在末端制备后纯化dna。[0169]46.使用qubit荧光计对1μl的纯化dna定量。[0170]47.进行衔接头连接。按照牛津纳米孔技术操作说明书(gde_9063_v109_revq_14aug2019)所述，将60μl纯化dna与衔接子混合物(来自牛津纳米孔连接测序试剂盒)、t4dna连接酶(neb)和缓冲液合并。[0171]48.按照牛津纳米孔技术操作说明书(gde_9063_v109_revq_14aug2019)所述，在衔接头连接后，使用ampurexp珠纯化dna。[0172]49.使用qubit荧光计对1μl的纯化dna定量。[0173]第九部分：纳米孔测序，使用牛津纳米孔技术minion纳米孔测序仪(注：可与其他牛津纳米孔测序仪例如和一起使用)。[0174]50.准备流通池：用冲洗缓冲液和拴系物冲洗液(flushtether)的混合物冲洗minion流通池(r9.4.1)。牛津纳米孔技术操作说明书(gde_9063_v109_revq_14aug2019)中详细描述了步骤。[0175]51.制备包含dna文库、测序缓冲液和加载的珠的测序前混合物。对于r9.4.1minion流通池，oxfordnanopore建议使用5‑50fmol测序文库中的dna。[0176]52.根据oxfordnanopore制造说明书，加载minion流通池。[0177]53.开始测序运行：通过usb3.0端口将minion连接到计算机。使用minknow软件运行minion测序反应，选择试剂盒(sqk‑lsk109)，“快速”碱基调用选项，并将运行时长设置为8小时。将输出设置为fastq和fast5文件。注：运行时长可随着流通池的类型、多路复用样品和测定设置的其他变化而变化。[0178]第十部分：生物信息学分析[0179]54.将测序数据传输到epi2me软件以进行生物信息学分析。[0180]55.考虑到插入的转座子/标识符序列，将测序数据映射到人类基因组grch38(或最新的参考基因组)。值得注意的是，通过pag‑mtn5插入转座子在插入的转座子每侧产生9bp重复[31]。因此，识别该标识符序列和/或这些重复位点的算法允许用户确定转座位点和ptm在染色质上的位置。[0181]oxfordnanopore发布了专门为纳米孔测序数据中的条形码识别和去卷积设计的软件(即albacore)，该软件将用于生物信息学流程的开发。[0182]条形码化pag‑mtn5‑加载有条形码化转座子的蛋白a/g融合高活性tn5[0183]缓冲液[0184]珠活化缓冲液[0185]20mmhepes，ph7.9[0186]10mmkcl[0187]1mmcacl2[0188]1mmmncl2[0189]过滤除菌[0190]洗涤缓冲液[0191]20mmhepes，ph7.5[0192]150mmnacl[0193]0.5mm亚精胺[0194]1xroche完全蛋白酶抑制剂‑mini(cpi‑mini)，不含edta(roche货号11836170001)，1片/10ml[0195]过滤除菌[0196]wash300缓冲液[0197]20mmhepes，ph7.5[0198]300mmnacl[0199]tagmg10缓冲液[0200]20mmhepesph7.5，300mmnacl[0201]10mmmgcl2[0202]0.5m亚精胺(0.5μl/ml)[0203]1xcpi‑mini[0204]tagstop缓冲液[0205]10mmtaps，ph8.5[0206]0.03％sds[0207]dna修复和连接缓冲液[0208]10mmtris‑hcl[0209]10mmmgcl2[0210]50mmnacl[0211]1mmdtt[0212]缓冲液g2[0213]800mm盐酸胍[0214]30mmtris·cl，ph8.0[0215]30mmedta，ph8.0[0216]5％吐温‑20[0217]0.5％tritonx‑100[0218]缓冲液qbt(平衡缓冲液)[0219]750mmnacl[0220]50mmmops，ph7.0[0221]15％异丙醇[0222]0.15％tritonx‑100[0223]缓冲液qc(洗涤缓冲液)[0224]1.0mnacl[0225]50mmmops，ph7.0[0226]15％异丙醇[0227]缓冲液qf(洗脱缓冲液)[0228]1.25mnacl[0229]50mmtris·cl，ph8.5[0230]15％异丙醇[0231]实施例2：使用长读长测序进行翻译后修饰和染色质相关蛋白测定[0232]第一部分：cona珠活化[0233]1.轻轻重悬cona珠(伴刀豆球蛋白a)，并将11μl/样品转移至1.5ml管中进行分批处理。[0234]2.将管放在磁铁上，直到浆液变清，并用移液管去除上清液(supe)。[0235]3.加入100μl/样品的冷珠活化缓冲液，并用移液管混合。将管放在磁铁上，直到浆液变清，并用移液管去除上清液。[0236]4.重复上一步，共洗涤两次。[0237]5.将珠重悬于11μl/样品的冷珠活化缓冲液中。针对不同的细胞类型和/或抗体，将活化的cona珠分到不同的管中。[0238]6.将10μl/样品的活化珠浆等分至8联排管中。将珠保持在冰上，直到需要。[0239]第二部分：使细胞与活化珠结合[0240]7.在1.5ml管中于室温下以600g离心3分钟，收获50万个细胞/样品，并轻轻倒出上清液。[0241]8.将细胞重悬于100μl/样品的rt洗涤缓冲液中；在rt以600g离心3分钟；轻轻倒出上清液。[0242]9.重复上一步，用洗涤缓冲液共进行两次洗涤。[0243]10.将细胞以100μl/样品重悬于rt洗涤缓冲液中，并将100μl洗涤的细胞等分至每个8联排管(含有10μl活化珠)中。轻轻涡旋(设置#7)以混合。[0244]11.在rt孵育细胞：珠的浆10分钟(细胞将吸附到活化的cona珠上)。[0245]第三部分：结合一抗(ptm或chap)[0246]12.将管放在磁铁上，直到浆液变清，并用移液管去除上清液。[0247]13.向每个样品中加入50μl冷的抗体缓冲液并轻轻涡旋。[0248]14.向每个样品中加入0.5μl抗体并轻轻涡旋。[0249]15.将8联排管在振动器上4℃孵育过夜。[0250]第四部分：结合二抗[0251]16.将管放在磁铁上，直到浆液变清，然后用移液管去除上清液。[0252]17.向每个样品中加入50μl冷的洗涤缓冲液并轻轻涡旋。[0253]18.向每个样品中加入0.5μl二抗(1:100稀释)并轻轻涡旋。[0254]19.将8联排管在振动器上室温孵育30分钟。[0255]20.将管放在磁铁上，直到浆液变清，并用移液管去除上清液。[0256]21.当珠在磁铁上时，将200μl冷的洗涤缓冲液直接加入到每个样品的珠上，然后用移液管去除上清液。[0257]22.重复上一步，共洗涤两次，并去除上清液。[0258]23.向每个8联排管中加入50μl冷wash300缓冲液，用移液管混合。[0259]第五部分：结合条形码化pag‑mtn5[0260]23.向每个样品中加入2.5μl条形码化pag‑mtn5，并轻轻涡旋。[0261]24.将样品在振动器上室温孵育1小时。[0262]25.将管放在磁铁上，直到浆液变清，并用移液管去除上清液。[0263]26.当珠在磁铁上时，将200μl冷的wash300缓冲液直接加入到每个样品的珠上，然后用移液管去除上清液。[0264]27.重复上一步，共洗涤两次，并去除上清液。nanopore连接测序的配套模块，货号e7180s)[0292]50.将1μgdna转移到dnalobind管的终体积50μl无核酸酶的水中。[0293]51.进行末端制备和dna修复:将以下47μldna与来自用于oxfordnanopore连接测序的配套模块(货号e7180s)的dna修复酶和缓冲液结合。[0294]52.按照牛津纳米孔技术操作说明书(gde_9063_v109_revq_14aug2019)所述，使用ampurexp珠在末端制备后纯化dna。[0295]53.使用qubit荧光计定量1μl纯化的dna。[0296]54.进行衔接子连接:按照牛津纳米孔技术操作说明书(gde_9063_v109_revq_14aug2019)所述，将60μl纯化dna与衔接子混合物(来自牛津纳米孔连接测序试剂盒)、t4dna连接酶(neb)和缓冲液合并。[0297]55.按照牛津纳米孔技术操作说明书(gde_9063_v109_revq_14aug2019)所述，在衔接头连接后，使用ampurexp珠纯化dna。[0298]56.使用qubit荧光计定量1μl纯化的dna。[0299]第十部分：纳米孔测序，使用牛津纳米孔技术minion纳米孔测序仪(注：可与其他牛津纳米孔测序仪例如和一起使用)。[0300]57.准备流通池：用冲洗缓冲液和拴系物冲洗液的混合物冲洗minion流通池(r9.4.1)。牛津纳米孔技术操作说明书(gde_9063_v109_revq_14aug2019)中详细描述了步骤。[0301]58.制备包含dna文库、测序缓冲液和加载的珠的测序前混合物。对于r9.4.1minion流通池，oxfordnanopore建议使用5‑50fmol测序文库中的dna。[0302]59.根据oxfordnanopore制造说明书，加载minion流通池。[0303]60.开始测序运行：通过usb3.0端口将minion连接到计算机。使用minknow软件运行minion测序反应，选择试剂盒(sqk‑lsk109)，“快速”碱基调用选项，并将运行时长设置为8小时。将输出设置为fastq和fast5文件。注：运行时长可随着流通池的类型、多路复用样品和测定设置的其他变化而变化。[0304]第十一部分：生物信息学分析[0305]61.将测序数据传输到epi2me软件进行生物信息学分析。[0306]62.考虑到插入的转座子/标识符序列，将测序数据映射到人类基因组grch38(或最新的参考基因组)。值得注意的是，通过pag‑mtn5插入转座子在插入的转座子每侧产生9bp重复[31]。因此，识别该标识符序列和/或这些重复位点的算法允许用户确定转座位点和ptm在染色质上的位置。[0307]oxfordnanopore发布了专门为纳米孔测序数据中的条形码识别和去卷积设计的软件(即albacore)，该软件将用于生物信息学流程的开发。[0308]条形码化pag‑mtn5‑加载有条形码化转座子的蛋白a/g融合高活性tn5[0309]缓冲液[0310]珠活化缓冲液[0311]20mmhepes，ph7.9[0312]10mmkcl[0313]1mmcacl2[0314]1mmmncl2[0315]过滤灭菌[0316]洗涤缓冲液[0317]洗涤缓冲液 2mmedta 0.01％洋地黄皂甙[0318]抗体缓冲液[0319]20mmhepesph7.5，150mmnacl[0320]2mmedta[0321]0.1％bsa[0322]0.5m亚精胺(0.5μl/ml)[0323]1xcpi‑mini[0324]wash300缓冲液[0325]20mmhepes，ph7.5[0326]300mmnacl[0327]tagmg10缓冲液[0328]20mmhepesph7.5，300mmnacl[0329]10mmmgcl2[0330]0.5m亚精胺(0.5μl/ml)[0331]1xcpi‑mini[0332]tagstop缓冲液[0333]10mmtaps，ph8.5[0334]0.03％sds[0335]dna修复和连接缓冲液[0336]10mmtris‑hcl[0337]10mmmgcl2[0338]50mmnacl[0339]1mmdtt[0340]缓冲液g2[0341]800mm盐酸胍[0342]30mmtris·cl，ph8.0[0343]30mmedta，ph8.0[0344]5％吐温‑20[0345]0.5％tritonx‑100[0346]缓冲液qbt(平衡缓冲液)[0347]750mmnacl[0348]50mmmops，ph7.0[0349]15％异丙醇[0350]0.15％tritonx‑100sitesinsinglecellsandffpetissuesamples.nature，2015.528(7580)：p.142‑6.(pubmedpmid：26605532)(pmc4697938)[0371]11.gircsi，p.g.，etal.，faire(formaldehyde‑assistedisolationofregulatoryelements)isolatesactiveregulatoryelementsfromhumanchromatin.genomeres，2007.17(6)：p.877‑85.(pubmedpmid：17179217)(pmc1891346)[0372]12.buenrostro，j.d.，etal.，atac‑seq：amethodforassayingchromatinaccessibilitygenome‑wide.currprotocmolbiol，2015.109：p.21291‑9.(pubmedpmid：25559105)(pmc4374986)[0373]13.buenrostro，j.d.，etal.，transpositionofnativechromatinforfastandsensitiveepigenomicprofilingofopenchromatin，dna‑bindingproteinsandnucleosomeposition.natmethods，2013.10(12)：p.1213‑8.(pubmedpmid：24097267)(pmc3959825)[0374]14.ameur，a.，w.p.kloosterman，andm.s.hestand，single‑moleculesequencing：towardsclinicalapplications.trendsbiotechnol，2019.37(1)：p.72‑85.(pubmedpmid：30115375)[0375]15.vandijk，e.l.，etal.，thethirdrevolutioninsequencingtechnology.trendsgenet，2018.34(9)：p.666‑681.(pubmedpmid：29941292)[0376]16.belser，c.，etal.，chromosome‑scaleassembliesofplantgenomesusingnanoporelongreadsandopticalmaps.natplants，2018.4(11)：p.879‑887.(pubmedpmid：30390080)[0377]17.minervini，c.f.，etal.，mutationalanalysisinbcr‑abl1positiveleukemiabydeepsequencingbasedonnanoporeminiontechnology.expmolpathol，2017.103(1)：p.33‑37.(pubmedpmid：28663031)[0378]18.norris，a.l.，etal.，nanoporesequencingdetectsstructuralvariantsincancer.cancerbiolther，2016.17(3)：p.246‑53.(pubmedpmid：26787508)(pmc4848001)[0379]19.volden，r.，etal.，improvingnanoporereadaccuracywithther2c2methodenablesthesequencingofhighlymultiplexedfull‑lengthsingle‑cellcdna.procnatlacadsciusa，2018.115(39)：p.9726‑9731.(pubmedpmid：30201725)(pmc6166824)[0380]20.byrne，a.，etal.，nanoporelong‑readrnaseqrevealswidespreadtranscriptionalvariationamongthesurfacereceptorsofindividualbcells.natcommun，2017.8：p.16027.(pubmedpmid：28722025)(pmc5524981)[0381]21.kurdyukov，s.andm.bullock，dnamethylationanalysis：choosingtherightmethod.biology(basel)，2016.5(1).(pubmedpmid：26751487)(pmc4810160)[0382]22.ludwig，c.h.andl.bintu，mappingchromatinmodificationsatthesinglecelllevel.development，2019.146(12).(pubmedpmid：31249006)(pmc6602357)[0383]23.euskirchen，p.，etal.，same‑daygenomicandepigenomicdiagnosisofbraintumorsusingreal‑timenanoporesequencing.actaneuropathol，2017.134(5)：p.691‑703.(pubmedpmid：28638988)(pmc5645447)[0384]24.quick，j.，etal.，rapiddraftsequencingandreal‑timenanoporesequencinginahospitaloutbreakofsalmonella.genomebiol，2015.16：p.114.(pubmedpmid：26025440)(pmc4702336)[0385]25.quick，j.，etal.，real‑time，portablegenomesequencingforebolasurveillance.nature，2016.530(7589)：p.228‑232.(pubmedpmid：26840485)(pmc4817224)[0386]26.faria，n.r.，etal.，establishmentandcryptictransmissionofzikavirusinbrazilandtheamericas.nature，2017.546(7658)：p.406‑410.(pubmedpmid：28538727)(pmc5722632)[0387]27.rand，a.c.，etal.，mappingdnamethylationwithhigh‑throughputnanoporesequencing.natmethods，2017.14(4)：p.411‑413.(pubmedpmid：28218897)(pmc5704956)[0388]28.harada，a.，etal.，achromatinintegrationlabellingmethodenablesepigenomicprofilingwithlowerinput.natcellbiol，2019.21(2)：p.287‑296.(pubmedpmid：30532068)[0389]29.cusanovich，d.a.，etal.，multiplexsinglecellprofilingofchromatinaccessibilitybycombinatorialcellularindexing.science，2015.348(6237)：p.910‑4.(pubmedpmid：25953818)(pmc4836442)[0390]30.lareau，c.a.，etal.，droplet‑basedcombinatorialindexingformassive‑scalesingle‑cellchromatinaccessibility.natbiotechnol，2019.37(8)：p.916‑924.(pubmedpmid：31235917)[0391]31.reznikoff，w.s.，transposontn5.annurevgenet，2008.42：p.269‑86.(pubmedpmid：18680433)当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：2.本发明涉及用于进行染色质作图测定的方法，该方法使用酶在靶向基因组区域掺入条形码dna，然后进行长读长测序(例如，第三代测序(tgs))。该方法能够使用tgs对染色质靶标作图，且可用于各种各样的元件或特征，包括组蛋白翻译后修饰、染色质相关蛋白、核小体定位和染色质可及性。本发明还涉及用于在包括一个或多个细胞的染色质样品上进行所述方法的试剂盒和试剂。3.发明背景4.基因组作图测定被广泛用于研究染色质的结构和功能。这些包括分析染色质修饰的基因组位置和丰度、染色质相关蛋白(chap)、染色质可及性和核小体定位的测定。染色质修饰包括那些添加到组蛋白或dna的残基上的修饰。核小体上的组蛋白残基可以用多种化学部分进行翻译后修饰(ptm)，包括赖氨酸甲基化、赖氨酸酰化、精氨酸甲基化、丝氨酸磷酸化等，而dna残基则被修饰为具有许多不同的甲基化变体(例如，5‑甲基胞嘧啶、5‑羟甲基胞嘧啶、5‑甲酰基胞嘧啶等)。chap包括与染色质直接相互作用的任何蛋白质，包括与dna直接结合的转录因子和与组蛋白和/或dna相互作用或修饰组蛋白和/或dna的“读取器(reader)”蛋白质和酶。chap还包括通过与调节染色质功能的大分子复合物(如转录调节和染色质重塑复合物)相互作用而间接与染色质相互作用的蛋白质。无核小体的基因组区域与基因转录和激活相关，因为这些染色质区域是转录机制“可及”的，而具有高核小体密度的基因组区域通常与基因失活相关。5.通常使用染色质免疫沉淀，然后进行下一代测序(chip‑seq)来对组蛋白修饰和chap进行全基因组作图。值得注意的是，还开发了超越chip的其他染色质作图方法，包括那些将酶拴系到基因组区域的方法，其导致靶物质的释放、富集和随后分析(例如damid、chic、chec、cut&run和cut&tag)[1‑3]。例如，相关的chic(染色质免疫切割[4,5])和cut&run(使用核酸酶靶向切割和释放(cleavageundertarget&releaseusingnuclease))方法使用ptm特异性或因子特异性抗体将蛋白a和蛋白g‑微球菌核酸酶(pag‑mnase)的融合物拴系到完整细胞或提取的细胞核中的基因组结合位点，然后通过添加钙将其激活以切割dna。pag‑mnase为针对任何ptm或chap的抗体提供切割拴系系统。通过使用固体支持物(例如，凝集素包被的磁珠)来粘附细胞(或细胞核)，简化了cut&run方案(与chic相比)。相似地，cut&tag使用与高活性转座酶(pa‑tn5)拴系的蛋白a，随后控制tn5的激活，为双端测序递送测序衔接子。通过去除文库制备步骤，该方法超灵敏和快速，为来自单细胞的所选靶标的染色质作图提供了一种易驾驭的方法[6]。[0006]有几种商业上可用的用于染色质可及性的全基因组分析的测定。早期的测定使用dnasei，然后进行测序(dnase‑seq)，以鉴定全基因组的核小体耗尽区域(称为dnasei超敏位点；dhs)[7,8]。还开发了一种使用微球菌核酸酶i(mnasei)的相关方法来对核小体定位[9]、染色质可及性的相反面(inverse)作图。虽然这些方法对天然(即未固定的)和固定的细胞均有效，但它们需要大量的酶优化和高细胞需求。dnasei方案的最新进展使用单细胞的dhs作图使得更低的细胞需求是可能的；然而，dhs对＜2％的参考基因组作图，极大限制了其实用性[10]。faire‑seq(甲醛辅助分离调控元件测序)是一种富集核小体耗尽区域的高敏感性方法，但是顾名思义，它需要甲醛固定[11]。atac‑seq使用tn5转座酶，该转座酶优先靶向其测序衔接子有效载荷并相对于不可及区域将其测序衔接头有效载荷传递到可及染色质[12]。该方法由于其简便、快速和细胞需求低而在本领域迅速获得采纳。事实上，atac‑seq测定可在一天内完成，证明了这种方法在临床应用中的潜在用途[13]。[0007]高活性转座酶在染色质作图测定(例如cut&tag和atac‑seq)中的应用极大地提高了测定通量并增强了测定灵敏度。在这些测定中，将包含工程化的dna条形码的转座子在体外激活，其随后可使用pcr扩增，并使用大规模并行第二代测序进行分析[13]。天然转座子编码侧翼有两个19bp序列的转座酶基因，这两个19bp序列通过与转座酶蛋白的相互作用被激活而进行基因组靶向(图1a)。当前的基因组测定(例如，atac‑seq、cut和tag)使用修饰的转座子，这些转座子缺少连接结合激活的转座酶的dna寡聚体的内部dna区域，导致染色质靶向后的双链断裂和dna片段的释放(图1b)[13]。这种修饰有利于第二代大规模平行测序，因为它将染色质分解成更小的dna片段。有关典型cut&tag工作流程的示例见图2。[0008]第三代测序(tgs)平台以相对较低的成本从天然dna生成长读段，从而促进了标准方法无法实现的新应用。tgs平台，如oxford(ont)和pacific(pacbio)，正在从根本上改变基因组学研究领域，增加测序技术的可及性，并提供对人类疾病的重要见解[14]。在纳米孔测序中，dna长片段通过纳米孔，这些平台利用电脉冲的变化来指示不同的dna核苷酸[14]。dna长片段的使用是tgs平台独有的，并且可以对重复区域和复杂dna序列作图[14,15]。事实上，ont纳米孔测序仪可以生成>1mb的读段[16]，并已用于检测乳腺癌[17]和胰腺癌[18]的结构变异。最近的研究还以单细胞分辨率将纳米孔测序应用于小鼠b淋巴细胞的转录组分析[19,20]，显示了tgs可能应用于超低细胞输入。重要的是，由于无需pcr扩增步骤，tgs能够直接检测独特的碱基修饰，包括dna甲基化(5mc)，这对于使用标准第二代测序直接测量来说是挑战性的(图4，左图)[21,22]。这些丰富的数据集使得“多组学”分析(例如，dna序列变异与5mc相结合)是可能的，这有助于描述不同类型的脑肿瘤[23]。结合降低的成本、提高的覆盖率和实时测序能力[23‑26]，tgs正在重新定义现代基因组学研究的界限。然而，该方法不适合大多数染色质作图研究，其导致染色质片段化，且因此最适合于第二代测序。需要实现染色质作图研究的新方法，该方法保持样品完整性并适用于tgs。这些进展将提供低成本测序解决方案以及新型多组学分析(包括dna甲基化和染色质图谱化(chromatinprofiling)分析)。此外，tgs在单细胞应用中的使用可能导致每个细胞的基因组覆盖率增加，这是当前基于sgs的单细胞测定的一个主要限制[22]。[0009]发明概述[0010]当前本领域已知的染色质作图测定在样品处理期间导致染色质片段化(如chip‑seq、atac‑seq、cut&tag等)，使它们非常适合于短读长第二代测序(sgs)。因此，除dna甲基化外，当前的方法与tgs不兼容[27]。保持染色质完整性(即非破坏性)的新作图方法适用于通过tgs对染色质元件(如组蛋白ptm、chap、核小体定位和染色质可及性)作图。与当前的sgs方法相比，这些测定将具有显著优势，包括增强染色质作图测定的可及性而无需昂贵的第二代测序仪(如纳米孔测序仪)，无pcr偏倚，以及下一代多组学分析，如dna甲基化与其他基因组特征(如组蛋白ptm、chap和染色质可及性)的整合。[0011]本发明涉及使用tgs进行染色质作图测定的新方法。该方法使用酶通过非破坏性方式修饰dna来纳入独特的分子标识符，该标识符可用于确定基因组元件的位置以及用于批量(即，一个以上的细胞)或单细胞分析的样品多路复用(samplemultiplexing)。然后可对所得染色质样品进行tgs处理，例如纳米孔或单分子实时测序，其中所述基因组元件的定位(例如组蛋白ptm、chap、核小体位置、染色质可及性等)通过将条形码dna选择性整合到样品染色质中进行作图。可使用pcr扩增的染色质或天然染色质对样品进行测序。样品基因组dna可能来自单个或多个细胞，且在全基因组测序之前，可通过合并样品(每个样品由唯一的dna条形码区分)进行单独或多路复用分析。本文所述方法可用于本领域已知的任何使用酶进行染色质作图研究的全基因组测定，包括但不限于atac‑seq[13]、cut&tag[6]和chil‑seq[28]。该方法将导致长测序读段，从而对基因组中难以映射的区域(如重复区域)获得更好的序列覆盖率。当输入染色质有限时(如单细胞应用)，长读段也将导致更大的测序覆盖率；可在测序前对这些样品进行pcr扩增以增加染色质输入。此外，tgs允许使用含有dna修饰的天然样品，该dna修饰可使用tgs直接测量。这使得多组学分析成为可能，其中在其他基因组元件，例如组蛋白ptm或染色质可及性的背景下评估dna甲基化；这些样品不会被pcr扩增以保留天然dna修饰。值得注意的是，当前基于sgs的方法在pcr扩增后通常会丢失dna甲基化信息。[0012]在一些实施方案中，修饰的tn5可用于对染色质可及性作图。在这些测定中，对高活性tn5加载携带独特标识符序列的转座子，利用tn5酶的典型功能将其dna条形码化有效载荷插入开放染色质处。插入后，使用本领域已知的分子生物学技术(例如，一种使用t4dna聚合酶和t4dna连接酶的联合处理(如先前所做的)[28])修复dna，并使用tgs(例如，pacbio或纳米孔)进行测序。最后，插入的条形码dna被用来映射具有高可及性的染色质位点(类似于atac‑seq)，并可用于在单个测定中分析一个或更多个细胞。在一些实施方案中，将tn5转座子文库组装起来，每个转座子由独特的dna条形码表示。这种文库可用于处理不同的批量样品(即，一个以上的细胞)，然后可对这些样品进行合并、测序并使用其独特的dna条形码去卷积(即，多路复用分析)。使用组合索引方法，这种文库还可用于单细胞分析[29]，其中所述测定在细胞群上进行，然后将该细胞群分到多孔板(如96、384、1536孔)中，每个孔包含约20个细胞。然后，对每个孔进行处理以使用包括第二条形码的衔接子进行天然染色质测序，或者对每个孔使用包括第二条形码的引物进行pcr扩增并使用tgs进行测序。这种方法提供了双条形码签名，该双条形码签名可用于将读段分配至特定的单细胞(sc)。在一些实施方案中，可以使用基于单细胞液滴的方法例如可通过10xgenomics或biorad获得的方法对测定进行配置。在一些实施方案中，对天然染色质进行测序。这些测定可用于进行多组学分析，其中dna修饰与染色质可及性被一起分析。在一些实施方案中，在测序前对样品进行pcr扩增。在一些实施方案中，将使用修饰染色质的其他酶例如整合酶或dna甲基转移酶代替tn5。[0013]在一些实施方案中，修饰的tn5可用于对组蛋白ptm、chap或核小体定位(如pag‑tn5)作图。在这些测定中，，对高活性tn5加载携带独特标识符序列的转座子，利用tn5酶的典型功能插入其dna条形码化有效载荷。与用于染色质可及性作图的修饰的tn5不同，这种修饰的tn5与抗体结合部分融合以实现抗体靶向(如cut&tag[pag‑mtn5]中使用的修饰形式的pag‑tn5)。本测定中使用的抗体可以靶向任何染色质元件或结合蛋白，如组蛋白ptm、核小体、chap和dna甲基化。插入后，使用本领域已知的分子生物学技术(例如，一种使用t4dna聚合酶和t4dna连接酶的联合处理(如先前所做的)[28])修复dna，并使用tgs(例如，纳米孔或单分子实时测序)进行测序。最后，插入条形码化dna用于对抗体靶向的染色质区作图，生成类似于cut&tag的染色质图，且可用于在单个测定中分析一个或更多个细胞。关于可如何使用修饰的pag‑tn5(pag‑mtn5)将条形码整合到染色质中，然后进行dna修复和tgs的工作流程示例见图4。tn5可以与任何蛋白结合部分，如蛋白a、蛋白g、生物素、gst等融合。在一些实施方案中，组装了pag‑mtn5转座子的文库，每个转座子由独特的dna条形码表示。这种文库可用于处理多个批量样品(即，一个以上的细胞)，然后可以对这些样品进行合并、测序，并可使用每个样品dna条形码对数据去卷积(即，多路复用分析)。dna条形码用于指示抗体靶向的基因组区域，如ptm或chap。使用组合索引方法，这种文库还可用于单细胞分析[29]，其中所述测定在细胞群上进行，然后将细胞群分到多孔板(如96、384、1536孔)中，每个孔包含约20个细胞。然后，对每个孔使用包含第二条形码(即分子标识符)的引物进行pcr扩增，并使用tgs进行测序。这种方法提供了双条形码签名，该双条形码签名可用于将读段分配至特定的sc。在一些实施方案中，可以使用基于单细胞液滴的方法，例如可通过10xgenomics或biorad商业化获得的方法对测定进行配置。在一些实施方案中，对天然染色质进行测序。这些测定可用于进行多组学分析，其中dna修饰与其他染色质特征(例如，组蛋白ptm或chap)被一起分析。在一些实施方案中，将样品在测序前进行pcr扩增，这可能对低细胞输入或单细胞应用有用。在一些实施方案中，使用修饰染色质的其他酶例如整合酶或dna甲基转移酶代替tn5。[0014]因此，本发明的一个方面涉及一种合成转座子，其包含在其5'和3'端连接到由转座酶识别的侧翼区域的dna条形码区域，其中所述合成转座子不编码转座酶。[0015]本发明的另一方面涉及转座体，其包括本发明的合成转座子和结合到每个末端反向重复序列的转座酶。[0016]本发明的另一方面涉及包含两个或更多个本发明的合成转座子和/或两个或更多个本发明的转座体的文库，其中所述每个合成转座子包含独特的dna条形码。[0017]本发明的另一方面涉及试剂盒，其包括本发明的合成转座子、转座体或文库。[0018]本发明的另一方面涉及用于染色质作图的方法，其包括：[0019]a)使酶靶向样品中染色质的特定特征；[0020]b)激活所述酶以改变或标记所述特征的局部dna；[0021]c)制备用于测序的染色质；[0022]d)使用长读长测序对所述染色质进行测序；和[0023]e)基于改变的或标记的dna的位置对染色质特征的位置作图。[0024]在一些实施方案中，这些方法可用于对染色质可及性作图。在一些实施方案中，这些方法可用于对染色质修饰、染色质相关蛋白或核小体定位作图。在一些实施方案中，这些方法是多组学测定的一部分。[0025]在一些实施方案中，本发明所述的方法还可包括使用测序结果来比较健康组织和疾病组织之间的染色质特征的步骤、预测疾病状态、监测对治疗的响应，和/或分析肿瘤异associates,inc.andjohnwiley&sons,inc.,newyork)。[0038]本文提及的所有出版物、专利申请、专利、核苷酸序列、氨基酸序列和其他参考文献均通过引用以其整体并入本文。[0039]如在本发明的说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确说明。[0040]如本文使用的，“和/或”涉及并涵盖一个或更多个相关所列项目的任一个和所有可能的组合，以及当在替代方案中解释时无组合(“或”)。[0041]而且，本发明还考虑到，在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文所述的任何特征或特征的组合。[0042]此外，当指可测量的值如本发明的化合物或剂的量、剂量、时间、温度等时，本文所用的术语“约”意指涵盖指定量的±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。[0043]本文所用的与核酸、蛋白质相关的术语“主要由……组成”意指核酸或蛋白质不包含除所述元件以外的显著改变(例如，超过约1％、5％或10％)该核酸或蛋白质的感兴趣的功能的任何元件。[0044]如本文使用的，术语“多肽”涵盖肽和蛋白质二者，除非另有说明。[0045]“核酸”或“核苷酸序列”是核苷酸碱基序列，且可以是rna、dna或dna‑rna杂交序列(包括天然存在和非天然存在的核苷酸)，但优选单链或双链dna序列。[0046]如本文使用的，“分离的”核酸或核苷酸序列(例如，“分离的dna”或“分离的rna”)是指与天然存在的微生物或病毒的至少一些其他成分分离或基本上不含与天然存在的微生物或病毒的至少一些其他成分的核酸或核苷酸序列，所述天然存在的微生物或病毒的至少一些其他成分例如细胞或病毒的结构组分，或通常发现的与所述核酸或核苷酸序列缔和的其他多肽或核酸。[0047]同样，“分离的”多肽是指与天然存在的微生物或病毒的至少一些其他组分分离或基本上不含天然存在的微生物或病毒的至少一些其他组分的多肽，所述天然存在的微生物或病毒的至少一些其他组分例如细胞或病毒的结构组分，或通常发现的与所述多肽缔和的核酸或其他多肽。[0048]所谓“基本上保留”一种特性(例如，活性或其他可测量特征)，是指保留了该特性的至少约75％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。[0049]术语“合成的”是指自然界中不存在的化合物、分子或复合物。[0050]术语“dna条形码”指可用于明确识别其所位于其中的dna分子的核酸序列。条形码的长度决定了1个文库中可以存在多少个独特序列。例如，1个核苷酸(nt)的条形码可以为4个文库成员提供代码，2nt条形码为16个变体提供代码，3nt条形码为64个变体提供代码，4nt条形码为256个变体提供代码，5nt条形码为1024个变体提供代码等等。条形码可以是单链(ss)dna或双链(ds)dna或其组合。[0051]本发明的第一个方面涉及合成转座子，其主要由或由在其5'和3'端连接到转座酶识别的侧翼区域的dna条形码区域组成，其中所述合成转座子不编码转座酶。转座酶“识别”的侧翼区域是由同源转座酶特异性结合的区域，且其功能是将转座子插入到dna中。在一些实施方案中，侧翼区域与天然存在的dna转座子中发现的区域相同或来源于该区域，例如tn5的19bp混合末端(me)。在一些实施方案中，侧翼区域可具有7‑40个核苷酸的长度，例如，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40个核苷酸或其中的任何范围。在一些实施方案中，侧翼区域包括末端反向重复序列，其侧翼是短的正向重复序列。在一些实施方案中，侧翼区域包括dna条形码。dna条形码可具有少于400、300、200或50个核苷酸的长度。在一些实施方案中，dna条形码可具有至少6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，可对侧翼区域中的一个或更多个核苷酸进行修饰，例如通过甲基化或例如用生物素标记。[0052]本发明的另一方面涉及转座体，其包括本发明的合成转座子和结合到每个末端反向重复序列的转座酶。在一些实施方案中，转座酶可以是野生型转座酶，例如tn5、mu、is5、is91、tn552、ty1、tn7、tn/o、mariner、pelement、tn3、tn1o或tn903。在一些实施方案中，转座酶由野生型转座酶修饰而来，例如突变的高活性转座酶。此类修饰的转座酶在本领域是已知的。在一些实施方案中，转座酶是tn5或修饰的tn5，例如包括一种或多种突变e54k、m56a或l372p的高活性tn5。[0053]本发明的另一方面涉及包含两个或更多个本发明的合成转座子和/或两个或更多个本发明的转座体的文库，其中每个合成转座子包含独特的dna条形码。在一些实施方案中，文库可包括5、10、50、100、250、500、1000、5000个或更多个转座子和/或转座体，每个转座子和/或转座体具有独特的dna条形码。[0054]本发明的另一方面涉及试剂盒，其包含本发明的合成转座子、转座体和/或文库。在一些实施方案中，试剂盒还包括识别合成转座子序列的一种或更多种转座酶。试剂盒还可包括用于实施本发明所述方法的其它组分，包括但不限于酶、抗体、核苷酸、珠、缓冲液、容器、说明书等。[0055]本发明的另一方面涉及用于染色质作图的方法，其包括：[0056]a)使酶靶向样品中染色质的特定特征；[0057]b)激活所述酶以改变或标记所述特征的局部dna；[0058]c)制备用于测序的染色质；[0059]d)使用长读长测序对染色质进行测序；和[0060]e)基于改变的或标记的dna的位置对染色质特征的位置作图。[0061]待在本发明的测定中被作图的染色质可以来自任一来源，包括器官、组织、细胞或无细胞成分。由于测定的灵敏度，待用染色质的量可能会有很大差异。在一些实施方案中，样品包括来自少于1000、500、100、10或5个细胞的染色质。在一些实施方案中，样品包括来自1个细胞的染色质。[0062]根据样品的大小，本发明的方法可以在任一规模上进行。在一些实施方案中，这些步骤在多孔板的孔中进行。在一些实施方案中，例如使用基于单细胞液滴的方法或组合索引方法，这些步骤在单细胞规模上进行。[0063]包括待在本发明的测定中作图的染色质的样品可以包括包含染色质的细胞或细胞核。在一些实施方案中，将细胞或细胞核附着于固体支持物，以便于在该方法的步骤期间被操作。固体支持物可以是但不限于孔或珠，例如磁珠。在一些实施方案中，不将细胞或细胞核附着于固体支持物。[0064]在一些实施方案中，将细胞或细胞核透化以增强组分触及染色质。例如，将细胞用洋地黄皂甙(例如约0.01％洋地黄皂甙)透化。在一些实施方案中，未将细胞或细胞核透化。[0065]在一些实施方案中，样品包括已从细胞或细胞核分离的染色质。[0066]包括待作图的染色质的样品可以来自任一来源。在一些实施方案中，染色质从生物样品中获得。生物样品可以是但不限于血液、血清、血浆、尿液、唾液、精液、前列腺液、乳头抽吸液、泪液、汗液、粪便、颊拭子、脑脊液、细胞裂解物样品、羊水、胃肠液、活检组织、淋巴液或脑脊液。[0067]在一些实施方案中，染色质来自病变组织或样品。在一些实施方案中，染色质来自非病变组织或样品。在一些实施方案中，染色质来自外周组织或细胞，例如外周血单核细胞。[0068]在一些实施方案中，染色质来自培养的细胞，例如细胞系或原代细胞。在一些实施方案中，染色质来自疾病或障碍的动物模型。在一些实施方案中，染色质来自患有或疑似患有疾病或障碍的受试者，例如患者。[0069]本发明的方法可用于进行任一类型的染色质作图，例如，对任一种感兴趣的特定特征，包括但不限于染色质修饰的基因组位置和丰度、染色质相关蛋白(chap)、染色质可及性和核小体定位作图。[0070]在一方面，本发明所述的方法包括用于染色质可及性作图的方法。用于染色质可及性作图的酶可以是任一能够在可接近的地方可检测地改变或标记dna的酶。在一种实施方案中，酶是整合酶或dna甲基转移酶。在一种实施方案中，在染色质可及性作图中使用的酶是转座酶。在一些实施方案中，转座酶可以是野生型转座酶，例如tn5、mu、is5、is91、tn552、ty1、tn7、tn/o、mariner、p元件(pelement)、tn3、tn1o或tn903。在一些实施方案中，转座酶由野生型转座酶修饰而来，例如突变的高活性转座酶。这些修饰的转座酶在本领域是已知的。在一些实施方案中，转座酶是tn5或修饰的tn5。[0071]在一些实施方案中，该方法包括在可将合成转座子插入染色质的条件下，将包含染色质的样品与本发明的合成转座子、转座体或文库接触。[0072]在一些实施方案中，步骤b)中酶的活化包括添加酶活性所需的因子，例如，通过添加诸如钙或镁的离子。一旦激活，酶改变或标记所述特征的局部dna。本文中的术语“局部”是指该特征内5‑30个核苷酸(例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30或其中的任一范围，例如小于6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29，或30个核苷酸)或3‑18nm(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18nm或其中的任一范围，例如，小于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18nm)的dna。[0073]在一些实施方案中，该方法还包括在测序之前，例如使用dna聚合酶(如dna聚合酶i)和dna连接酶(如t4dna连接酶)修复转座子连接位点。[0074]在对染色质可及性作图的方法的一些实施方案中，使两个或更多个样品与合成转座子接触，并使每个样品与包含独特dna条形码的不同合成转座子接触。在一些实施方案中，使2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、250、500或1000个或更多种样品各自与包含独特dna条形码的不同合成转座子接触。在一些实施方案中，在步骤b)之后可合并两个或更多个样品。[0075]在一方面，本发明所述的方法包括用于对染色质修饰、染色质相关蛋白或核小体定位作图的方法。在一些实施方案中，染色质修饰是组蛋白修饰(例如，翻译后修饰)、组蛋白变体或dna修饰(例如，转录后修饰)。[0076]组蛋白ptm可以是任何想要测量的ptm。在一些实施方案中，组蛋白ptm是但不限于，丝氨酸和丙氨酸的n‑乙酰化；丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化；赖氨酸的n‑巴豆酰化、n‑酰基化；赖氨酸的n6‑甲基化、n6,n6‑二甲基化、n6,n6,n6‑三甲基化；精氨酸的ω‑n‑甲基化、对称‑二甲基化、不对称‑二甲基化；精氨酸的瓜氨酸化；赖氨酸的泛素化；赖氨酸的类泛素化；丝氨酸和苏氨酸的o‑甲基化，精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的adp核糖基化，或其任意组合。[0077]本领域已知几种天然存在的组蛋白变体，且它们中的任一种或多种均可包括在核小体中。组蛋白变体包括但不限于h3.3、h2a.bbd、h2a.z.1、h2a.z.2、h2a.x、mh2a1.1、mh2a1.2、mh2a2、th2b或其任何组合。[0078]dna转录后修饰可以是任何想要测量的修饰。在一些实施方案中，dna转录后修饰是5‑甲基胞嘧啶、5‑羟甲基胞嘧啶、5‑甲酰基胞嘧啶、5‑羧基胞嘧啶、3‑甲基胞嘧啶或其任意组合。[0079]染色质相关蛋白可以是任一想要测量的染色质相关蛋白。在一些实施方案中，染色质相关蛋白是转录因子、组蛋白结合蛋白或dna结合蛋白。[0080]在对染色质修饰、染色质相关蛋白或核小体定位作图的方法中，使酶靶向样品中染色质的特定特征的步骤包括使染色质与特异性结合该特征的抗体、适体或识别剂接触。本发明的方法中使用的抗体、适体或识别剂可以是特异性识别并结合靶标(例如抗原)的任一试剂。术语“抗体”包括其抗原结合片段，如scfv、fab、fv、fab’、f(ab’)2片段、dab、vhh、纳米抗体(nanobody)、v(nar)或最小识别单位。[0081]对于对染色质修饰、染色质相关蛋白或核小体定位作图的方法，酶与结合抗体、适体或识别剂的蛋白质，例如抗体结合蛋白连接。在一些实施方案中，抗体结合蛋白可以是但不限于蛋白a、蛋白g、蛋白a和蛋白g的融合物、蛋白l或蛋白y。[0082]在对染色质修饰、染色质相关蛋白或核小体定位作图时使用的酶可以是任一能够在可接近的地方可检测地改变或标记dna的酶。在一种实施方案中，酶是整合酶或dna甲基转移酶。在一种实施方案中，用于染色质可及性作图的酶是转座酶。在一些实施方案中，转座酶可以是野生型转座酶，例如tn5、mu、is5、is91、tn552、ty1、tn7、tn/o、mariner、p元件、tn3、tn1o或tn903。在一些实施方案中，转座酶由野生型转座酶修饰而来，例如突变的高活性转座酶。这些修饰的转座酶在本领域是已知的。在一些实施方案中，转座酶是tn5或已修饰的tn5。[0083]在一些实施方案中，该方法包括在可将合成转座子插入染色质的条件下，使包含染色质的样品与本发明的合成转座子、转座体或文库接触。[0084]在一些实施方案中，步骤b)中酶的激活包括添加酶活性所需的因子，例如，通过添加诸如钙或镁的离子。[0085]在一些实施方案中，该方法还包括在测序之前例如使用dna聚合酶(如dna聚合酶i)和dna连接酶(如t4dna连接酶)修复转座子连接位点。[0086]在对染色质修饰、染色质相关蛋白或核小体定位作图的方法的一些实施方案中，使两个或更多个样品与合成转座子接触，并使每个样品与包含独特dna条形码的不同合成转座子接触。在一些实施方案中，使2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、250、500或1000个或更多个样品各自与包含独特dna条形码的不同合成转座子接触。在一些实施方案中，在步骤b)之后可合并两个或更多个样品。[0087]对于本发明的所有方法，这些方法可以使用组合细胞索引技术进行。在一些实施方案中，该方法可以在细胞群上进行，并且步骤c)包括将细胞群分组，并处理细胞以使用包括第二条形码的衔接子进行测序，或者使用包括第二条形码的引物进行pcr扩增，使得每个细胞包括双条形码签名。在一些实施方案中，每组细胞可包括少于约1000、500、250、100或50个细胞，例如约10至约30个细胞，例如约20个细胞。[0088]对于本发明的所有方法，这些方法可以作为多组学过程的一部分进行，其中例如，基于长读长测序信息，在相同的样品上进行其他分析。在一些实施方案中，这些方法还包括分析染色质中的dna修饰，例如dna甲基化。[0089]如本文所定义，“长读长测序”是指在单分子水平上工作并提供至少10kb(例如，至少50kb或100kb)的序列读长的第三代测序技术。长读长测序可以通过本领域已知的任一方法进行。在一些实施方案中，长读长测序包括纳米孔测序，例如可从oxford(ont)获得的技术。在一些实施方案中，长读长测序包括单分子实时测序，例如可从pacific获得的技术。[0090]在本发明的方法的一些实施方案中，这些方法还包括在测序前对样品进行机械或酶切剪切的步骤。在其它实施方案中，测序前不进行剪切。[0091]在本发明的方法的一些实施方案中，这些方法还包括在测序前扩增样品的步骤。在其他实施方案中，测序前不进行扩增，从而能够分析天然dna修饰。[0092]从本发明的方法获得的结果可用于任一目的，其中关于染色质结构和/或修饰的信息(例如表观遗传变化)将是有用的。在一些实施方案中，这些方法还可包括使用测序结果比较健康组织和疾病组织之间染色质特征的步骤。在一些实施方案中，这些方法还可包括使用测序结果预测疾病状态的步骤。在一些实施方案中，这些方法还可包括使用测序结果监测对治疗的响应的步骤。在一些实施方案中，这些方法还可包括使用测序结果分析肿瘤异质性的步骤。[0093]本发明的方法可用于检测和定量染色质中表观遗传修饰的存在。特异性结合表观遗传修饰的抗体、适体或识别剂可用于检测和定量多个基因组位点的染色质元件或修饰。[0094]本发明的方法可用于确定和定量患有疾病或障碍的受试者的染色质表观遗传状态。特异性结合一种或多种可能与受试者的疾病或障碍有关的表观遗传修饰的抗体、适体或识别剂可用于检测和定量多个基因组位点的染色质元件或修饰。通过这种方法，人们可以确定患有疾病或障碍(例如肿瘤)的受试者是否具有已知与肿瘤类型相关的表观遗传修饰。[0095]本发明的方法可用于监测受试者的染色质表观遗传状态随时间的变化。该方法可用于确定表观状态是否随时间而改善、稳定或恶化。该方法的步骤可以根据需要重复多次，以监测表观遗传修饰状态的变化，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、50或100次或更多次。该方法可以定期(例如，每天、每周、每月、每年)或根据需要重复。该方法可以例如，在受试者的治疗性治疗之前、期间和/或之后、在诊断受试者的疾病或障碍之后、作为确定受试者的疾病或障碍诊断的一部分、在确定受试者发展疾病或障碍的风险后重复，或想要监测多个基因组位点的染色质元件或修饰的可能变化的任何其它情况。[0096]本发明的方法可用于测量表观遗传靶向药物的中靶活性。这些方法可在施用表观遗传靶向药物之前、期间和/或之后实施，以确定药物改变受试者表观遗传状态的能力。[0097]本发明的方法可用于监测表观遗传疗法在患有与表观遗传修饰相关的疾病或障碍的受试者中的有效性。[0098]表观遗传疗法是那些旨在改变蛋白质(如组蛋白)或dna的表观遗传状态的疗法。表观遗传疗法的一个实例包括赖氨酸脱乙酰酶抑制剂(以前称为组蛋白脱乙酰酶抑制剂)(例如，伏立诺他(辛二酰苯胺异羟肟酸)、ci‑994(tacedinaline)、ms‑275(恩替诺特)、bmp‑210、m344、nvp‑laq824、lbh‑529(帕比司他)、mgcd0103(莫替司他)、pxd101(贝利司他)、cbha、pci‑24781、itf2357、丙戊酸、曲古抑菌素a和丁酸钠)，其用于治疗皮肤t细胞淋巴瘤(ctcl)或用于治疗血液肿瘤和实体瘤，包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肾癌和膀胱癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤的临床试验。表观遗传疗法的另一个实例是组蛋白乙酰基转移酶抑制剂(例如，表没食子儿茶素‑3‑没食子酸酯、山竹子素(garcinol)、漆树酸、cpth2、姜黄素、mb‑3、mg149、c646和罗米地辛)。表观遗传疗法的另一个实例是dna甲基转移酶抑制剂(例如，氮杂胞苷、地西他滨、泽布拉林(zebularine)、咖啡酸、绿原酸、表没食子儿茶素、肼苯哒嗪、普鲁卡因胺、普鲁卡因和rg108)，其已经批准用于治疗急性髓系白血病、骨髓异常增生综合征和慢性髓单核细胞白血病以及用于实体瘤治疗的临床试验。其他表观遗传疗法包括但不限于，赖氨酸甲基转移酶(例如，pinometostat、他泽司他(tazometostat)、cpi‑1205)；赖氨酸去甲基化酶(如ory1001)；精氨酸甲基转移酶(如epz020411)；精氨酸脱亚胺酶(如gsk484)；和异柠檬酸脱氢酶(例如，恩西地平(enasidenib)、艾伏尼布(ivosidenib))。参见fischle等人,acschem.biol.11:689(2016)；dewoskin等人,naturerev.12:661(2013)；campbell等人,j.clin.invest.124:64(2014)；和brown等人,futuremed.chem.7:1901(2015)；每篇均通过引用整体并入本文。[0099]该方法的步骤可以根据需要重复多次，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、50或100次或更多次，以监测治疗的有效性。该方法可以定期(例如，每天、每周、每月、每年)或根据需要重复，例如，直至治疗性治疗结束。该方法可以例如在受试者的治疗性治疗之前、期间和/或之后重复，例如在每次给予治疗之后重复。在一些实施方案中，治疗持续进行，直到本发明的方法显示治疗有效。[0100]本发明的方法可用于基于受试者中染色质的表观遗传状态，为患有与表观遗传修饰相关的疾病或障碍的受试者选择合适的治疗。[0101]这些方法可以应用于例如已诊断为患有或疑似患有与表观遗传修饰相关的疾病或障碍的受试者。表位的表观遗传状态的确定可以指示，表位的状态已被修饰，并且应给予受试者表观遗传治疗以纠正该修饰。相反，确定表位的状态未被修饰将指示表观遗传疗法预计不会有效，且应避免。例如，确定一个特定基因组位点已经乙酰化或脱乙酰化可能指示用组蛋白脱乙酰酶抑制剂治疗是合适的。同样，确定特定基因组位点已被高甲基化或低甲基化可能指示用dna甲基转移酶抑制剂治疗是合适的。[0102]本发明的方法可用于基于受试者染色质的表观遗传状态，确定患有与表观遗传修饰相关的疾病或障碍的受试者的预后。[0103]在某些情况下，表位的表观遗传状态指示与表观遗传修饰相关的疾病或障碍的预后。因此，确定已诊断为患有或疑似患有与表观遗传修饰相关的疾病或障碍的受试者的表位表观遗传状态可能有助于确定受试者的预后。许多这样的实例在本领域是已知的。一个实例是前列腺癌和谷胱甘肽s转移酶p1(gstp1)基因启动子、腺瘤性息肉病大肠杆菌(apc)基因、基因pitx2、c1orf114和gabre～mir‑452～mir‑224，以及三基因标志物组aox1/c1orf114/hapln3和13基因标记物组gstp1、grasp、tmp4、kcnc2、tbx1、zdhhc1、capg、rarres2、sac3d1、nkx2‑1、fam107a、slc13a3、filip1l的高甲基化。另一个实例是前列腺癌和组蛋白ptm，包括但不限于与前列腺肿瘤复发的显著更高的风险相关的增加的h3k18乙酰化和h3k4二甲基化，与肿瘤分期相关h4k12乙酰化和h4r3二甲基化，以及与有肿瘤复发风险的低级别前列腺癌患者相关h3k9二甲基化。另一个实例是乳腺癌患者的总生存率与基因creb5、exph5、znf775、adcy3和adma8中cpg的甲基化状态之间的联系。另一个实例是胶质母细胞瘤和基因如egfr、pten、nf1、pik3r1、rb1、pdgfra和qki的内含子区域的高甲基化。另一个实例是结肠癌的不良预后和cnrip1、fbn1、ina、mal、snca和spg20基因的启动子的甲基化状态。[0104]本发明的方法可用于基于受试者的染色质表观遗传状态，鉴定与表观遗传修饰相关的疾病或障碍的生物标志物。[0105]在该方法中，病变组织的生物样品可以取自许多患有疾病或障碍的患者，并确定一个或更多个表位的表观遗传状态。然后可以使用本领域已熟知的分析技术鉴定表位状态与发生、阶段、亚型、预后等之间的相关性。[0106]在任一种本发明的方法中，与表观遗传修饰相关的疾病或障碍可以是癌症、中枢神经系统(cns)疾病、自身免疫疾病、炎性疾病或传染病。[0107]癌症可以是任何良性或恶性的异常生长的细胞，包括但不限于听神经瘤、急性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、腺癌、肾上腺癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、间变型星形细胞瘤、血管肉瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、支气管癌、宫颈癌、宫颈增生、脊索瘤、绒毛膜癌、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、囊腺癌、胚胎癌、子宫内膜癌、内皮肉瘤、室管膜瘤、上皮癌、食管癌、原发性血小板增多、尤文氏肿瘤(ewing’stumor)、纤维肉瘤、泌尿生殖系统癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质肉瘤、毛细胞白血病、头颈癌、成血管细胞瘤、肝癌、霍奇金氏病、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、白血病、脂肪肉瘤、肺癌、淋巴管内皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、淋巴管肉瘤、淋巴瘤、恶性类癌、恶性高钙血症、恶性黑色素瘤、恶性胰腺胰岛瘤、肥大细胞瘤、髓样癌、髓母细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿、骨髓瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、少突胶质细胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状腺肉瘤、乳头状肉瘤、松果体瘤、真性红细胞增多症、原发性脑癌、原发性巨球蛋白血症、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、皮脂腺肉瘤、精原细胞瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、汗腺癌、滑膜瘤、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌和肾母细胞瘤。[0108]cns疾病包括遗传性疾病、神经变性疾病、精神疾病和肿瘤。cns的示例性疾病包括但不限于，阿尔茨海默氏病、帕金森病、享廷顿病、卡纳万病、利氏病、雷夫叙姆病、图雷特综合征、原发性侧索硬化、肌萎缩侧索硬化、进行性肌萎缩、皮克氏病、肌营养不良症、多发性硬化、重症肌无力、宾斯旺格病、脊髓或头部损伤所致创伤、泰‑萨克斯病、莱施‑奈恩病(lesch‑nyandisease)、癫痫、脑梗塞、精神障碍包括心境障碍(例如抑郁症、双相情感障碍、持续性情感障碍、继发性心境障碍、躁狂症、躁狂性精神病)、精神分裂症、分裂情感障碍、类精神分裂症、药物依赖(例如，酒精中毒和其它物质依赖)、神经症(例如，焦虑、强迫症、躯体形式障碍、分离性障碍、悲伤、产后抑郁症)、精神病(例如，幻觉和错觉、未另作说明的精神病(精神病nos))、痴呆、衰老、妄想症、注意力缺陷障碍、性心理障碍、睡眠障碍、疼痛障碍、进食或体重障碍(例如，肥胖症、恶病质、神经性厌食症和贪食症)、累及视网膜、后束和视神经的眼科疾病(例如色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病和其他视网膜变性疾病、葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性、青光眼)以及cns的癌症和肿瘤(例如垂体瘤)。[0109]自身免疫性和炎性疾病和障碍包括但不限于，心肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、亚急性细菌性心内膜炎、抗肾小球基底膜肾炎、间质性膀胱炎、狼疮性肾炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎，抗合成酶综合征、鼻窦炎、牙周炎、动脉粥样硬化、皮炎、变态反应、过敏性鼻炎、过敏性气道炎症、慢性阻塞性肺疾病、嗜酸粒细胞性肺炎、嗜酸细胞性食管炎、嗜酸性粒细胞增多综合征、移植物抗宿主病、特应性皮炎、结核病、哮喘、慢性消化性溃疡、斑秃、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性黄体酮皮炎、自身免疫性荨麻疹、大疱性类天疱疮、瘢痕性类天疱疮、疱疹样皮炎、盘状红斑狼疮、获得性大疱性表皮松解、结节性红斑、妊娠性类天疱疮、化脓性汗腺炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、线状iga病、硬斑病、寻常型天疱疮、急性痘疮样苔藓样糠疹(pityriasislichenoidesetvarioliformisacuta)、穆‑哈二氏病(mucha‑habermanndisease)、银屑病、系统性硬皮病、白癜风、阿狄森氏病、自身免疫性多内分泌腺病综合征1型、自身免疫性多内分泌腺病综合征2型、自身免疫性多内分泌腺病综合征3型、自身免疫性胰腺炎、1型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、ord's甲状腺炎、graves病、自身免疫性卵巢炎、子宫内膜异位症、自身免疫性睾丸炎、干燥综合征、自身免疫性肠病、乳糜泻、克罗恩病、肠易激综合征、憩室炎、显微镜结肠炎、溃疡性结肠炎、抗磷脂综合征、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性淋巴增生综合征、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性血小板减少性紫癜、冷凝集素病、原发性混合冷球蛋白血症、evans综合征、恶性贫血、纯红细胞再生障碍、血小板减少症、痛性肥胖症、成人发作的斯提耳氏病、强直性脊柱炎、crest综合征、药物诱导的狼疮、附着点炎相关的关节炎、嗜酸细胞性筋膜炎、费尔蒂综合征、igg4相关疾病、青少年关节炎、莱姆病(慢性)、混合性结缔组织病、回纹型风湿症、parry‑romberg综合征、牧师特纳综合征(parsonage‑turnersyndrome)、银屑病关节炎、反应性关节炎、复发性多软骨炎、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施尼茨勒综合征、系统性红斑狼疮、未分化结缔组织病、皮肌炎、纤维肌痛、肌炎、重症肌无力、神经性肌强直、副肿瘤性小脑变性、多发性肌炎、急性播散性脑脊髓炎、急性运动轴突神经病、抗n‑甲基‑d‑天冬氨酸受体脑炎、balo同心圆性硬化、bickerstaff脑炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、格林‑巴利综合征、桥本脑病、特发性炎性脱髓鞘疾病、lambert‑eaton肌无力综合征、多发性硬化症、oshtoran综合征、链球菌感染相关的儿童自身免疫性神经精神障碍(pandas)、进行性炎性神经病、不宁腿综合征、僵人综合征、sydenham舞蹈病、横贯性脊髓炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性葡萄膜炎、科根综合征、graves眼病、中间葡萄膜炎、木样结膜炎、蚕蚀性角膜溃疡(mooren’sulcer)、视神经脊髓炎、眼球阵挛‑肌阵挛综合征、视神经炎、巩膜炎、susac综合征、交感性眼炎、tolosa‑hunt综合征、自身免疫性内耳疾病、梅尼埃病、白塞病、嗜酸性肉芽肿性多血管炎、巨细胞动脉炎、肉芽肿性血管炎(granulomatosiswithpolyangiitis)、iga血管炎、川崎病、白细胞破坏性脉管炎、狼疮血管炎、类风湿性血管炎、显微镜下多血管炎、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、荨麻疹性血管炎、血管炎和原发性免疫缺陷。[0110]本文使用的术语“传染病”是指与致病因子(infectiousagent)感染相关的任何疾病。致病因子的实例包括但不限于病毒和微生物(例如细菌、寄生虫、原生动物、隐孢子虫)。病毒包括但不限于，嗜肝dna病毒科(hepadnaviridae)，包括甲型、乙型、丙型、丁型、戊型、己型、庚型肝炎等；黄病毒科(flaviviridae)，包括人丙型肝炎病毒(hcv)、黄热病病毒(yellowfevervirus)和登革热病毒(dengueviruses)；逆转录病毒科(retroviridae)，包括人类免疫缺陷病毒(hiv)和人类嗜t淋巴细胞病毒(htlv1和htlv2)；疱疹病毒科(herpesviridae)，包括单纯疱疹病毒(hsv‑1和hsv‑2)、eb病毒(ebv)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)、水痘‑带状疱疹病毒(vzv)、人疱疹病毒6(hhv‑6)、人疱疹病毒8(hhv‑8)和疱疹b病毒(herpesbvirus)；乳多空病毒科(papovaviridae)，包括人乳头瘤病毒(humanpapillomaviruses)；弹状病毒科(rhabdoviridae)，包括狂犬病病毒(rabiesvirus)；副粘病毒科(paramyxoviridae)，包括呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus)；呼肠孤病毒科(reoviridae)，包括轮状病毒(rotaviruses)；布尼亚病毒科(bunyaviridae)，包括汉坦病毒(hantaviruses)；丝状病毒科(filoviridae)，包括埃博拉病毒(ebolavirus)；腺病毒科(adenoviridae)；细小病毒科(parvoviridae)，包括细小病毒b‑19(parvovirusb‑19)；沙粒病毒科(arenaviridae)，包括拉沙病毒(lassavirus)；正粘病毒科(orthomyxoviridae)，包括流感病毒(influenzaviruses)；痘病毒科(poxviridae)，包括orf病毒、传染性软疣病毒(molluscumcontageosumvirus)、天花病毒(smallpoxvirus)和猴痘病毒(monkeypoxvirus)；披膜病毒科(togaviridae)，包括委内瑞拉马脑炎病毒(venezuelanequineencephalitisvirus)；冠状病毒科(coronaviridae)，包括冠状病毒(coronaviruses)，如严重急性呼吸综合征(sars)病毒；和小核糖核酸病毒科(picornaviridae)，包括脊髓灰质炎病毒(polioviruses)；鼻病毒(rhinoviruses)；环形病毒属(orbiviruses)；微小脱氧核糖核酸病毒(picodnaviruses)；脑心肌炎病毒(emv)；副流感病毒(parainfluenzaviruses)、腺病毒(adenoviruses)、柯萨奇病毒(coxsackieviruses)、埃可病毒(echoviruses)、麻疹病毒(rubeolavirus)、风疹病毒(rubellavirus)、人乳头状瘤病毒(humanpapillomaviruses)、犬瘟热病毒(caninedistempervirus)、犬传染性肝炎病毒(caninecontagioushepatitisvirus)、猫杯状病毒(felinecalicivirus)、猫鼻气管炎病毒(felinerhinotracheitisvirus)、tge病毒(tgevirus)(猪)、口蹄疫病毒(footandmouthdiseasevirus)、猿猴病毒5、人副流感病毒2型、人偏肺病毒(humanmetapneuomovirus)、肠道病毒(enteroviruses)和任何其他现在已知或以后鉴定的致病病毒(参见，例如，fundamentalvirology，fields等人，编辑，第三版，lippincott‑raven，纽约，1996年，其全部内容通过引用并入本文以用于获取致病病毒的教导)。[0111]病原微生物包括但不限于立克次体(rickettsia)、衣原体(chlamydia)、嗜性衣原体(chlamydophila)、分枝杆菌(mycobacteria)、梭菌属(clostridia)、棒状杆菌(corynebacteria)、支原体(mycoplasma)、脲原体(ureaplasma)、军团菌属(legionella)、志贺氏菌属(shigella)、沙门氏菌属(salmonella)、致病性大肠杆菌(escherichiacoli)的种、bordatella、奈瑟氏球菌属(neisseria)、密螺旋体属(treponema)、芽孢杆菌属(bacillus)、嗜血杆菌属(haemophilus)、莫拉菌属(moraxella)、弧菌属(vibrio)、葡萄球菌属的种(staphylococcusspp.)、链球菌属的种(streptococcusspp.)、弯曲杆菌属的种(campylobacterspp.)、疏螺旋体属的种(borreliaspp.)、钩端螺旋体属的种(leptospiraspp.)、埃立克体属的种(erlichiaspp.)、克雷伯氏杆菌属的种(klebsiellaspp.)、假单胞菌属的种(pseudomonasspp.)、螺杆菌属的种(helicobacterspp.)以及现在已知或以后鉴定的任何其它病原微生物(参见，例如，microbiology，davis等人，编辑，第4版，lippincott，纽约，1990年，其全部内容通过引用并入本文以用于获取病原微生物的教导)。微生物的具体实例包括但不限于幽门螺杆菌(helicobacterpylori)、肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae)、沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)、解脲脲原体(ureaplasmaurealyticum)、肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)、肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)、绿色链球菌(streptococcusviridans)、粪肠球菌(enterococcusfaecalis)、脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseriameningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(neisseriagonorrhoeae)、梅毒螺旋体(treponemapallidum)、炭疽芽孢杆菌(bacillusanthracis)、伤寒沙门氏菌(salmonellatyphi)、霍乱弧菌(vibriocholera)、鼠疫巴斯德氏菌(pasteurellapestis)(鼠疫耶尔森氏菌(yersiniapestis))、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、空肠弯曲菌(campylobacterjejuni)、艰难梭菌(clostridiumdifficile)、肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)、结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)、伯氏疏螺旋体(borreliaburgdorferi)、杜克雷嗜血杆菌(haemophilusducreyi)、白喉杆菌(corynebacteriumdiphtheria)、百日咳杆菌(bordetellapertussis)、副百日咳博德特氏菌(bordetellaparapertussis)、支气管败血博德特氏菌(bordetellabronchiseptica)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenza)、单核细胞增生李斯特菌(listeriamonocytogenes)、福氏志贺氏菌(shigellaflexneri)、嗜吞噬细胞无形体(anaplasmaphagocytophilum)、产肠毒素大肠杆菌(escherichiacoli)和埃及血吸虫(schistosomahaematobium)。[0112]在一些实施方案中，疾病或障碍包括但不限于肥胖、糖尿病、心脏病、自闭症、脆性x综合征、atr‑x综合征、天使人综合征、普拉德‑威利综合征、韦伯综合征(beckwithwiedemannsyndrome)、雷特综合征、rubinstein‑taybi综合征、科勒综合征(coffin‑lowrysynthrome)、免疫缺陷‑着丝粒不稳定‑面部异常综合征、α‑地中海贫血、白血病、德朗热综合征(corneliadelanguesyndrome)、歌舞伎综合征(kabukisyndrome)、进展型系统性硬化病和心脏肥大。[0113]已经描述了本发明，将在以下实施例中更详细地解释本发明，本文包含的实施例仅用于说明的目的，并不旨在限制本发明。实施例[0114]实施例1：使用长读长测序的染色质可及性测定[0115]本实施例描述了使用本发明进行染色质可及性测定的操作方案。[0116]第一部分：cona珠活化[0117]1.轻轻重悬cona珠(伴刀豆球蛋白a)，并将11μl/样品转移至1.5ml管中进行分批处理。[0118]2.将管放在磁铁上，直到浆液变清，然后用移液管去除上清液(supe)。[0119]3.加入100μl/样品的冷珠活化缓冲液，并用移液管混合。将管放在磁铁上，直到浆液变清，然后用移液管去除上清液。[0120]4.重复上一步，共洗涤两次。[0121]5.将珠重悬于11μl/样品的冷珠活化缓冲液中。针对不同的细胞类型和/或抗体，将活化的cona珠分到不同的试管中。[0122]6.将10μl/样品的活化珠浆等分至8联排管(8‑striptube)中。将珠保持在冰上，直到需要。[0123]第二部分：使细胞与活化珠结合[0124]7.在1.5ml管中于室温下以600g离心3分钟，收获50万个细胞/样品，并轻轻倒出上清液。[0125]8.将细胞重悬于100μl/样品的rt洗涤缓冲液中；在rt以600g离心3分钟；轻轻倒出上清液。[0126]9.重复上一步，用洗涤缓冲液共进行两次洗涤。[0127]10.将细胞以100μl/样品重悬于rt洗涤缓冲液中，并将100μl洗涤的细胞等分至每个8联排管(含有10μl活化珠)中。轻轻涡旋(设置#7)以混合。[0128]11.在rt孵育细胞：珠的浆10分钟(细胞将吸附到活化的cona珠上)。[0129]12.将管放在磁铁上，直到浆液变清，然后用移液器去除上清液。[0130]13.当珠在磁铁上时，将200μl冷的洗涤缓冲液直接加入到每个样品的珠上，然后用移液器去除上清液。[0131]14.重复上一步，共洗涤2次，并去除上清液。[0132]15.向每个8联排管中加入50μl冷wash300缓冲液，用移液器混合。[0133]第三部分：结合条形码化pag‑mtn5[0134]16.向每个样品中加入2.5μl条形码化pag‑mtn5，并轻轻涡旋。[0135]17.将样品在振动器(nutator)上在rt孵育1小时。[0136]18.使管在冰上的磁铁中冷却，直到浆液变清，并用移液器去除上清液。[0137]19.当珠在磁铁上时，将200μl冷wash300缓冲液直接加入到每个样品的珠上，然后用移液管去除上清液。[0138]20.重复上一步，共洗涤两次，并去除上清液。[0139]第四部分：靶向染色质标记[0140]21.向每个样品加入5μl冷tagmg10缓冲液，并用移液管混合。[0141]22.将8联排管在热循环仪上37℃孵育1小时。[0142]23.将管放在磁铁上，直到浆液变清，并用移液管去除上清液。[0143]24.加入5.5μltagstop缓冲液[0144]第五部分：dna修复和连接[0145]25.使用100μl0.2％sds洗涤样品，然后使用1xpbs洗涤，共洗涤2次。[0146]26.在4℃以1000g离心5分钟，并去除上清液。[0147]27.将样品于含10udna聚合酶i(neb#m0209s)和30μmdntp的200μldna修复和连接缓冲液中37℃孵育2小时。[0148]28.通过向反应中加入20μl的0.5medta和2μg的rnasea来终止反应，并在37℃孵育30分钟。[0149]29.在4℃以1000g离心5分钟，并去除上清液。[0150]第六部分：用于纳米孔测序的高mw基因组dna纯化(使用qiagengenomic‑tips试剂盒；货号10223)[0151]30.向每个样品加入1ml缓冲液g2，并用移液管混合。[0152]31.加入25μl的qiagen蛋白酶储备液(货号19157)，并在50℃孵育30‑60分钟。[0153]32.用1ml缓冲液qbt平衡qiagengenomic‑tip20/g，并允许通过重力流排空qiagengenomictip。[0154]33.以最大速度涡旋样品10秒，并将其应用于平衡的qiagengenomic‑tip。使其通过重力流进入树脂。[0155]34.用3x1ml缓冲液qc洗涤qiagengenomic‑tip。[0156]35.用2x1ml缓冲液qf(预热至50℃)洗脱基因组dna。[0157]36.通过向洗脱的dna中加入1.4ml(0.7体积)室温异丙醇来沉淀dna。[0158]37.立即混合并在4℃以4300g离心至少15分钟。小心去除上清液。[0159]38.用1ml的冷70％乙醇洗涤离心后的dna沉淀。短暂涡旋，并在4℃以4400g离心10分钟。小心去除上清液，不要搅动沉淀。风干5‑10分钟。[0160]39.将0.1‑2ml的dna重悬于1ml无菌te(10mmtris‑hcl，1mmedta，ph8.0)中，于室温在平台振荡器上过夜。[0161]第七部分：dna的质量控制检查[0162]40.使用nanodrop测定dna纯度。od260/280比率应为至少1.8，且od260/230应在2.0‑2.2之间。[0163]41.使用2100生物分析仪和适当的生物分析仪试剂盒(如agilentdna7500或12000，货号5067‑1508)测定平均片段大小。[0164]42.使用荧光分析法(invitrogen)测定dna质量；如果在oxford纳米孔测序仪上测序，则应为至少1μg(或100‑200fmol)。[0165]第八部分：用于纳米孔测序的dna文库的制备(使用牛津纳米孔连接测序试剂盒，货号sqk‑lsk109和操作说明书gde_9063_v109_revq_14aug2019，以及用于oxfordnanopore连接测序的配套模块，货号e7180s)[0166]43.将1mgdna转移至dnalobind管的终体积50ml无核酸酶的水中。[0167]44.进行末端制备和dna修复。将47mldna与来自用于oxfordnanopore连接测序的配套模块(货号e7180s)的dna修复酶和缓冲液相结合。[0168]45.按照牛津纳米孔技术操作说明书(gde_9063_v109_revq_14aug2019)所述，使用ampurexp珠在末端制备后纯化dna。[0169]46.使用qubit荧光计对1μl的纯化dna定量。[0170]47.进行衔接头连接。按照牛津纳米孔技术操作说明书(gde_9063_v109_revq_14aug2019)所述，将60μl纯化dna与衔接子混合物(来自牛津纳米孔连接测序试剂盒)、t4dna连接酶(neb)和缓冲液合并。[0171]48.按照牛津纳米孔技术操作说明书(gde_9063_v109_revq_14aug2019)所述，在衔接头连接后，使用ampurexp珠纯化dna。[0172]49.使用qubit荧光计对1μl的纯化dna定量。[0173]第九部分：纳米孔测序，使用牛津纳米孔技术minion纳米孔测序仪(注：可与其他牛津纳米孔测序仪例如和一起使用)。[0174]50.准备流通池：用冲洗缓冲液和拴系物冲洗液(flushtether)的混合物冲洗minion流通池(r9.4.1)。牛津纳米孔技术操作说明书(gde_9063_v109_revq_14aug2019)中详细描述了步骤。[0175]51.制备包含dna文库、测序缓冲液和加载的珠的测序前混合物。对于r9.4.1minion流通池，oxfordnanopore建议使用5‑50fmol测序文库中的dna。[0176]52.根据oxfordnanopore制造说明书，加载minion流通池。[0177]53.开始测序运行：通过usb3.0端口将minion连接到计算机。使用minknow软件运行minion测序反应，选择试剂盒(sqk‑lsk109)，“快速”碱基调用选项，并将运行时长设置为8小时。将输出设置为fastq和fast5文件。注：运行时长可随着流通池的类型、多路复用样品和测定设置的其他变化而变化。[0178]第十部分：生物信息学分析[0179]54.将测序数据传输到epi2me软件以进行生物信息学分析。[0180]55.考虑到插入的转座子/标识符序列，将测序数据映射到人类基因组grch38(或最新的参考基因组)。值得注意的是，通过pag‑mtn5插入转座子在插入的转座子每侧产生9bp重复[31]。因此，识别该标识符序列和/或这些重复位点的算法允许用户确定转座位点和ptm在染色质上的位置。[0181]oxfordnanopore发布了专门为纳米孔测序数据中的条形码识别和去卷积设计的软件(即albacore)，该软件将用于生物信息学流程的开发。[0182]条形码化pag‑mtn5‑加载有条形码化转座子的蛋白a/g融合高活性tn5[0183]缓冲液[0184]珠活化缓冲液[0185]20mmhepes，ph7.9[0186]10mmkcl[0187]1mmcacl2[0188]1mmmncl2[0189]过滤除菌[0190]洗涤缓冲液[0191]20mmhepes，ph7.5[0192]150mmnacl[0193]0.5mm亚精胺[0194]1xroche完全蛋白酶抑制剂‑mini(cpi‑mini)，不含edta(roche货号11836170001)，1片/10ml[0195]过滤除菌[0196]wash300缓冲液[0197]20mmhepes，ph7.5[0198]300mmnacl[0199]tagmg10缓冲液[0200]20mmhepesph7.5，300mmnacl[0201]10mmmgcl2[0202]0.5m亚精胺(0.5μl/ml)[0203]1xcpi‑mini[0204]tagstop缓冲液[0205]10mmtaps，ph8.5[0206]0.03％sds[0207]dna修复和连接缓冲液[0208]10mmtris‑hcl[0209]10mmmgcl2[0210]50mmnacl[0211]1mmdtt[0212]缓冲液g2[0213]800mm盐酸胍[0214]30mmtris·cl，ph8.0[0215]30mmedta，ph8.0[0216]5％吐温‑20[0217]0.5％tritonx‑100[0218]缓冲液qbt(平衡缓冲液)[0219]750mmnacl[0220]50mmmops，ph7.0[0221]15％异丙醇[0222]0.15％tritonx‑100[0223]缓冲液qc(洗涤缓冲液)[0224]1.0mnacl[0225]50mmmops，ph7.0[0226]15％异丙醇[0227]缓冲液qf(洗脱缓冲液)[0228]1.25mnacl[0229]50mmtris·cl，ph8.5[0230]15％异丙醇[0231]实施例2：使用长读长测序进行翻译后修饰和染色质相关蛋白测定[0232]第一部分：cona珠活化[0233]1.轻轻重悬cona珠(伴刀豆球蛋白a)，并将11μl/样品转移至1.5ml管中进行分批处理。[0234]2.将管放在磁铁上，直到浆液变清，并用移液管去除上清液(supe)。[0235]3.加入100μl/样品的冷珠活化缓冲液，并用移液管混合。将管放在磁铁上，直到浆液变清，并用移液管去除上清液。[0236]4.重复上一步，共洗涤两次。[0237]5.将珠重悬于11μl/样品的冷珠活化缓冲液中。针对不同的细胞类型和/或抗体，将活化的cona珠分到不同的管中。[0238]6.将10μl/样品的活化珠浆等分至8联排管中。将珠保持在冰上，直到需要。[0239]第二部分：使细胞与活化珠结合[0240]7.在1.5ml管中于室温下以600g离心3分钟，收获50万个细胞/样品，并轻轻倒出上清液。[0241]8.将细胞重悬于100μl/样品的rt洗涤缓冲液中；在rt以600g离心3分钟；轻轻倒出上清液。[0242]9.重复上一步，用洗涤缓冲液共进行两次洗涤。[0243]10.将细胞以100μl/样品重悬于rt洗涤缓冲液中，并将100μl洗涤的细胞等分至每个8联排管(含有10μl活化珠)中。轻轻涡旋(设置#7)以混合。[0244]11.在rt孵育细胞：珠的浆10分钟(细胞将吸附到活化的cona珠上)。[0245]第三部分：结合一抗(ptm或chap)[0246]12.将管放在磁铁上，直到浆液变清，并用移液管去除上清液。[0247]13.向每个样品中加入50μl冷的抗体缓冲液并轻轻涡旋。[0248]14.向每个样品中加入0.5μl抗体并轻轻涡旋。[0249]15.将8联排管在振动器上4℃孵育过夜。[0250]第四部分：结合二抗[0251]16.将管放在磁铁上，直到浆液变清，然后用移液管去除上清液。[0252]17.向每个样品中加入50μl冷的洗涤缓冲液并轻轻涡旋。[0253]18.向每个样品中加入0.5μl二抗(1:100稀释)并轻轻涡旋。[0254]19.将8联排管在振动器上室温孵育30分钟。[0255]20.将管放在磁铁上，直到浆液变清，并用移液管去除上清液。[0256]21.当珠在磁铁上时，将200μl冷的洗涤缓冲液直接加入到每个样品的珠上，然后用移液管去除上清液。[0257]22.重复上一步，共洗涤两次，并去除上清液。[0258]23.向每个8联排管中加入50μl冷wash300缓冲液，用移液管混合。[0259]第五部分：结合条形码化pag‑mtn5[0260]23.向每个样品中加入2.5μl条形码化pag‑mtn5，并轻轻涡旋。[0261]24.将样品在振动器上室温孵育1小时。[0262]25.将管放在磁铁上，直到浆液变清，并用移液管去除上清液。[0263]26.当珠在磁铁上时，将200μl冷的wash300缓冲液直接加入到每个样品的珠上，然后用移液管去除上清液。[0264]27.重复上一步，共洗涤两次，并去除上清液。nanopore连接测序的配套模块，货号e7180s)[0292]50.将1μgdna转移到dnalobind管的终体积50μl无核酸酶的水中。[0293]51.进行末端制备和dna修复:将以下47μldna与来自用于oxfordnanopore连接测序的配套模块(货号e7180s)的dna修复酶和缓冲液结合。[0294]52.按照牛津纳米孔技术操作说明书(gde_9063_v109_revq_14aug2019)所述，使用ampurexp珠在末端制备后纯化dna。[0295]53.使用qubit荧光计定量1μl纯化的dna。[0296]54.进行衔接子连接:按照牛津纳米孔技术操作说明书(gde_9063_v109_revq_14aug2019)所述，将60μl纯化dna与衔接子混合物(来自牛津纳米孔连接测序试剂盒)、t4dna连接酶(neb)和缓冲液合并。[0297]55.按照牛津纳米孔技术操作说明书(gde_9063_v109_revq_14aug2019)所述，在衔接头连接后，使用ampurexp珠纯化dna。[0298]56.使用qubit荧光计定量1μl纯化的dna。[0299]第十部分：纳米孔测序，使用牛津纳米孔技术minion纳米孔测序仪(注：可与其他牛津纳米孔测序仪例如和一起使用)。[0300]57.准备流通池：用冲洗缓冲液和拴系物冲洗液的混合物冲洗minion流通池(r9.4.1)。牛津纳米孔技术操作说明书(gde_9063_v109_revq_14aug2019)中详细描述了步骤。[0301]58.制备包含dna文库、测序缓冲液和加载的珠的测序前混合物。对于r9.4.1minion流通池，oxfordnanopore建议使用5‑50fmol测序文库中的dna。[0302]59.根据oxfordnanopore制造说明书，加载minion流通池。[0303]60.开始测序运行：通过usb3.0端口将minion连接到计算机。使用minknow软件运行minion测序反应，选择试剂盒(sqk‑lsk109)，“快速”碱基调用选项，并将运行时长设置为8小时。将输出设置为fastq和fast5文件。注：运行时长可随着流通池的类型、多路复用样品和测定设置的其他变化而变化。[0304]第十一部分：生物信息学分析[0305]61.将测序数据传输到epi2me软件进行生物信息学分析。[0306]62.考虑到插入的转座子/标识符序列，将测序数据映射到人类基因组grch38(或最新的参考基因组)。值得注意的是，通过pag‑mtn5插入转座子在插入的转座子每侧产生9bp重复[31]。因此，识别该标识符序列和/或这些重复位点的算法允许用户确定转座位点和ptm在染色质上的位置。[0307]oxfordnanopore发布了专门为纳米孔测序数据中的条形码识别和去卷积设计的软件(即albacore)，该软件将用于生物信息学流程的开发。[0308]条形码化pag‑mtn5‑加载有条形码化转座子的蛋白a/g融合高活性tn5[0309]缓冲液[0310]珠活化缓冲液[0311]20mmhepes，ph7.9[0312]10mmkcl[0313]1mmcacl2[0314]1mmmncl2[0315]过滤灭菌[0316]洗涤缓冲液[0317]洗涤缓冲液 2mmedta 0.01％洋地黄皂甙[0318]抗体缓冲液[0319]20mmhepesph7.5，150mmnacl[0320]2mmedta[0321]0.1％bsa[0322]0.5m亚精胺(0.5μl/ml)[0323]1xcpi‑mini[0324]wash300缓冲液[0325]20mmhepes，ph7.5[0326]300mmnacl[0327]tagmg10缓冲液[0328]20mmhepesph7.5，300mmnacl[0329]10mmmgcl2[0330]0.5m亚精胺(0.5μl/ml)[0331]1xcpi‑mini[0332]tagstop缓冲液[0333]10mmtaps，ph8.5[0334]0.03％sds[0335]dna修复和连接缓冲液[0336]10mmtris‑hcl[0337]10mmmgcl2[0338]50mmnacl[0339]1mmdtt[0340]缓冲液g2[0341]800mm盐酸胍[0342]30mmtris·cl，ph8.0[0343]30mmedta，ph8.0[0344]5％吐温‑20[0345]0.5％tritonx‑100[0346]缓冲液qbt(平衡缓冲液)[0347]750mmnacl[0348]50mmmops，ph7.0[0349]15％异丙醇[0350]0.15％tritonx‑100sitesinsinglecellsandffpetissuesamples.nature，2015.528(7580)：p.142‑6.(pubmedpmid：26605532)(pmc4697938)[0371]11.gircsi，p.g.，etal.，faire(formaldehyde‑assistedisolationofregulatoryelements)isolatesactiveregulatoryelementsfromhumanchromatin.genomeres，2007.17(6)：p.877‑85.(pubmedpmid：17179217)(pmc1891346)[0372]12.buenrostro，j.d.，etal.，atac‑seq：amethodforassayingchromatinaccessibilitygenome‑wide.currprotocmolbiol，2015.109：p.21291‑9.(pubmedpmid：25559105)(pmc4374986)[0373]13.buenrostro，j.d.，etal.，transpositionofnativechromatinforfastandsensitiveepigenomicprofilingofopenchromatin，dna‑bindingproteinsandnucleosomeposition.natmethods，2013.10(12)：p.1213‑8.(pubmedpmid：24097267)(pmc3959825)[0374]14.ameur，a.，w.p.kloosterman，andm.s.hestand，single‑moleculesequencing：towardsclinicalapplications.trendsbiotechnol，2019.37(1)：p.72‑85.(pubmedpmid：30115375)[0375]15.vandijk，e.l.，etal.，thethirdrevolutioninsequencingtechnology.trendsgenet，2018.34(9)：p.666‑681.(pubmedpmid：29941292)[0376]16.belser，c.，etal.，chromosome‑scaleassembliesofplantgenomesusingnanoporelongreadsandopticalmaps.natplants，2018.4(11)：p.879‑887.(pubmedpmid：30390080)[0377]17.minervini，c.f.，etal.，mutationalanalysisinbcr‑abl1positiveleukemiabydeepsequencingbasedonnanoporeminiontechnology.expmolpathol，2017.103(1)：p.33‑37.(pubmedpmid：28663031)[0378]18.norris，a.l.，etal.，nanoporesequencingdetectsstructuralvariantsincancer.cancerbiolther，2016.17(3)：p.246‑53.(pubmedpmid：26787508)(pmc4848001)[0379]19.volden，r.，etal.，improvingnanoporereadaccuracywithther2c2methodenablesthesequencingofhighlymultiplexedfull‑lengthsingle‑cellcdna.procnatlacadsciusa，2018.115(39)：p.9726‑9731.(pubmedpmid：30201725)(pmc6166824)[0380]20.byrne，a.，etal.，nanoporelong‑readrnaseqrevealswidespreadtranscriptionalvariationamongthesurfacereceptorsofindividualbcells.natcommun，2017.8：p.16027.(pubmedpmid：28722025)(pmc5524981)[0381]21.kurdyukov，s.andm.bullock，dnamethylationanalysis：choosingtherightmethod.biology(basel)，2016.5(1).(pubmedpmid：26751487)(pmc4810160)[0382]22.ludwig，c.h.andl.bintu，mappingchromatinmodificationsatthesinglecelllevel.development，2019.146(12).(pubmedpmid：31249006)(pmc6602357)[0383]23.euskirchen，p.，etal.，same‑daygenomicandepigenomicdiagnosisofbraintumorsusingreal‑timenanoporesequencing.actaneuropathol，2017.134(5)：p.691‑703.(pubmedpmid：28638988)(pmc5645447)[0384]24.quick，j.，etal.，rapiddraftsequencingandreal‑timenanoporesequencinginahospitaloutbreakofsalmonella.genomebiol，2015.16：p.114.(pubmedpmid：26025440)(pmc4702336)[0385]25.quick，j.，etal.，real‑time，portablegenomesequencingforebolasurveillance.nature，2016.530(7589)：p.228‑232.(pubmedpmid：26840485)(pmc4817224)[0386]26.faria，n.r.，etal.，establishmentandcryptictransmissionofzikavirusinbrazilandtheamericas.nature，2017.546(7658)：p.406‑410.(pubmedpmid：28538727)(pmc5722632)[0387]27.rand，a.c.，etal.，mappingdnamethylationwithhigh‑throughputnanoporesequencing.natmethods，2017.14(4)：p.411‑413.(pubmedpmid：28218897)(pmc5704956)[0388]28.harada，a.，etal.，achromatinintegrationlabellingmethodenablesepigenomicprofilingwithlowerinput.natcellbiol，2019.21(2)：p.287‑296.(pubmedpmid：30532068)[0389]29.cusanovich，d.a.，etal.，multiplexsinglecellprofilingofchromatinaccessibilitybycombinatorialcellularindexing.science，2015.348(6237)：p.910‑4.(pubmedpmid：25953818)(pmc4836442)[0390]30.lareau，c.a.，etal.，droplet‑basedcombinatorialindexingformassive‑scalesingle‑cellchromatinaccessibility.natbiotechnol，2019.37(8)：p.916‑924.(pubmedpmid：31235917)[0391]31.reznikoff，w.s.，transposontn5.annurevgenet，2008.42：p.269‑86.(pubmedpmid：18680433)当前第1页12当前第1页12
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