紫龙金片的高效液相色谱指纹图谱的构建方法及应用与流程

1.本发明涉及中药鉴别技术领域，尤其是涉及一种紫龙金片的高效液相色谱指纹图谱的构建方法及应用。


背景技术：

2.紫龙金片是天津中新药业集团股份有限公司隆顺榕制药厂生产的独家品种，质量标准收载于《中国药典》2010年版一部。药典标准中仅有三项鉴别及一项含量测定，无法涵盖紫龙金片中八味药材中众多成分的检测。
3.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的目的之一在于提供一种紫龙金片的高效液相色谱指纹图谱的构建方法，能够全面、客观以及准确地检测和评价紫龙金片的药品质量。
5.本发明的目的之二在于本发明提供的方法在评价紫龙金片的药品质量方面的应用。
6.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
7.第一方面，本发明提供了一种紫龙金片的高效液相色谱指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
8.a)提供供试品溶液和参照物溶液；
9.参照物包括丹酚酸b和丹参酮ⅱa对照品，以及丹参、半枝莲和蛇莓对照药材；
10.b)采用高效液相色谱法对供试品溶液和参照物溶液进行分析，构建高效液相色谱指纹图谱；
11.其中，高效液相色谱条件包括：
12.色谱柱：waters symmetry c
18
色谱柱；
13.柱温为20～30℃；
14.流动相：流动相a为0.05％～0.15％磷酸和85％～95％的乙腈溶液，流动相b为0.05％～0.15％的磷酸溶液；
15.梯度洗脱程序为，按体积百分数计：
16.0～7min，a：12
→
17％、b：88
→
83％；
17.7～12min，a：17％、b：83％；
18.12～24min，a：17
→
22％、b：83
→
78％；
19.24～33min，a：22
→
27％、b：78
→
73％；
20.33～44min，a：27
→
32％、b：73
→
68％；
21.44～51min，a：32
→
77％、b：68
→
23％；
22.51～75min，a：77
→
92％、b：23
→
8％；
23.流速为0.75～1.0ml/min；
24.检测波长为230～320nm。
25.优选地，所述紫龙金片的高效液相色谱指纹图谱中包括如下7个共有峰：
26.共有峰中峰1来源于蛇莓；峰2 峰3来源于半枝莲；峰4为丹酚酸b峰；峰5 峰6来源于丹参；峰7为丹参酮ⅱa峰。
27.优选地，所述各共有峰的相对保留时间变化范围为
±
5％。
28.优选地，在所述参照物的高效液相色谱指纹图谱中，以丹酚酸b为参照峰s，计算紫龙金片的各特征峰与s峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的
±
5％之内；
29.进一步的，所述规定值为：
30.26.2
‑
峰1、30.1
‑
峰2、43.5
‑
峰3、45.1
‑
峰4(s)、63.2
‑
峰5、63.0
‑
峰6、69.1
‑
峰7。
31.优选地，所述柱温22～28℃，流速0.80～1.0ml/min，检测波长250～310nm；
32.进一步的，柱温25℃，流速0.90ml/min，检测波长270nm。
33.所述供试品溶液的制备过程，包括以下步骤：
34.有机溶剂溶解紫龙金片，加热回流，冷却，有机溶剂补足损失的重量，滤过，得到供试品溶液；
35.优选地，所述有机溶剂为甲醇。
36.所述对照品溶液的制备过程，包括以下步骤：
37.提供含丹酚酸b和丹参酮ⅱa的对照品溶液；
38.优选地，甲醇溶解丹酚酸b和丹参酮ⅱa。
39.所述对照药材溶液的制备过程，包括以下步骤：
40.分别提供丹参、半枝莲和蛇莓制成的干膏粉，利用有机溶剂溶解，加热回流，冷却，有机溶剂补足损失的重量，滤过，得到对照药材溶液；
41.优选地，所述有机溶剂为甲醇。
42.优选地，所述构建对照品和对照药材的高效液相色谱指纹图谱的过程，包括：建立对照品色谱图、建立丹参对照药材色谱图、建立丹参阴性对照色谱图、建立蛇莓药材色谱图、建立蛇莓阴性对照色谱图、建立半枝莲药材色谱图以及建立半枝莲阴性对照色谱图。
43.第二方面，本发明提供的方法在评价紫龙金片的药品质量方面的应用。
44.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
45.本发明提供的指纹图谱检测方法，经特征图谱方法学验证，可以全面、客观以及准确地检测和评价紫龙金片的药品质量，可以从源头上保证紫龙金片的安全性和有效性，保证临床疗效。
附图说明
46.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
47.图1为本发明实施例1提供的紫龙金片部分色谱峰的归属图；
48.图2为本发明实施例1提供的供试品色谱图；
49.图3为本发明实施例1提供的混合对照品色谱图；
50.图4为本发明实施例1提供的丹参对照药材色谱图；
51.图5为本发明实施例1提供的丹参阴性对照色谱图；
52.图6为本发明实施例1提供的蛇莓药材色谱图；
53.图7为本发明实施例1提供的蛇莓阴性对照色谱图；
54.图8为本发明实施例1提供的半枝莲药材色谱图；
55.图9为本发明实施例1提供的半枝莲阴性对照色谱图；
56.图10为本发明试验例1提供的紫龙金片主要特征峰；
57.图11为本发明试验例2提供的流动相系统为乙腈
‑
0.1％磷酸溶液时的色谱图；
58.图12为本发明试验例2提供的流动相系统为甲醇
‑
0.1％磷酸溶液时的色谱图；
59.图13为本发明试验例2提供的流动相系统为乙腈
‑
20mmol/l磷酸二氢钾(ph＝3.2)溶液时的色谱图；
60.图14为本发明试验例2提供的流动相系统为甲醇
‑
1％冰醋酸溶液时的色谱图；
61.图15为本发明试验例2提供的流动相系统为甲醇
‑
乙腈(7：3)
‑
1％冰醋酸溶液时的色谱图；
62.图16为本发明试验例2提供的流动相系统为乙腈
‑
0.1％三氟乙酸溶液时的色谱图；
63.图17为本发明试验例2提供的流动相系统为0.1％磷酸的90％乙腈溶液
‑
0.1％磷酸溶液时的色谱图；
64.图18为本发明试验例3提供的当检测色谱柱为waters symmetry c
18
(4.6
×
250mm，5μm)时的色谱图；
65.图19为本发明试验例3提供的当检测色谱柱为phenonmenex luna c
18
(2)(4.6
×
250mm，5μm)时的色谱图；
66.图20为本发明试验例3提供的当检测色谱柱为acchrom xaqua c
18
(4.6
×
250mm，5μm)时的色谱图；
67.图21为本发明试验例3提供的当检测色谱柱为sheishido capcell c
18
(4.6
×
250mm，5μm)时的色谱图；
68.图22为本发明的试验例3提供的当检测色谱柱为agilent zorbax sb
‑
c
18
(250
×
4.6mm，5μm)时的色谱图；
69.图23为本发明的样品测定中提供的色谱图。
具体实施方式
70.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
71.根据本发明的第一个方面，一种紫龙金片的高效液相色谱指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
72.a)提供供试品溶液和参照物溶液；
73.参照物包括丹酚酸b和丹参酮ⅱa对照品，以及丹参、半枝莲和蛇莓对照药材；
74.在一种优选地实施方式中，供试品溶液的制备过程，包括以下步骤：
75.有机溶剂溶解紫龙金片，加热回流，冷却，有机溶剂补足损失的重量，滤过，得到供试品溶液；
76.其中，有机溶剂为甲醇。
77.具体为，提供同一批号的除去包衣和研细过的紫龙金片0.8g，甲醇溶解提取，加热回流40分钟，放冷，80％甲醇补足损失的重量，摇匀，滤过，得到供试品溶液。
78.参照物溶液包括对照品溶液和对照药材溶液；
79.在一种优选地实施方式中，对照品溶液的制备过程，包括以下步骤：
80.提供含丹酚酸b和丹参酮ⅱa的混合对照品溶液；
81.其中，利用甲醇溶解丹酚酸b和丹参酮ⅱa。
82.具体的，提供每1ml含丹酚酸b 0.15mg和丹参酮ⅱa 0.01mg的混合对照品溶液，80％甲醇溶解丹酚酸b和丹参酮ⅱa。
83.在一种优选地实施方式中，对照药材溶液的制备过程，包括以下步骤：
84.分别提供丹参、半枝莲和蛇莓制成的干膏粉，利用有机溶剂溶解，加热回流，冷却，有机溶剂补足损失的重量，滤过，得到对照药材溶液；
85.其中，有机溶剂为甲醇。
86.b)采用高效液相色谱法对供试品溶液和参照物溶液进行分析，构建高效液相色谱指纹图谱；
87.其中，高效液相色谱条件包括：
88.色谱柱：waters symmetry c
18
色谱柱；
89.柱温：20～30℃；
90.流动相：按体积百分数计，流动相a为0.05％～0.15％磷酸和85％～95％乙腈溶液，流动相b为0.05％～0.15％磷酸溶液；
91.按体积百分数计，梯度洗脱程序为：
92.0～7min，a：12
→
17％、b：88
→
83％；
93.7～12min，a：17％、b：83％；
94.12～24min，a：17
→
22％、b：83
→
78％；
95.24～33min，a：22
→
27％、b：78
→
73％；
96.33～44min，a：27
→
32％、b：73
→
68％；
97.44～51min，a：32
→
77％、b：68
→
23％；
98.51～75min，a：77
→
92％、b：23
→
8％；
99.流速：0.75～1.0ml/min，检测波长：230～320nm。
100.紫龙金片
101.紫龙金片，由黄芪、当归、白英、龙葵、丹参、半枝莲、蛇莓、郁金组成。具有益气养血，清热解毒，理气化瘀的功效，由天津中新药业集团股份有限公司隆顺榕制药厂生产。
[0102][0103]
高效液相色谱
[0104]
高效液相色谱法又叫做高压或高速液相色谱、高分离度液相色谱或近代柱色谱，以液体为流动相，采用高压输液系统，是色谱法的一个重要分支。
[0105]
高效液相色谱是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入待测样品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
[0106]
色谱柱
[0107]
色谱柱可分为填充柱和开管柱两大类。多为金属或玻璃制作。有直管形、盘管形、u形管等形状。液相色谱通常均采用填充柱，色谱柱的分离效果取决于所选择的固定相，以及色谱柱的制备和操作条件。
[0108]
在本发明的特征图谱的研究过程中，为消除其它成分峰对共有峰色谱分离的影响，必须提高色谱柱的选择性，并且配合较复杂的梯度洗脱程序以强化各化合物峰的分离。经过筛选，除waters symmetry色谱柱外，其它品牌的色谱柱对紫龙金片特征图谱的分析结果不甚理想。
[0109]
梯度洗脱
[0110]
梯度洗脱(gradient elution)又称为梯度淋洗或程序洗脱。在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，称为梯度洗脱。
[0111]
本发明提供的特定梯度洗脱程序可以缩短分析周期、提高分离能力、改善峰型以及很少拖尾。
[0112]
流动相
[0113]
色谱过程中携带待测组分向前移动的物质称为流动相；与固定相处于平衡状态、带动样品向前移动的另一相。
[0114]
本发明的提供的流动相能对检测样品实现有效的分离，带来更加清楚的实验结果。
[0115]
流动相a的体积百分数典型但非限制性的组成例如为0.05％磷酸和95％的乙腈溶液、0.10％磷酸和90％的乙腈溶液、0.15％磷酸和85％的乙腈溶液；
[0116]
流动相b的体积百分数典型但非限制性的组成例如为0.05％的磷酸溶液、0.10％的磷酸溶液、0.15％的磷酸溶液；
[0117]
在一种优选地实施方式中，流动相a和流动相b的组合为：
[0118]
0.10％的磷酸和90％的乙腈的溶液为流动相a，0.1％的磷酸的溶液为流动相b。
[0119]
该体积百分比的流动相组合的实验效果为最优。
[0120]
优选地，柱温22～28℃，流速0.80～1.0ml/min，检测波长250～310nm；
[0121]
进一步优选地，柱温25℃，流速0.90ml/min，检测波长270nm。
solution工作站。
[0146]
色谱柱：waters symmetry c
18
(4.6
×
250mm，5μm)色谱柱；
[0147]
phenomenex luna c
18
(2)(250
×
4.6mm，5μm)色谱柱；
[0148]
acchrom xaqua c
18
(4.6
×
250mm，5μm)色谱柱；
[0149]
sheishido capcell c
18
(4.6
×
250mm，5μm)色谱柱；
[0150]
agilent zorbax sb
‑
c
18
(250
×
4.6mm，5μm)色谱柱。
[0151]
试剂：乙腈、甲醇、冰醋酸(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)；磷酸、磷酸二氢钾(分析纯，天津市赢达稀贵化学试剂厂)；三氯甲烷、乙酸乙酯、盐酸(分析纯，天津市康科德科技有限公司)三氟乙酸(色谱纯，tedia)；水为去离子水。
[0152]
对照品：丹酚酸b(批号：111562
‑
201212 95.4％)，丹参酮ⅱa(批号：110766
‑
200417)均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用。
[0153]
对照药材：丹参、半枝莲、蛇莓药材均由隆顺榕制药厂提供。
[0154]
紫龙金片：由隆顺榕制药厂提供。
[0155]
供试品溶液的制备：
[0156]
取同一批号紫龙金片(批号：be35503)，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流40分钟，放冷，80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，作为供试品溶液。
[0157]
对照品溶液的制备：
[0158]
分别取丹酚酸b对照品、丹参酮ⅱa对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每1ml含丹酚酸b 0.15mg和丹参酮ⅱa0.01mg的混合对照品溶液。
[0159]
对照药材溶液的制备：
[0160]
分别取丹参、半枝莲、蛇莓按制法工艺制成干膏粉，再取适量按上述供试品溶液的制备方法进行操作提取，作为对照药材溶液；
[0161]
所述制法工艺具体步骤如下：
[0162]
醇提取配料：
[0163]
丹参：乙醇提取两次，第一次按原料重量的8倍加95％乙醇，加热煮至沸腾，保持1.5小时，醇提取液由管道经100目过滤器送至贮液罐。第二次按原料重量的8倍加50％乙醇，加热煮至沸腾，保持1.5小时，醇提取液由管道经100目过滤器送至贮液罐。第三次按原料重量的10倍加提取用水，加热煮至沸腾，保持2小时，水提取液由管道经100目过滤器送至贮液罐。
[0164]
将贮液罐内药液经管道，分别打入平衡型双效浓缩罐，减压浓缩，浓缩至适量，移入单效外循环蒸发设备继续浓缩，减压浓缩至相对密度1.24～1.30；将醇浓缩膏加入真空干燥机中，干燥，干燥产物为大颗粒，真空干燥温度为60℃～90℃。
[0165]
半枝莲、蛇莓：水煮2次，第一次按原料重量的15倍加提取用水，加热煮至沸腾，保持2小时，水提取液由管道经100目过滤器送至贮液罐；第二次按原料重量的10倍加提取用水，加热煮至沸腾，保持1小时，水提取液由管道经100目过滤器送至贮液罐。将贮液罐内药液经管道，分别打入板式蒸发设备，加热浓缩，浓缩至适量，移入单效外循环蒸发设备继续浓缩；继续浓缩，浓缩至相对密度1.24～1.30(60℃)，将药放入储罐中。
[0166]
将水浓缩膏加纯化水稀释，加浓缩膏重量约2倍的纯化水，稀释至相对密度1.05
‑
1.15(55℃)，浓缩液收得量87.5～106.9万ml，将药液放入储罐中。将水浓缩液进行喷雾干
燥，得到干燥后的细粉。
[0167]
紫龙金片色谱峰的确认：
[0168]
紫龙金片特征图谱中有7个共有峰，经与各对照品、对照药材的比对，结合hplc
‑
dad分析，确定了部分色谱峰的归属，结果见图1。具体的，峰1：来源于蛇莓；峰2 峰3：来源于半枝莲；峰4：丹酚酸b；峰5 峰6：来源于丹参；峰7：丹参酮ⅱa。供试品色谱图，混合对照品色谱图，丹参对照药材色谱图，丹参阴性对照色谱图，蛇莓药材色谱图，蛇莓阴性对照色谱图，半枝莲药材色谱图，半枝莲阴性对照色谱图，见图2
‑
图9。
[0169]
试验例1
[0170]
供试品溶液制备方法的选择
[0171]
取同一批号紫龙金片，除去包衣，研细，取5份，各约0.8g，分别进行如下操作：
[0172]
①
精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，功率40khz)40分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；
[0173]
②
精密加入80％甲醇25ml，同
①
法操作；
[0174]
③
精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流40分钟，放冷，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；
[0175]
④
精密加入甲醇
‑
三氯甲烷(3:1)混合溶剂25ml，同
③
法操作，精密量取续滤液15ml，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀；
[0176]
⑤
精密加入甲醇25ml，同
③
法操作，精密量取续滤液15ml，蒸干，残渣加水20ml使溶解，用稀盐酸调节ph＝2，用乙酸乙酯萃取完全，减压回收溶剂，残渣用甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。
[0177]
结果见表1及图10，试验表明，80％甲醇回流40分钟，直接过滤的方法对样品中不同极性主成分的提取率最高，因此
③
作为供试品溶液的制备方法。
[0178]
表1不同方法提取效率比较
[0179][0180][0181]
试验例2
[0182]
色谱流动相系统的选择
[0183]
采用waters symmetry c
18
(4.6
×
250mm，5μm)色谱柱，进行了：
①
乙腈
‑
磷酸水，
②
甲醇
‑
磷酸水，
③
乙腈
‑
磷酸盐缓冲液，
④
甲醇
‑
醋酸水，
⑤
乙腈、甲醇混合溶剂
‑
醋酸水，
⑥
乙腈
‑
三氟乙酸水，
⑦
0.1％磷酸的90％乙腈溶液
‑
磷酸水等不同流动相体系的试验。
[0184]
结果表明系统
⑦
配合梯度洗脱方式对紫龙金片中相关成分的分离效果最好，色谱图结果见图11
‑
17。
[0185]
优选后的流动相系统体现出两相预混合的优势，最大限度地保证了特征图谱在不同型号仪器上的重现性和稳定性。
[0186]
最终确定以0.1％磷酸的90％乙腈溶液为流动相a，0.1％磷酸溶液为流动相b，梯度洗脱程序如下：
[0187]
表2梯度洗脱程序
[0188][0189]
试验例3
[0190]
色谱柱的选择
[0191]
分别试用了：
[0192]
①
waters symmetry c
18
(4.6
×
250mm，5μm)色谱柱；
[0193]
②
phenomenex luna c
18
(2)(250
×
4.6mm，5μm)色谱柱；
[0194]
③
acchrom xaqua c
18
(4.6
×
250mm，5μm)色谱柱；
[0195]
④
sheishido capcell c
18
(4.6
×
250mm，5μm)色谱柱；
[0196]
⑤
agilent zorbax sb
‑
c
18
(250
×
4.6mm，5μm)色谱柱。
[0197]
采用所确定的流动相系统，270nm检测，进行紫龙金片的hplc分析，结果见图18
‑
22。综合评价，waters symmetry色谱柱对紫龙金片相关成分的分离效果最优。
[0198]
特征图谱方法学的验证
[0199]
1、精密度试验
[0200]
取紫龙金片的供试品溶液，按所建立的hplc特征图谱分析条件分析，连续进样5次，每次10μl，其特征图谱中应呈现7个特征峰，其中1个峰与参照物峰保留时间一致；与丹酚酸b参照物峰相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间均在规定值的
±
5％之内，结果见表3。
[0201]
表3精密度试验结果
[0202][0203]
2、日间精密度试验
[0204]
取同一批号紫龙金片(批号：be35503)供试品溶液，按所建立的hplc特征图谱分析条件分析，连续进样5次，每次10μl，连续操作3天，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间均在规定值的
±
5％之内，结果见表4。
[0205]
表4日间精密度试验结果
[0206]
[0207][0208]
3、重复性试验
[0209]
取同一批号紫龙金片，重复制备5份供试品溶液，其相对保留时间均在规定值的
±
5％之内，结果见表5。
[0210]
表5重复性试验结果
[0211]
[0212][0213]
4、稳定性试验
[0214]
取同一批号供试品溶液，室温，在0、4、8、16、24以及48小时进行特征图谱分析，其相对保留时间均在规定值的
±
5％之内，试验结果见表6。
[0215]
表6稳定性试验结果
[0216][0217]
样品测定
[0218]
取各批次紫龙金片供试品溶液，按所建立的hplc特征图谱分析条件分析。供试品特征图谱中应呈现7个特征峰，其中1个峰与参照物峰保留时间一致；与丹酚酸b参照物峰相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间均在规定值的
±
5％之内，测试结果见表7，图23。
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表7样品测定结果
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[0222][0223]
理论板数的确定
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在系统适用性试验中理论板数按丹酚酸b(s)峰计约为230000，本试验暂将理论板数规定为20000。必要时，根据复核单位的试验结果再做进一步调整。
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结论：
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紫龙金片由八味药材组方，涉及醇提和水提工艺。各味药材的化合物成分在相互影响和相互作用中成就了该品种相对复杂的物质体系。在特征图谱研究过程中，为消除其它成分峰对共有峰色谱分离的影响，必须提高试验对色谱柱的选择性，并且配合较复杂的梯度洗脱程序以强化各化合物峰的分离。然而，在得到满意分离度的同时，必然损失了方法的耐用性。实际情况是，除waters symmetry色谱柱外，其它品牌的色谱柱对紫龙金片特征图谱的分析结果不甚理想。
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综上所述，本发明通过大量实验筛选出最佳的流动相组成、梯度洗脱程序、色谱柱、检测波长、检测柱温以及检测流速等分析条件。经多次实验验证，本发明提供的指纹图谱检测方法，可以全面、客观以及准确地检测和评价紫龙金片的药品质量，可以从源头上保证紫龙金片的安全性和有效性，保证临床疗效。
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最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽
管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。