一种基于适配体门控介孔二氧化硅的金黄色葡萄球菌检测方法与流程

1.本发明介绍了一种基于适配体门控介孔二氧化硅的金黄色葡萄球菌检测方法，将信号分子负载于氨化介孔二氧化硅微球中，并通过适配体对其进行静电包覆，利用适配体和细菌的特异性结合后信号分子的释放，建立基于sers的金黄色葡萄球菌定量检测的标准曲线。本发明方法操作简单，检测速度快、精度较高、稳定性好等可以实现对金黄色葡萄球菌的定量检测。该方法适用于食品安全、材料化学等技术领域。


背景技术：

2.食源性致病菌是指可以引起食物中毒或以食品为传播媒介的致病性细菌。食源性致病菌的种类多达几十种，常见的主要包括沙门氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌等。通常易被食源性致病菌污染的食品包括牛肉和家禽、鸡蛋和蛋制品以及鱼和鱼制品等。由细菌引起的食源性疾病对食品安全提出了持续的挑战，被认为是普遍的，代价高昂的全球公共卫生问题。因此，迫切需要开发能够有效检测和鉴定病原菌的快速，低成本，高灵敏度的方法，这对食源性疾病的预防和控制，确保食物源头的安全具有十分重要的意义。
3.传统的食源性病原菌检测是以培养为基础的微生物检测和鉴定方法，虽然简单、相对便宜，但这种检测方法需要生理特性的筛选，比较消耗时间，而且每次只能检测单种病原菌，在食品生产过程中，需要检测多种病原菌才能保证食品的安全。因此，传统的微生物检测方法已经不能满足食品生产和检疫的要求。近年来，检测技术从耗时较长的培养基筛选，发展到特异性较强的酶联免疫分析技术(elisa)和可同时检测多种病原菌的聚合酶链反应技术(pcr)，再延伸到现代常用检测技术中的生物传感器等分析技术，这些检测方法得到了快速发展。
4.基于免疫学elisa是应用最广泛的病原菌检测方法之一，是最常用的抗体/抗原微量检测技术，已用于探索细菌细胞膜表面的特定抗原的抗体特异性。elisa利用抗原抗体的免疫特异性和酶催化的高效性来放大检测信号，特异性和灵敏性较强。然而，这些方法需要使用特异性抗体，抗体的纯度对免疫分析的成功起着主要作用，因此，特异性抗体的制备增加了检测前处理的难度和检测成本，这些高技术要求，限制了其广泛应用。
5.pcr是即时诊断法中使用最广泛的基于核酸的技术，在细菌检测中得到了广泛的应用。它基于包括目标细菌的遗传物质在内的短dna序列的分离，扩增和定量。pcr技术的局限性之一在于无法区分活细胞和死细胞，因为无论细胞的死活，dna总是存在。基于pcr的检测方法已用于通过靶向致病菌的特定基因来鉴定致病菌。但是，这些方法在很大程度上依赖于劳动密集型的基于凝胶的检测过程，该过程对pcr产物的灵敏度和特异性均较差。且通常需要冗长的pcr前富集来提高灵敏度，显著地增加了检测时间。
6.生物传感器是一种新兴的现代检测技术，是通过将分析物与生物识别元件的反应表面结合来进一步检测样品的方法。生物传感器的操作方法简单，用户不需要特殊技能。生
物传感器的主要优点是可以在较低的检测限下，以较高的特异性和灵敏度检测到病原体，具有更好的检测限，减少和消除了pcr技术的缺陷。但该技术一般需要昂贵的仪器，以及兼容的计算机软件，才能得到准确的结果。因此，该技术的检测成本较高。以上病原微生物检测方法在一定程度上具有良好的快速性和有效性，但是各自存在一些局限性，比如耗时长、前处理复杂等。因此，迫切需要一种具有样品预处理简单、成本低、灵敏度高、重复性好、便于现场检测等优点的检测方法。
7.表面增强拉曼光谱(surface
‑
enhanced raman scattering，sers)技术是拉曼光谱的延伸与完善。其光谱可以获取分子结构的指纹信息，具有强大的分子识别能力，是分子信息快速获取的理想手段。因此，表面增强拉曼方法在构建痕量物质的快速、灵敏检测传感器方面，得到了很大的关注与应用。根据被测物特定波长下的拉曼峰强度，可以建立被测物浓度和拉曼峰强度之间的线性关系，实现对被测物浓度的定量分析。本发明介绍了一种基于适配体门控介孔二氧化硅的金黄色葡萄球菌检测方法，将信号分子负载于氨化介孔二氧化硅微球中，并通过适配体对其进行静电包覆，利用适配体和细菌的特异性结合后信号分子的释放，建立基于sers的金黄色葡萄球菌定量检测的标准曲线，可提高检测细菌的稳定性和灵敏性。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种基于适配体门控介孔二氧化硅的金黄色葡萄球菌检测方法，其灵敏度高、可靠性强、检测速度快，可以实现金黄色葡萄球菌的快速定量检测。
9.为了实现上述目的，本发明的技术方案包括：合成氨基化的负载信号分子的介孔二氧化硅微球，将适配体通过静电吸附包裹于带正电荷的介孔二氧化硅表面，通过金黄色葡萄球菌和适配体的特异性结合导致的信号分子释放，建立金黄色葡萄球菌定量检测的标准曲线。本发明方法操作简单，检测速度快、精度较高、稳定性好等可以实现对细菌电量检测。该方法适用于食品安全、材料化学等技术领域。
10.一种基于适配体门控介孔二氧化硅的金黄色葡萄球菌检测方法，合成了一种适配体包覆的负载信号分子的介孔二氧化硅微球，以金黄色葡萄球菌为目标对象，通过适配体的特异性结合，结合拉曼光谱技术构建对金黄色葡萄球菌的定量检测体系。
11.进一步，合成了一种适配体包覆的负载信号分子的介孔二氧化硅微球中，通过溶胶
‑
凝胶法合成了介孔二氧化硅纳米微球，接着通过(3
‑
氨基丙基)三乙氧基硅烷即aptes对合成的介孔二氧化硅微球表面进行氨基修饰，使其表面带有正电荷。
12.进一步，通过摇床在氨基化的介孔二氧化硅的孔洞内负载上信号分子，后通过释放的信号分子量来定量金黄色葡萄球菌(本方法中使用的是4
‑
氨基苯硫酚，4
‑
atp)。
13.进一步，合成了一种适配体包覆的负载信号分子的介孔二氧化硅微球中，利用适配体自身带正电荷的特性，通过静电吸附成功包覆于带正电荷的氨基修饰的负载信号分子的介孔二氧化硅微球表面，制备了适配体包覆的负载信号分子的介孔二氧化硅体系，在金黄色葡萄球菌的检测过程中通过适配体和细菌的特异性结合，对金黄色葡萄球菌进行捕捉。
14.进一步，结合拉曼光谱技术构建对金黄色葡萄球菌的定量检测体系过程中，通过拉曼光谱仪对释放的信号分子进行检测，通过筛选信号分子的拉曼特征峰，建立金黄色葡
萄球菌检测的标准曲线，实现了金黄色葡萄球菌的定量检测。
15.进一步，还包括，合成银纳米花
‑
二氧化硅核壳结构ag nfs@sio2作为表面增强拉曼基底，对释放的4
‑
氨基苯硫酚分子进行拉曼增强。
16.进一步，还包括，采用基于表面增强拉曼sers的通过释放的信号分子量定量金黄色葡萄球菌，与通过适配或抗体构建的夹心结构的检测方法相比。
17.进一步，该方法包括如下具体步骤：
18.1)银纳米花ag nfs基底的制备：
①
银种子的合成：通过柠檬酸钠还原ag离子合成ag种子；首先将1
‑
10mm agno3溶液100ml在空气中搅拌加热至沸腾，确保样品已经充分溶解，然后将0.01
‑
0.05g/ml为10ml的柠檬酸三钠溶液滴加到煮沸的agno3溶液中，磁力搅拌1
‑
2h以确保完全还原，所得的透明淡黄色液体即为银种子；随后将溶液冷却至室温，将其作为种子溶液用于银纳米花的制备；
②
银纳米花的合成：将10
‑
20ml银种子溶液滴加到5
‑
20mm为20ml的抗坏血酸溶液中，反复摇晃确保其溶解，然后在室温下将50
‑
200mm为10ml的agno3溶液通过微量移液枪快速加入上述溶液中，无需搅拌，溶液颜色在很短时间内迅速从淡黄色变成黑色，将混合溶液静置，最后将溶液中的沉淀物用去离子水和乙醇反复清洗；
19.2)银纳米花
‑
二氧化硅核壳结构ag nfs@sio2基底的制备：将上述离心后的agnfs分散于乙醇的水溶液中乙醇：水＝3:1，v/v，然后加入0.2
‑
0.6g的聚乙烯吡咯烷酮pvp并持续搅拌，随后通过6000
‑
7500rpm离心10min并用乙醇的水溶液分散，离心的目的是将改性的ag纳米颗粒与溶液分离；然后加入5
‑
10ml为25％nh3·
h2o，搅拌30min后加入100
‑
200μl(99％)teos,室温下连续搅拌过夜，确保均匀的包覆。最后8000
‑
9000rpm离心10min并用去离子水和乙醇交替清洗；
20.3)氨基化介孔二氧化硅纳米颗粒msn
‑
nh2的制备：将0.5
‑
2g十六烷基三甲基溴化铵ctab溶于去离子水中，naoh水溶液(1
‑
5m)加入到ctab溶液中，80℃下搅拌反应，然后将1
‑
10ml四乙氧基硅烷teos在充分搅拌下逐滴加入到ctab溶液中，混合物反应2h，产生白色沉淀，停止反应；冷却后过滤的固体粗产品，用水和甲醇清洗，干燥得到未去除模板的msn，将合成的未去除模板的msn分散于乙醇中，加入0.5
‑
1ml3
‑
氨基丙基)三乙氧基硅烷，混合物80℃氮气保护回流反应过夜；msn
‑
nh2通过离心分离，用乙醇洗涤，干燥，将样品分散于含浓盐酸的甲醇溶液中，回流反应24h，去除表面活性剂ctab，反应结束后，过滤，用水和甲醇洗涤，真空干燥得msn
‑
nh2；
21.4)适配体门控信号分子负载的氨基化介孔二氧化硅纳米颗粒的制备：将1
‑
10mg的氨基化msns分散到500μl的含有4
‑
氨基苯硫酚(1
‑
3m)的pbs缓冲溶液中，然后将所得混合物在摇床上于室温下轻轻摇动12h，在此过程中，4
‑
atp分子扩散到胺化的msns的孔中，然后将500μl的适配体5
‑
15μm添加到所得悬浮液中，将混合物在室温下轻轻搅拌4h，由于带正电的msns和带负电的适配体之间的静电相互作用，适配体包覆于aptes功能化msns的表面上；随后，将包裹有适配体的msns离心并用蒸馏水洗涤，以除去过量的4
‑
atp分子和适配体；最后，将装有信号分子的适配体包覆的msns重新分散到pbs缓冲溶液中，以备进一步使用；
22.5)样品表面增强拉曼光谱的采集：将500μl预先制备的适配体包覆的msns注入5ml离心管中，加入不同浓度的金黄色葡萄球菌500μl溶液，并在37℃下孵育5
‑
10min；将混合物在室温以4000
‑
6000rpm离心5min，在780nm激光激发下，利用拉曼光谱仪对取得的上清液进行拉曼光谱采集，从而建立拉曼信号强度和对应金黄色葡萄球菌浓度间的标准曲线。
23.与现有的技术相比，本发明的优点在于：
24.1)本发明设计了一种基于适配体门控介孔二氧化硅的细菌检测方法实现了金黄色葡萄球菌的定量检测，节约检测成本，提高了检测速度。
25.2)本发明制备的ag nfs@sio2表面增强拉曼基底，在ag nfs表面包覆一层惰性的sio2薄壳，改善了ag nfs颗粒易聚集的特性，同时在对银的表面进行了修饰，扫除了贵金属银与sio2表面性质差距过大不易包覆的难题。
26.3)本发明制备的的检测方法可用于食品中致病菌的定量检测，其检测速度快，检测范围广，稳定性、灵敏度高，在食品安全、环境监测等技术领域广泛应用。
附图说明
27.图1为适配体门控介孔二氧化硅包覆体系的表征图：(a)为ag nfs@sio2的x射线衍射图；(b)为msns、msns
‑
nh2和msns
‑
apt紫外光谱图。
28.图2为不同浓度金黄色葡萄球菌的表面增强拉曼光谱图。
29.图3为不同浓度金黄色葡萄球菌的标准曲线图。
具体实施方式
30.实施实例1为了进一步验证本发明所制备的检测方法对鱼肉中金黄色葡萄球菌的检测作用，本发明实例，以金黄色葡萄球菌的检测为例，具体操作步骤如下：
31.1)银纳米花(ag nfs)基底的制备：
①
银种子的合成：通过柠檬酸钠还原ag离子合成ag种子。首先将5mm agno3溶液(100ml)在空气中搅拌加热至沸腾，确保样品已经充分溶解。然后将0.02g/ml(10ml)柠檬酸三钠溶液滴加到煮沸的agno3溶液中，磁力搅拌1.5h以确保完全还原，所得的透明淡黄色液体即为银种子。随后将溶液冷却至室温，将其作为种子溶液用于银纳米花的制备。
②
银纳米花的合成：将15ml银种子溶液滴加到10mm(20ml)抗坏血酸溶液中，反复摇晃确保其溶解。然后在室温下将100mm(10ml)agno3溶液通过微量移液枪快速加入上述溶液中，无需搅拌，溶液颜色在很短时间内迅速从淡黄色变成黑色。将混合溶液静置2h。最后将溶液中的沉淀物用去离子水和乙醇反复清洗。
32.2)银纳米花
‑
二氧化硅核壳结构(ag nfs@sio2)基底的制备：将上述离心后的agnfs分散于45ml乙醇的水溶液中(乙醇：水＝3:1，v/v)。然后加入0.4g的聚乙烯吡咯烷酮(pvp)并搅拌1h。随后通过6500rpm离心10min并用75ml的乙醇和25ml的水分散，离心的目的是将改性的ag纳米颗粒与溶液分离。然后加入5ml(25％)nh3·
h2o，搅拌30min后加入150μl(99％)teos,室温下连续搅拌24h，确保均匀的包覆。最后8500rpm离心10min并用去离子水和乙醇交替清洗。
33.3)氨基化介孔二氧化硅纳米颗粒(msn
‑
nh2)的制备：将1g十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶于480ml去离子水中，naoh水溶液(2m,3.5ml)加入到ctab溶液中，温度调到80℃，搅拌反应。然后将5ml四乙氧基硅烷(teos)在充分搅拌下逐滴加入到ctab溶液中，混合物反应2h，产生白色沉淀，停止反应。冷却后过滤的固体粗产品，用水和甲醇清洗，干燥得到未去除模板的msn。将合成的未去除模板的msn分散于50ml乙醇中，加入0.7ml aptes，混合物80℃氮气保护回流反应12h。msn
‑
nh2通过离心分离，用乙醇洗涤三次，干燥。将样品分散于160ml含9ml浓盐酸(37.4％)的甲醇溶液中，回流反应24h，去除表面活性剂ctab。反应结束
后，过滤，用水和甲醇洗涤，真空干燥得msn
‑
nh2。
34.4)适配体门控信号分子负载的氨基化介孔二氧化硅纳米颗粒的制备：将5mg的氨基化msns分散到500μl的含有4
‑
氨基苯硫酚(2.5m)的ph＝7.5pbs缓冲溶液中，然后将所得混合物在摇床上于室温下轻轻摇动12h。在此过程中，4
‑
atp分子扩散到胺化的msns的孔中。然后将500μl的适配体(10μm)添加到所得悬浮液中，将混合物在25℃下轻轻搅拌4h。由于带正电的msns和带负电的适配体之间的静电相互作用，适配体包覆于aptes功能化msns的表面上。随后，将包裹有适配体的msns离心并用蒸馏水洗涤，以除去过量的4
‑
atp分子和适配体。最后，将装有信号分子的适配体包覆的msns重新分散到500μl的pbs缓冲溶液(ph 7.5)中，以备进一步使用。
35.5)样品表面增强拉曼光谱的采集：将500μl预先制备的适配体包覆的msns注入5ml离心管中。加入不同浓度的金黄色葡萄球菌(500μl)溶液，并在37℃下孵育8min。将混合物在室温以5000rpm离心5min，在780nm激光激发下，利用拉曼光谱仪对取得的上清液进行拉曼光谱采集，从而建立拉曼信号强度和对应金黄色葡萄球菌浓度间的标准曲线。
36.综上，本发明介绍了一种基于适配体门控介孔二氧化硅的金黄色葡萄球菌检测方法。该方法为：将信号分子负载于氨化介孔二氧化硅微球中，并通过适配体对其进行静电包覆，利用适配体和细菌的特异性结合后信号分子的释放，建立基于sers的金黄色葡萄球菌定量检测的标准曲线。本发明方法操作简单，检测速度快、精度较高、稳定性好等可以实现对金黄色葡萄球菌的定量检测。该方法适用于食品安全、材料化学等技术领域。
37.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
38.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。