一种生产硫酸软骨素裂解酶ABCI的食品级安全酵母菌及其应用的制作方法

一种生产硫酸软骨素裂解酶abci的食品级安全酵母菌及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种生产硫酸软骨素裂解酶abci的食品级安全酵母菌及其应用，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.硫酸软骨素(chondroitin sulfate，cs)是一种由d
‑
葡萄糖醛酸和n
‑
乙酰半乳糖胺交替连接而成的线性多糖，其分子量在7
‑
50kda之间，主要以蛋白聚糖的形式广泛分布在软骨组织中。cs有着重要的生物学功能。其骨架硫酸软骨素是软骨素经过硫酸转移酶的硫酸化修饰所形成的，根据硫酸化修饰位置的不同，硫酸软骨素可以被分为以下四种类型：csa(4
‑
o
‑
硫酸化)、csc(6
‑
o
‑
硫酸化)、csd(2,6
‑
di
‑
o
‑
硫酸化)和cse(4,6
‑
di
‑
o
‑
硫酸化)。由于cs有着优良的生物相容性，其应用范围非常广泛，例如医疗健康，保健品，食品及化妆品领域。不同分子量的硫酸软骨素其应用范围与功能效果也存在差异。近年来有实验证明分子量在3500
‑
5300da的硫酸软骨素，其药理活性最强，对防治风湿性炎症以及伤口愈合等具有更好的疗效。因此，制备低分子量的硫酸软骨素是非常有必要的。
3.目前，低分子量的硫酸软骨素制备方法主要有：(1)酸降解法，酸降解是指将硫酸软骨素溶解于酸溶液(如乙酸、盐酸)在一定的温度下进行降解，酸降解反应比较剧烈会导致硫酸根脱落，而且寡糖的自由基清除的能力也会降低；(2)过氧化氢降解法，该方法是采用过氧化氢的氧化作用降解硫酸软骨素，优点是产物无毒，不需要特殊的后处理，对双糖的结构破坏比较小；(3)酶解法，酶解法是指采用硫酸软骨素酶或透明质酸酶等可降解软骨素的酶对硫酸软骨素进行酶解获得寡糖。其中，酶解法因条件温和、专一性强，是一种非常有前景的制备低分子量硫酸软骨素的方法。
4.硫酸软骨素裂解酶(chondroitinase)是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和寡聚糖的裂解酶。根据底物谱的差异，将硫酸软骨素裂解酶主要分为三类：硫酸软骨素裂解酶ac(ec 4.2.2.5)、硫酸软骨素裂解酶b(ec 4.2.2.19)、硫酸软骨素裂解酶abc(ec 4.2.2.20)。其中，硫酸软骨素裂解酶ac能够降解csa及csc，但是不能降解硫酸皮肤素(ds)结构；硫酸软骨素裂解酶b能特异性降解ds结构，但不能降解csa、csc；硫酸软骨素裂解酶abc具有较宽的底物谱，能够降解csa、csc、ds等多种cs结构。根据切割方式的不同，硫酸软骨素裂解酶abc又分为内切模式的硫酸软骨素裂解酶abci及外切模式的硫酸软骨素裂解酶abcii，硫酸软骨素裂解酶abci能够随机断裂csa结构，终产物为二糖和四糖的混合物，四糖居多；硫酸软骨素裂解酶abcii从非还原端开始断裂csa结构，终产物为二糖。
5.但目前硫酸软骨素裂解酶多用大肠杆菌进行表达，而由此制备得到的硫酸软骨素的安全性无法得到保证，限制了其在诸多领域的应用。


技术实现要素：

6.为了解决上述问题，本发明提供了一种生产硫酸软骨素裂解酶abci的食品级安全酵母菌及其应用。本发明利用食品级安全菌株毕赤酵母实现了硫酸软骨素裂解酶abci的胞内表达及分泌表达，为制备食品级硫酸软骨素寡糖提供了可能。
7.本发明提供了一种重组毕赤酵母，所述毕赤酵母中表达了核苷酸序列如seq id no.1所示的编码硫酸软骨素裂解酶abci的基因。
8.在一种实施方式中，所述重组毕赤酵母以seq id no.2所示的序列为启动子，启动编码所述硫酸软骨素裂解酶abci的基因的表达。
9.在一种实施方式中，所述重组毕赤酵母菌以pichia pastorisgs115，或pichia pastoriskm71，或pichia pastorisx33，或pichia pastorissmd1168为出发菌株。
10.在一种实施方式中，所述重组毕赤酵母的表达载体包括但不限于pgapz系列和pgapzα系列质粒。
11.在一种实施方式中，利用pgapz系列质粒实现硫酸软骨素裂解酶abci的胞内表达，利用pgapzα系列质粒实现胞外表达。
12.本发明提供了一种生产硫酸软骨素裂解酶abci的方法，利用所述重组毕赤酵母为发酵菌株，发酵生产硫酸软骨素裂解酶abci。
13.在一种实施方式中，将所述重组酵母单菌落接种至ypd培养基，28～35℃、200～220rpm培养14～18h得到种子液，然后将种子液按培养基体积的5～10％添加至ypd培养基中，在28～35℃、200～220rpm下培养不少于24h；
14.或者，将所述重组毕赤酵母接种到含有ypd培养基中，28～35℃、200～220rpm培养18～24h，然后按5～10％转接至含有bsm培养基的发酵罐中发酵培养，在28～35℃，ph为4～6下发酵，控制溶氧大于30％，培养不少于72h。
15.在一种实施方式中，将菌株在发酵罐中培养至od
600
大于50时，按照5～25ml/h流加质量体积比为40～50％的甘油。
16.本发明提供了所述重组毕赤酵母在生产硫酸软骨素裂解酶abci中的应用。
17.本发明提供了所述重组毕赤酵母在制备包含硫酸软骨素二糖及其衍生物或硫酸软骨素四糖及其衍生物的产品中的应用。
18.[有益效果]
[0019]
本发明首次在食品级安全菌株毕赤酵母中异源表达硫酸软骨素裂解酶，具有较大的应用优势。首先，本发明过程中使用的宿主为食、品级，可满足医疗卫生和食品安全的要求，无内毒素和病原感染的风险；其次，本发明实现了硫酸软骨素的胞内表达及分泌表达两种方式，可用于不同的应用场景；本发明在毕赤酵母中首次实现了硫酸软骨素裂解酶abci的活性表达，通过发酵罐发酵，可使得重组毕赤酵母分泌表达酶活达到2840u/l。
附图说明
[0020]
图1为gs115/gapzαb
‑
abci菌株不同时间的酶活。
[0021]
图2为启动子突变菌株的相对荧光强度。
[0022]
图3为硫酸软骨素裂解酶在3
‑
l发酵罐中不同时间胞外酶活。
[0023]
图4为uplc
‑
ms鉴定硫酸软骨素裂解后的二糖和四糖的质谱图。
具体实施方式
[0024]
实施例中涉及的常用方法及序列：
[0025]
1、bsm培养基组分为(g/l)：甘油40，k2so
4 18，mgso4·
7h2o 14.9，koh 4.13，85％h3po
4 26.7ml/l，caso4·
2h2o 0.93，4.35ml/l ptm1微量元素(过滤除菌，灭菌后加入)。
[0026]
ptm1(g/l)：cuso4·
5h2o 6，ki 0.09，mnso4·
h2o 3，h3bo
3 0.02，mona2o4·
2h2o 0.2，cocl2·
6h2o 0.92，zncl
2 20，feso4·
7h2o 65，生物素0.2，h2so
4 5.0ml。
[0027]
2、ypd培养基组分为(g/l)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20。
[0028]
3、酶活测定方法：以硫酸软骨素a(csa)为底物，浓度为10mg/ml，用tris
‑
hcl缓冲液(ph 8.0)溶解底物。酶活测定的反应体系为1ml，加入40μl粗酶液和960μl硫酸软骨素底物溶液。在37℃反应1min，通过分光光度计测定在232nm处的吸光值变化。酶活单位定义为：每分钟转化1μmol底物所需要的酶量为1u。
[0029]
4、硫酸软骨素寡糖的液质检测方法：取500μl催化反应结束后的样品，加入5μl硫酸软骨素裂解酶abci，置于37℃孵育处理12h。将裂解后的溶液置于沸水中加热10min使蛋白失活变性，离心后取上清进行uplc
‑
ms检测。uplc
‑
ms检测使用acquity uplc beh amide色谱柱(1.7μm，2.1
×
100mm，waters,ma,usa)。洗脱液a为乙腈，洗脱液b为超纯水，使用氨水将ph值调节至10.4。所用的洗脱梯度设定如下：0
‑
2分钟，5％b；2
‑
3分钟，5
‑
30％b；3
‑
6分钟，30
‑
60％b；6
‑
8分钟，60％b。柱温保持在40℃，流速为0.2ml/min。在负离子模式下对m/z 300
‑
800的质量范围进行扫描监测。
[0030]
5、实施例中设计的引物具体如表1所示。
[0031]
表1引物序列表
[0032][0033]
实施例1：构建分泌表达重组毕赤酵母gs115/gapzαb
‑
abci
[0034]
根据来源于普通变形杆菌(proteus vulgaris)的硫酸软骨素裂解酶，将其编码基因abci经过酵母密码子偏好性进行优化，得到核苷酸如seq id no.1所示的密码子序列。用引物abci
‑
f/r扩增经过密码子优化后的abci序列，载体gapzαb用快切酶ecori/kpni酶切，
分别回收扩增的abci片段和酶切后的载体，通过一步克隆的方式得到重组质粒/gapzαb
‑
abci。将该质粒用快切酶avrii线性化后转入毕赤酵母gs115得到重组菌株gs115/gapzαb
‑
abci。
[0035]
重组菌株划线于平板，挑取单菌落接种于5ml ypd液体培养基中，30℃、220rpm培养16h，然后按10％(v/v)接种量转接至50ml ypd培养基中，置于30℃、220rpm进行培养，第24h、48h、72h和96h酶活依次为30u/l、70u/l、100u/l和120u/l。结果如图1所示。
[0036]
实施例2：p
gap
启动子突变提高abci的表达
[0037]
由于abci初步分泌表达量不高，因此进一步通过启动子工程提升蛋白的表达。为了便于筛选，需要将abci进行胞内表达，同时在abci基因后连接荧光蛋白egfp，通过荧光强弱指示蛋白表达量。
[0038]
用引物2abci
‑
f/r扩增经过密码子优化后的abci序列，egfp
‑
f/r扩增egfp基因片段，载体gapzb用快切酶ecori/kpni酶切，分别回收扩增的abci片段、egfp片段和酶切后的载体，通过多片段组装的方式得到重组质粒gapzb
‑
abci
‑
egfp。进一步，利用易错pcr，对重组质粒gapz
‑
abci上的启动子p
gap
进行随机突变，随机突变的重组质粒转入毕赤酵母中，通过博来霉素平板(200μg/ml)筛选，随机挑取长出的单菌落20个接种于5ml ypd液体培养基中，30℃、220rpm培养16h，然后按10％(v/v)接种量转接至50ml ypd培养基中，置于30℃、220rpm进行培养，培养96h后取样检测20株重组菌株的相对荧光强度，结果如图2所示，其中菌株s3荧光强度最高，表明其abci蛋白表达量最大。保留蛋白表达量最高的重组菌s3，并对其启动子区域进行测序，其序列如seq id no.2所示。检测第96h重组菌s3中abci酶活为520u/l，该酶活是启动子突变前最高酶活(120u/l)的4.3倍。
[0039]
实施例3：重组毕赤酵母s3'在3
‑
l罐中的发酵培养
[0040]
以上述所得突变启动子序列seq id no.2，替换分泌型表达载体gapzαb上的启动子得到质粒gapmzαb，采用实施例1同样的方式构建得到gapmzαb
‑
abci质粒，将该质粒用快切酶avrii线性化后转入毕赤酵母gs115得到分泌表达的重组菌株s3
′
。挑取重组毕赤酵母s3
′
菌株，接种于含有50ml ypd液体培养基中，30℃、220rpm培养20h，然后按10％(v/v)转接至3
‑
l发酵罐中发酵培养，发酵罐装液量为900ml，发酵培养基为bsm培养基，初始转速为200rpm，发酵温度为30℃，ph为5，设置溶氧和转速偶联，保持溶氧大于30％。当菌株od
600
大于50时，开始流加50％(w/v)甘油，前面第1
‑
5h，流加速度为5ml/h，5ml/h，10ml/h，15ml/h，20ml/h，然后后面按25ml/h速度恒速流加，总培养时长为120h。每隔12h取样一次，检测酶活，如图3所示：在发酵至72h、84h、96h、108h、120h时，酶活分别为2010u/l、2250u/l、2460u/l、2640u/l和2840u/l。
[0041]
实施例4：硫酸软骨素裂解酶应用于硫酸软骨素寡糖的制备
[0042]
用20mm tris
‑
hcl(ph8.0)配制硫酸软骨素底物10g/l，加入适量硫酸软骨素裂解酶混匀，置于37℃孵育12h，然后沸水浴失活10min，离心去除沉淀，过0.22μm膜后进行uplc
‑
ms检测，质谱结果如图4所示，采用此方法能够制备得到硫酸软骨素二糖(m/z458.05)和硫酸软骨素四糖(m/z917.1)。
[0043]
对比例
[0044]
将实施例1中的密码子序列替换为未按照毕赤酵母密码子偏好性优化的原始序列(如seq id no.3所示)，按照实施例1相同的方法，构建得到重组质粒gs115/gapzαb
‑
oriabci，并构建重组毕赤酵母，再按照实施例2中相同的方法进行摇瓶培养，生产abci酶，结果显示，发酵96h后，酶活几乎无法检测。
[0045]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。