AUR在制备治疗结肠癌药物中的应用的制作方法

aur在制备治疗结肠癌药物中的应用
1.本技术是申请日为2019年07月30日、申请号为201910695459.0、发明名称为《aur在制备治疗结肠癌药物中的应用》的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及aur在制备治疗结肠癌药物中的应用，属于药物新用途技术领域。


背景技术：

[0003]5‑
fu是经典抗肿瘤药物，自发现以来一直是实体瘤治疗方案中重要组成部分。由于该药物的广泛应用，导致结肠癌在临床上易于发生针对5
‑
fu的耐药现象。目前确定的调控结肠癌耐5
‑
fu的机制主要有o6
‑
甲基鸟嘌呤dna甲基转移酶(o6
‑
methylguanine dna
‑
transferase,mgmt)的甲基化，fak/akt/nf
‑
κb生存信号通路激活，但是针对这些调控方式尚无有效的治疗方案，需要更进一步了解结肠癌耐5
‑
fu的机制，并探索新的药物治疗方案。


技术实现要素：

[0004]
发明目的：为了解决上述技术问题，本发明提供了aur在制备治疗耐5
‑
fu结肠癌药物中的应用。
[0005]
技术方案：为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0006]
aur在制备治疗耐5
‑
fu结肠癌药物中的应用。
[0007]
aur(中文名金诺芬，cas no.:34031
‑
32
‑
8，化学结构如下所示)，其能够作用于txnrd将电子转移到txn，txn再将电子转移，清除ros。txn是一种主要的细胞蛋白二硫还原酶，作为过氧化物酶(peroxiredoxins)中二硫基团的电子供体，过氧化物酶(peroxiredoxins)还可以用于还原h2o2和过氧化物的抗氧化分子，以及调节核糖核苷酸还原酶和蛋氨酸亚砜还原酶。硫氧还蛋白系统对还原
‑
氧化(氧化还原)稳态至关重要，并保护dna免受氧化应激相关的dna损伤。
[0008][0009]
aur化学结构式
[0010]
本发明还提供了aur在制备提高5
‑
fu的敏感度的药物中的应用。
[0011]
优选的，所述aur作为唯一的活性成分。
[0012]
本发明还提供了一种治疗结肠癌的组合物，包括aur和5
‑
fu。
[0013]
本发明还提供了上述组合物在制备治疗结肠癌的药物中的应用。
[0014]
优选的，所述药物包括耐5
‑
fu结肠癌药物。
[0015]
优选的，所述药物是由aur作为唯一活性成分，以及药学上可接受的辅料所组成。
[0016]
优选的，所述药物是由aur和5
‑
fu作为活性成分，以及药学上可接受的辅料所组成。
[0017]
优选的，所述辅料包括稀释剂、黏合剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、矫味剂、包合材料和吸附材料中的一种或多种。
[0018]
优选的，所述药物的剂型包括颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液、汤剂或滴丸剂。
[0019]
本发明所述aur在治疗结肠癌时，可以单独使用，也可以与其他药物配合同时使用，或者与其他药物一起制成复方制剂使用，都可以达到治疗结肠癌的目的。
[0020]
本发明所述药学上可接受的辅料，是指制备不同剂型时加入所需的各种常规辅料，例如稀释剂、黏合剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、矫味剂、包合材料、吸附材料等以常规的制剂方法制备成任何一种常用的口服制剂，例如可以是颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液、汤剂、滴丸剂等。
[0021]
本发明在临床前研究中，发现aur可以有效治疗结肠癌，尤其对于耐5
‑
fu结肠癌具有一定的治疗效果，并且通过联合5
‑
fu对耐5
‑
fu结肠癌细胞和动物荷瘤产生生长抑制及杀伤作用从而起到抑制耐药肿瘤的作用，具有更好的效果。提供了使用aur治疗发生化疗药物5
‑
fu耐药的结肠癌的新方法。具体表现为：
[0022]
1)aur可以在耐5
‑
fu结肠癌细胞系中增加5
‑
fu的敏感度，进而增加5
‑
fu对抵抗化疗结肠癌细胞的抑制作用。
[0023]
2)aur联合5
‑
fu可以在耐5
‑
fu结肠癌裸鼠异位移植模型中有效抑制耐药结肠癌的生长，达到治疗化学治疗抵抗肿瘤的作用。
[0024]
技术效果：相对于现有技术，本发明提供了aur治疗结肠癌的新用途，尤其对于耐5
‑
fu结肠癌具有一定的治疗效果，并且更为显著的是aur能够通过上调5
‑
fu的敏感性，提高5
‑
fu对耐5
‑
fu结肠癌的杀伤作用。
附图说明
[0025]
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0026]
图1为不同浓度aur联合5
‑
fu对结肠癌耐5
‑
fu细胞hct
‑
8的增殖抑制作用。
[0027]
图2为不同浓度aur联合5
‑
fu对结肠癌耐5
‑
fu细胞sw620的增殖抑制作用。
[0028]
图3为aur联合5
‑
fu对结肠癌耐5
‑
fu细胞sw620裸鼠移植瘤瘤体积的变化。
[0029]
图4为aur联合5
‑
fu对结肠癌耐5
‑
fu细胞sw620裸鼠移植瘤瘤重的变化。
[0030]
图5为aur联合5
‑
fu对结肠癌耐5
‑
fu细胞sw620裸鼠移植瘤体重的变化。
具体实施方式
[0031]
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的aur在制备治疗结肠癌药物中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0032]
实施例1
[0033]
aur联合5
‑
fu对人结肠癌耐5
‑
fu细胞hct
‑
8和sw620的增殖抑制实验。
[0034]
1、实验材料
[0035]
(1)药物
[0036]
aur，购自常州新区吉利化工，白色粉末。使用二甲基亚砜(dmso)配成母液，置于
‑
20℃保存。临用前用dmem培养液配置成所需浓度。
[0037]5‑
fu，购自selleck生物有限公司，白色粉末。使用二甲基亚砜(dmso)配成母液，置于
‑
20℃保存。临用前用dmem培养液配置成所需浓度。
[0038]
(2)细胞株
[0039]
由发明人使用来自中国科学院上海生命科学研究所生物化学与细胞生物学研究所细胞库提供的hct
‑
8、sw620构建耐5
‑
fu细胞系hct
‑
8/5
‑
fu、sw620/5
‑
fu，使用含10％的胎牛血清的dmem培养液培养。
[0040]
(3)试剂
[0041]
①
培养液：dmem培养基，美国gibco公司产品。取dmem粉末一袋溶于1000ml灭菌三蒸水中，用nahco3调ph值至7.3～7.4，圆筒式过滤器过滤除菌，4℃冰箱保存。使用前加入10％胎牛血清、100u/ml青霉素和100mg/l链霉素。
[0042]
②
胎牛血清：杭州四季青生物工程公司产品。经56℃水浴灭活30min，分装并保存于
‑
20℃低温冰箱中。
[0043]
③
pbs缓冲液：称取nacl 8.0g、kcl 0.20g、na2hpo4·
h2o 1.56g、kh2po
4 2.0g，溶于1000ml三蒸水中,高压灭菌，4℃冰箱保存。
[0044]
④
0.25％胰酶：称取胰酶0.25g，溶于100mlpbs缓冲液中，过滤除菌。
[0045]
⑤
dmso溶液：美国sigma
‑
aldrich(st.louis,mo)公司产品。
[0046]
⑥
mtt溶液：称取mtt粉末(bioshrp)50mg，配置在10ml的pbs中，0.22um的滤膜过滤除菌。
[0047]
2、实验仪器：
[0048]
(1)yj
‑
875型医用净化工作台：苏州净化设备厂生产。
[0049]
(2)3111型水套式co2培养箱：美国thermo electron公司产品。
[0050]
(3)olympusix51型倒置荧光显微镜：日本olympus公司产品。
[0051]
(4)电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。
[0052]
(5)zw
‑
a型微量振荡器：金坛市精达仪器制造厂。
[0053]
(6)elx800型酶联免疫检测仪，购于美国biotek公司。
[0054]
3、药效实验
[0055]
采用四甲基偶氮唑盐(mtt)实验考察aur联合5
‑
fu对不同耐5
‑
fu结肠癌细胞的抑制作用和ic
50
值。
[0056]
将处于对数生长期的hct
‑
8/5
‑
fu、sw620/5
‑
fu细胞用0.25％胰酶消化、离心、重悬和计数，制成细胞悬液，以5
×
104/ml细胞浓度加入96孔酶标板内，每孔100μl，设3复孔，置37℃，5％co2培养箱培养12h左右待细胞完全贴壁。接着按如下方法加药：第一组加5
‑
fu和低浓度aur，每孔中的5
‑
fu终浓度0.1μm，1μm，10μm，50μm，100μm，200μm，aur终浓度为0.1μm；第二组加5
‑
fu和中浓度aur，每孔中的5
‑
fu终浓度0.1μm，1μm，10μm，50μm，100μm，200μm，aur
终浓度为0.2μm；第三组加5
‑
fu和高浓度aur，每孔中的5
‑
fu终浓度0.1μm，1μm，10μm，50μm，100μm，200μm，aur终浓度为0.4μm。每孔加药后孵育24h，加入5mg/ml mtt溶液20μl，37℃下避光孵育4h，弃去全部上清，每孔加入100μl的dmso后微型振荡器上振荡2～3min，待结晶完全溶解后用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定吸光度值a。a值越大，代表活细胞数越多。实验重复3次，根据a值计算药物对细胞的生长抑制率。
[0057]
生长抑制率＝1
‑
a
加药组
/a
对照组
[0058]
根据孙氏综合法(改进寇氏法)来计算半数抑制浓度ic
50
(即抑制50％细胞生长所需药物浓度)。
[0059]
本实验结果见图1～2，可见当单独使用5
‑
fu的时候，耐药细胞没有明显的抑制作用，但是当使用5
‑
fu和aur联合给药后，和单纯给予5
‑
fu相比，联合给药能够显著的抑制耐药细胞的增殖(p＜0.05)，说明aur通过增加耐药细胞对5
‑
fu的敏感性达到杀伤耐药细胞的功效。
[0060]
实施例2
[0061]
考察5
‑
fu联合aur对结肠癌耐5
‑
fu裸鼠移植瘤的治疗作用。
[0062]
1、实验材料
[0063]
(1)药物
[0064]
aur，购自常州新区吉利化工，白色粉末。使用二甲基亚砜(dmso)配成母液，置于
‑
20℃保存。临用前用dmem培养液配置成所需浓度。
[0065]5‑
fu，购自selleck生物有限公司，白色粉末。使用二甲基亚砜(dmso)配成母液，置于
‑
20℃保存。临用前用dmem培养液配置成所需浓度。
[0066]
(2)细胞株
[0067]
由发明人使用来自中国科学院上海生命科学研究所生物化学与细胞生物学研究所细胞库提供的sw620构建耐5
‑
fu细胞系sw620/5
‑
fu，使用含10％的胎牛血清的dmem培养液培养。
[0068]
(3)试剂
[0069]
①
培养液：dmem培养基，美国gibco公司产品。取dmem粉末一袋溶于1000ml灭菌三蒸水中，用nahco3调ph值至7.3～7.4，圆筒式过滤器过滤除菌，4℃冰箱保存。使用前加入10％胎牛血清、100u/ml青霉素和100mg/l链霉素。
[0070]
②
胎牛血清：杭州四季青生物工程公司产品。经56℃水浴灭活30min，分装并保存于
‑
20℃低温冰箱中。
[0071]
③
pbs缓冲液：称取nacl 8.0g、kcl 0.20g、na2hpo4·
h2o 1.56g、kh2po
4 2.0g，溶于1000ml三蒸水中，高压灭菌，4℃冰箱保存。
[0072]
④
0.25％胰酶：称取胰酶0.25g，溶于100mlpbs缓冲液中，过滤除菌。
[0073]
(4)实验动物
[0074]
来源、品系：balb/c
‑
nu裸小鼠，由扬州大学比较医学中心提供(许可证号：scxk(苏)2010
‑
0001)。周龄：6周，体重：16
‑
20g，性别：雄性。
[0075]
2、实验方法：
[0076]
(1)实验动物分组
[0077]
阴性对照组(空白对照组)：6只；
[0078]5‑
fu组(5
‑
fu，50mg/kg，i.p.，四日一次5
‑
fu)6只；
[0079]
aur组(aur，6mg/kg，i.g.，每日aur)6只；
[0080]5‑
fu联合aur组(5
‑
fu，50mg/kg，i.p.四日一次5
‑
fu；aur，6mg/kg，i.g.，每日aur)6只；
[0081]
(2)造模方法
[0082]
取对数生长期的结肠癌耐药细胞株sw620，在无菌条件下后制备成1
×
107/ml细胞悬液，以0.2ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100mm3后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2
‑
3天测1次。给药体积为0.2ml/20g。24天后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
[0083]
肿瘤体积(tumorvolume，tv)的计算公式为：tv＝1/2
×
a
×
b2，其中a、b分别表示长宽。
[0084]
结果：
[0085]5‑
fu联合aur对人结肠癌耐药细胞sw620裸小鼠移植瘤的实验性治疗结果见图3～5。实验结果如下，如图3在连续给药24天后，与空白组、5
‑
fu组、aur组相比较，5
‑
fu联合aur组肿瘤体积在4天时与其他各组出现差异，体积较其他各组明显较小，其后每个时间点的肿瘤体积，5
‑
fu联合aur组明显小于其他各组，且有统计学差异。同时，相对于空白组，单独应用aur，肿瘤体积也出现一定程度的减小。如图4所示，联合给药组的肿瘤重量较其他各组明显较小，且有统计学差异，同时，aur组肿瘤重量也有一定程度的减小。如图5所示，动物体重各组之间没有明显差异。
[0086]
4、结论：5
‑
fu联合aur对人结肠癌耐5
‑
fu细胞sw620裸小鼠异种抑制肿瘤具有明显的生长抑制作用。
[0087]
由上述实施例可知，本发明提供aur对耐5
‑
fu结肠癌具有一定的治疗效果，并且更为显著的是aur能够通过上调5
‑
fu的敏感性，提高5
‑
fu对耐5
‑
fu结肠癌的杀伤作用。本发明提供了使用aur治疗发生化疗药物5
‑
fu耐药的结肠癌的新方法
[0088]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。