一种药物混合物在制备治疗或预防冠状病毒引起的疾病中的用途的制作方法

1.本发明涉及炎性疾病防治领域，尤其涉及一种药物混合物在制备治疗或预防冠状病毒引起的疾病中的用途。


背景技术：

2.据世界卫生组织统计，下呼吸道感染是全球第四大死亡原因，对人类健康造成巨大威胁，而美国疾病预防控制中心的一项流行病学研究表明以病毒为病原体的肺炎病例占总肺炎病例的22％。其中流感病毒、冠状病毒、鼻病毒是引起病毒性肺炎的最主要的病原体。新冠病毒、甲型h1n1流感病毒、非典病毒等多种病毒曾在世界范围内引起多次大规模的肺炎疫情爆发。病毒性肺炎的严重程度和病毒的高速复制以及诱发机体的过度炎症反应密切相关，给重症患者造成急性呼吸窘迫综合征(ards)及多器官衰竭，具有较高的死亡率，造成极大的社会恐慌和经济负担。
3.南京农业大学专业硕士论文《黑果枸杞多糖的提取纯化，抗氧化活性及体外模拟消化和发酵研究》中记载到：黑果枸杞粗多糖在唾液中不被消化，分子量无明显变化，无还原糖和游离单糖生成。在胃部发生较低程度降解，分子量无显著性变化，无游离单糖生成，但6h时产物还原糖含量与0h相比有明显增加；在小肠中不被消化，分子量与还原糖无显著性差异，也没有游离单糖生成。所以黑果枸杞多糖不被唾液和胃肠液消化，在胃液中6h才会有较低程度的降解。
4.目前针对呼吸道病毒感染的治疗药物包括直接抗病毒类药物及免疫调节类药物，但由于新型病毒及病毒突变株的出现及部分病毒的高传播性、耐药性的产生，使得药物临床效果下降，迫切需要寻找新的可防治呼吸道病毒感染的药物，与病毒感染后病毒直接造成的肺组织及机体损伤相比，病毒诱发的过度炎症反应对组织损伤也不可忽视，本领域技术人员致力于开发一种药物混合物，使其能在制备治疗或预防冠状病毒引起的疾病中起到作用，同时填补枸杞糖肽在治疗或预防冠状病毒引起的疾病领域研究中的空白。


技术实现要素：

5.有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是开发一种药物混合物，使其能在制备治疗或预防冠状病毒引起的疾病中起到作用，同时填补枸杞糖肽在治疗或预防冠状病毒引起的疾病领域研究中的空白。
6.为实现上述目的，本发明提供了一种药物混合物在制备治疗或预防冠状病毒引起的疾病中的用途，其中所述药物混合物包括有效量的枸杞糖肽。
7.与现有技术相比，本发明优势在于：
8.(1)本发明所采用的枸杞糖肽为天然来源植物多糖，具有低毒、无副作用、来源广泛、价格低廉等多种开发优势；
9.(2)本发明证实了枸杞糖肽在体外对raw264.7巨噬细胞增殖及吞噬能力有显著的
促进作用，并显著降低lps刺激的raw264.7巨噬细胞过度分泌的促炎细胞因子水平，同时增加抗炎细胞因子水平。表明枸杞糖肽能够在体外非炎症条件下增强巨噬细胞的免疫功能，在炎症条件下抑制巨噬细胞的过度免疫，证实枸杞糖肽具有显著的体外免疫调节功能。
10.以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
11.图1为枸杞糖肽对raw264.7巨噬细胞增殖能力影响折线图；
12.图2为枸杞糖肽对raw264.7巨噬细胞吞噬荧光微球后细胞内荧光强度影响折线图；
13.图3为枸杞糖肽对raw264.7巨噬细胞吞噬荧光微球的吞噬指数影响折线图；
14.图4为枸杞糖肽对lps刺激raw264.7巨噬细胞相关细胞因子il
‑
1β分泌影响示意图，其中，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001与模型组相比；
15.图5为枸杞糖肽对lps刺激raw264.7巨噬细胞相关细胞因子il
‑
6分泌影响示意图，其中，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001与模型组相比；
16.图6为枸杞糖肽对lps刺激raw264.7巨噬细胞相关细胞因子il
‑
17分泌影响示意图，其中，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001与模型组相比；
17.图7为枸杞糖肽对lps刺激raw264.7巨噬细胞相关细胞因子il
‑
23分泌影响示意图，其中，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001与模型组相比；
18.图8为枸杞糖肽对lps刺激raw264.7巨噬细胞相关细胞因子mcp
‑
1分泌影响示意图，其中，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001与模型组相比；
19.图9为枸杞糖肽对lps刺激raw264.7巨噬细胞相关细胞因子tnf
‑
α分泌影响示意图，其中，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001与模型组相比；
20.图10为枸杞糖肽对lps刺激raw264.7巨噬细胞相关细胞因子il
‑
4分泌影响示意图，其中，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001与模型组相比；
21.图11为枸杞糖肽对lps刺激raw264.7巨噬细胞相关细胞因子il
‑
10分泌影响示意图，其中，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001与模型组相比；
22.图12为枸杞糖肽对甲型流感病毒a/pr/8/h1n1感染小鼠体重影响柱状图；
23.图13为枸杞糖肽对甲型流感病毒a/pr/8/h1n1感染小鼠肺指数影响柱状图；
24.图14为枸杞糖肽对甲型流感病毒a/pr/8/h1n1感染小鼠肺组织病理改变的影响；
25.图15为枸杞糖肽对sars
‑
cov
‑
2(wt)感染vero细胞的感染抑制率柱状图。
具体实施方式
26.以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
27.本发明提供了一种药物混合物在制备治疗或预防冠状病毒引起的疾病中的用途，其中所述药物混合物包括有效量的枸杞糖肽。
28.在一个较佳的实施例中，其中所述有效量为大于40ug/ml。
29.在一个较佳的实施例中，其中所述有效量为大于200ug/ml。
30.在一个较佳的实施例中，其中所述有效量为大于1mg/ml。
31.在一个较佳的实施例中，其中所述的冠状病毒引起的疾病是covid
‑
19、sars、或者mers
‑
cov。
32.在一个较佳的实施例中，其中所述药物混合物能够增强巨噬细胞增殖能力和/或吞噬能力。
33.在一个较佳的实施例中，其中所述药物混合物能够降低促炎细胞因子分泌水平和提升抗炎细胞因子分泌水平。
34.在一个较佳的实施例中，其中，所述促炎细胞因子包括il
‑
1β、il
‑
6、tnf
‑
α、mcp
‑
1、il
‑
17a、il
‑
23。
35.在一个较佳的实施例中，其中，所述抗炎细胞因子包括il
‑
4、il
‑
10。
36.在一个较佳的实施例中，其中所述药物混合物包括口服液、片剂、合剂、胶囊剂、注射液。
37.一方面，本发明所采用的枸杞糖肽为天然来源植物多糖，具有低毒、无副作用、来源广泛、价格低廉等多种开发优势；
38.另一方面，本发明证实了枸杞糖肽在体外对raw264.7巨噬细胞增殖及吞噬能力有显著的促进作用，并显著降低lps刺激的raw264.7巨噬细胞过度分泌的促炎细胞因子水平，同时增加抗炎细胞因子水平。表明枸杞糖肽能够在体外非炎症条件下增强巨噬细胞的免疫功能，在炎症条件下抑制巨噬细胞的过度免疫，证实枸杞糖肽具有显著的体外免疫调节功能。
39.以下通过具体的实施例来说明本发明的具体实施方式。
40.实施例1:枸杞糖肽对raw264.7巨噬细胞增殖能力的影响
41.raw264.7巨噬细胞采用含有10％胎牛血清及1％ps的dmem培养基进行常规培养。
42.取处于对数生长期、细胞形态呈不规则圆形的raw264.7巨噬细胞，调整细胞数为1x106个/ml。每孔100ul细胞悬液接种于96孔细胞培养板上，于37℃，5％co2的培养箱中培养24h。
43.枸杞糖肽用完全培养基配置为6.25mg/ml初始溶液，并连续4次按照2倍倍比进行梯度稀释，共5个稀释度。
44.弃去培养24h后的细胞上清液，用pbs洗涤一次，然后向空白对照组及细胞对照组中添加100ul培养基，向实验组中添加已稀释好的各浓度枸杞糖肽100ul，每个浓度设4个平行孔。于37℃，5％co2培养箱分别培养12h、24h、36h。孵育时间结束后，用pbs洗涤一次，每孔加入10ulcck
‑
8，37℃反应2h，用酶标仪测定450nm处吸光度。
45.通过细胞活力公式计算不同浓度枸杞糖肽孵育不同时间后细胞活力，从而确定枸杞糖肽对raw264.7巨噬细胞增殖能力的影响。
46.公式：细胞活力＝{[(od
实验组
)
‑
(od
空白组
)]/[(od细胞组)
‑
(od空白组)]}x100％枸杞糖肽对raw264.7巨噬细胞增殖能力的影响见图2。枸杞糖肽与raw264.7巨噬细胞孵育12h、24h、36h后细胞活力较对照组均增加，孵育时长为24h的实验组，细胞活力增加最为明显。随着枸杞糖肽浓度增加，细胞活力呈上升趋势。浓度为3.12mg/ml枸杞糖肽与raw264.7巨噬细胞孵育24h时，细胞活力达到296.19％。与对照组细胞活力存在显著性差异。
[0047]
综上所述，枸杞糖肽在一定浓度范围内能够有效促进raw264.7巨噬细胞增殖，即在体外非炎症条件下对raw264.7巨噬细胞具有免疫促进作用。
[0048]
实施例2枸杞糖肽对raw264.7巨噬细胞吞噬能力的影响
[0049]
取处于对数生长期、细胞形态呈不规则圆形的raw264.7巨噬细胞，调整细胞数为2x105个/ml。每孔100ul细胞悬液接种于96孔细胞培养板上，于37℃，5％co2的培养箱中培养24h。
[0050]
枸杞糖肽用完全培养基配置为6.25mg/ml初始溶液，并连续3次按照2倍倍比进行梯度稀释，共4个稀释度。
[0051]
弃去培养24h后的细胞上清液，用pbs洗涤一次，然后向细胞对照组中添加100ul培养基，向实验组中添加已稀释好的各浓度枸杞糖肽100ul，每个浓度设4个平行孔。于37℃，5％co2培养箱培养8h。
[0052]
取直径为1.0umyg羧酸盐荧光微球，按照1:100体积比将荧光微球和1％bsa混匀，于37℃下避光孵育1h，超声处理10min。临用前孵育。将与1％bsa孵育后的荧光微球添加到含有10％fbs和1％p/s的dmem培养基中。按照细胞与巨噬细胞个数比为1:5的比例，将荧光微球悬浮液添加到96孔细胞培养板中，于37℃，5％co2培养箱培养4h。
[0053]
4h后，用含有1％多聚甲醛的pbs冲洗细胞。通过多功能荧光酶标仪测定441nm处吸光度，确定巨噬细胞内荧光强度；在荧光显微镜下观察计数每孔内100个细胞吞噬荧光微球的个数，通过吞噬指数公式计算raw264.7巨噬细胞吞噬指数。
[0054]
公式:吞噬指数(％)＝(至少吞噬一个荧光微球的巨噬细胞个数/计数细胞个数)x100％枸杞糖肽孵育raw264.7巨噬细胞后细胞内荧光强度变化如图3所示，枸杞糖肽孵育后raw264.7巨噬细胞内荧光强度读数显著大于细胞对照组细胞内荧光强度，呈现出剂量依赖性，即随着枸杞糖肽浓度的增加，巨噬细胞内荧光强度越强。
[0055]
通过荧光显微镜观察可见细胞内存在绿色荧光点，即为巨噬细胞吞噬荧光微球。计数每个孔内100个细胞中吞噬荧光微球的细胞个数后，得出各组的吞噬指数。枸杞糖肽孵育raw264.7巨噬细胞后细胞吞噬指数变化如图4所示。结果显示与对照组相比枸杞糖肽能增加吞噬荧光微球的细胞个数。实验组吞噬指数较对照组显著提升,并呈现剂量依赖性。
[0056]
综上所述，枸杞糖肽可显著提升raw264.7巨噬细胞吞噬能力。即在体外非炎症条件下枸杞糖肽对raw264.7具有良好的免疫促进作用。
[0057]
实施例3枸杞糖肽对脂多糖lps刺激的raw264.7巨噬细胞相关细胞因子分泌影响
[0058]
取处于对数生长期、细胞形态呈不规则圆形的raw264.7巨噬细胞，调整细胞数为1x105个/ml。每孔100ul细胞悬液接种于96孔细胞培养板上，于37℃，5％co2的培养箱中培养24h。
[0059]
枸杞糖肽用完全培养基配置为6.25mg/ml初始溶液，并连续2次按照2倍倍比进行梯度稀释，共3个稀释度。
[0060]
弃去培养24h后的细胞上清液，用pbs洗涤一次，然后向细胞对照组中添加100ul培养基，向lps模型组中添加1ug/ml lps构建体外细胞炎症模型，向实验组中添加已稀释好的各浓度枸杞糖肽及1ug/ml lps100ul，每个浓度设3个平行孔。于37℃，5％co2培养箱培养24h。
[0061]
收集细胞上清液，根据试剂商说明使用酶联免疫吸附试剂盒测定各组细胞上清液
中il
‑
1β、il
‑
6、il
‑
4、tnf
‑
α、mcp
‑
1、il
‑
17a、il
‑
23、il
‑
10的水平。
[0062]
枸杞糖肽对lps刺激的raw264.7巨噬细胞相关细胞因子分泌影响如图4所示，lps模型组中促炎细胞因子il
‑
1β、il
‑
6、tnf
‑
α、mcp
‑
1、il
‑
17a、il
‑
23分泌水平较对照组明显升高，抗炎细胞因子il
‑
4、il
‑
10分泌水平较对照组明显降低。意味着体外细胞炎症模型构建成功。实验组中促炎细胞因子il
‑
1β、il
‑
6、tnf
‑
α、mcp
‑
1、il
‑
17a、il
‑
23分泌水平较模型组下降，抗炎细胞因子il
‑
4、il
‑
10分泌水平较模型组显著提升。意味着枸杞多糖对lps诱导的细胞分泌过量促炎细胞因子有显著抑制作用并对lps诱导的细胞分泌抗炎细胞因子水平下降有显著升高作用。
[0063]
综上所述，枸杞糖肽在体外炎症条件下，能够降低促炎细胞因子分泌水平，提升抗炎细胞因子分泌水平，具有良好的体外抗炎特性。
[0064]
实施例4枸杞糖肽对甲型流感病毒a/pr/8/h1n1感染小鼠致肺炎模型体重的影响通过如下方法建立甲型流感病毒a/pr/8/h1n1的小鼠肺炎模型：
[0065]
(1)取体重质量13～15g的icr小鼠，按体重随机分为正常组、模型组、枸杞糖肽灌胃给药组共3组，枸杞糖肽给药剂量为50mg/kg，每组8只，雌雄各半。
[0066]
(2)模型组和给药组用乙醚轻度麻醉后，以15倍半数致死量(ld50)甲型流感病毒a/pr/8/h1n1滴鼻感染。
[0067]
(3)感染当天枸杞糖肽灌胃给药，正常组和模型组灌胃相同体积蒸馏水。每日一次，连续4天。
[0068]
在造模感染第5天，称重小鼠。以确定枸杞糖肽对甲型流感病毒a/pr/8/h1n1感染小鼠体重的影响。
[0069]
体重减轻是小鼠感染甲型h1n1病毒后出现的主要临床症状，枸杞糖肽对h1n1感染小鼠体重的影响见图12，结果表明，在感染第5天模型组小鼠较正常组小鼠体重明显下降。与模型组相比，50mg/kg枸杞糖肽给药组能有效抑制体重减轻的症状。
[0070]
综上所述，枸杞糖肽对h1n1病毒感染小鼠具有显著的保护作用。
[0071]
实施例5枸杞糖肽对甲型流感病毒a/pr/8/h1n1感染小鼠致肺炎模型肺指数的影响
[0072]
小鼠感染第5天称重后，脱颈处死，解剖取肺组织并称重。通过肺指数公式计算小鼠肺指数。
[0073]
公式：肺指数＝肺湿重(g)/体重(g)x100％
[0074]
枸杞糖肽对甲型流感病毒a/pr/8/h1n1感染小鼠肺炎模型肺指数的影响见图13，实验结果显示甲型流感病毒h1n1感染小鼠后，小鼠肺指数较正常组明显升高。肺指数升高意味着小鼠肺水肿、肺组织损伤加重。枸杞糖肽灌胃给药对于甲型流感病毒h1n1感染所致小鼠肺指数升高具有显著的抑制作用，与模型组相比有统计学差异。
[0075]
实施例6枸杞糖肽对甲型流感病毒a/pr/8/h1n1感染小鼠致肺炎模型肺组织病理损伤影响
[0076]
小鼠肺组织称重后，解剖并取左肺中叶，用10％福尔马林溶液固定，固定72h后取出流水冲洗，在不同浓度乙醇中进行梯度脱水，经二甲苯透化后，石蜡包埋。切片使之厚度约4um，苏木精及伊红染色，封片。封片后在光学显微镜下观察各组小鼠肺组织病理改变。
[0077]
枸杞糖肽对甲型流感病毒h1n1感染小鼠肺部病理变化影响如图14所示，图中可以
看到，正常组小鼠肺组织肺泡大小完整，肺泡壁较薄，肺间质及血管壁周围组织炎症细胞浸润较少，无透明膜及充血现象；经甲型流感病毒h1n1感染后，小鼠肺组织肺泡结构破坏，可见弥漫性肺泡壁增厚，肺间质中大量炎性细胞浸润，具有明显的透明膜出现，出现明显肺部病变。
[0078]
与模型组相比50mg/kg枸杞糖肽给药组小鼠肺部炎症有减轻趋势，肺泡间隔较正常组略有增厚，肺泡大小及结构基本完整，肺间质中有少量炎性细胞浸润，肺部病变症状明显改善。
[0079]
实施例7枸杞糖肽体外抗sars
‑
cov
‑
2(wt)的抗病毒活性
[0080]
取处于对数生长期、细胞形态为菱形的vero细胞，调整细胞数为1x105个/ml。每孔100ul细胞悬液接种于96孔细胞培养板上，于37℃，5％co2的培养箱中培养24h。
[0081]
用dmem完全培养基配置6500tcid50/ml的病毒稀释液，现用现配。
[0082]
实验设置细胞对照组、病毒控制组及枸杞糖肽治疗组。
[0083]
枸杞糖肽初始浓度按照1mg/ml用含有6500tcid50/ml的病毒稀释液配置，连续5次按照3倍倍比进行梯度稀释，共6个稀释度。每个浓度设3个平行孔。将病毒与枸杞糖肽混合溶液于37℃下孵育60min。
[0084]
弃去培养24h后的细胞上清液，用pbs洗涤一次，然后向细胞对照组中添加100ul培养基，向病毒控制组中添加6500tcid50/ml病毒稀释液100ul，向枸杞糖肽治疗组中添加100ul孵育后的枸杞糖肽及病毒混合溶液，在37℃孵育24h。
[0085]
每孔添加100ul luciferase assay system荧光素酶发光检测试剂，混匀后，将将混合液转移到96孔化学发光检测板上，通过化学发光检测仪进行检测，读取相对光单位。根据感染抑制率公式计算枸杞糖肽对sars
‑
cov
‑
2(wt)感染抑制率，其中，抑制率公式如下：
[0086]
抑制率＝[枸杞糖肽治疗组(rlu)
‑
细胞对照组(rlu)]/[病毒控制组(rlu)
‑
细胞对照组(rlu)]
[0087]
枸杞糖肽对sars
‑
cov
‑
2(wt)感染vero细胞的感染抑制率见图15，结果显示，与细胞对照组相比，枸杞糖肽显著抑制sars
‑
cov
‑
2(wt)病毒感染，抑制率呈现剂量依赖性，1mg/ml枸杞糖肽抑制率高达81.32％，这意味着枸杞糖肽在体外可显著抑制sars
‑
cov
‑
2(wt)感染，具有显著的体外抗病毒活性。
[0088]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。