一种辅因子与辅因子依赖性酶的共固定化连续催化的方法与流程

1.本发明属于酶催化领域，具体涉及一种辅因子与辅因子依赖性酶的共固定化连续催化的方法。


背景技术：

2.在工业生物催化过程中，生物催化剂
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酶在生物工业催化过程中占有重要地位，其催化具有高度选择性，可以形成复杂的化学结构产物，在生产和回收利用等方面都具有化学催化剂不可比拟的作用。目前，被开发应用的酶越来越多，功能也具有多样性，然而，在现有发现的酶中，50%的酶是辅因子依赖性酶。辅因子（cofactor）是指与酶（酵素）结合且在催化反应中必要的非蛋白质化合物。辅因子依赖性酶在工业催化过程中，需要额外添加辅因子才能进行催化或者促进催化反应进行，而辅因子一般是比较价格昂贵的，额外添加提高生产成本。固定化酶技术已经较为成熟，但是对于辅因子这样的小分子还是有具有一定难度。回收辅因子回收利成为研究工作者的研究热点。
3.具有磷酸基团的辅因子，例如5
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磷酸吡哆醛（plp），氧化性辅酶nad

，核苷酸fad

，atp等，再有机体内都是重要的辅因子，参与有机体的生命活动。带有磷酸基团的辅因子使其具有负电荷，这些辅因子可逆的结合在具有正电荷材料的表面，辅因子能够有效的保留在固定化催化体系中，并能够结合到酶的活性中心执行催化功能。基于其性质，susana velasco
‑
lozano等使用聚乙烯亚胺修饰琼脂糖凝胶小球载体材料制备固定化微球，使用制备好的共固定化辅因子nad

和甲酸脱氢酶 、辅因子plp和w
‑
转胺酶，并实现在不额外添加plp的情况下，能够连续催化。ana i. ben
í
tez
‑
mateos等同样采用聚乙烯亚胺修饰的树脂微球共固定化w
‑
转胺酶实现plp的自给自足的利用。这些固定化材料都需要有机试剂聚乙烯亚胺来对材料进行修饰，与目前提倡的绿色可持续发展不符，因此开发易得、绿色可持续的固定化材料来实现辅因子和酶固定化具有重要意义。
4.l
‑
赖氨酸脱羧酶（l
‑
lysine decarboxylase）是一种辅因子plp依赖性酶，其能够在催化l
‑
赖氨酸脱去羧基产一分子戊二胺和一分子co2，在目前的工业生产中，还需要额外添加plp来实现高效催化反应，但是，这过程中大大增加了生产成本，目前，专利cn201910256808.9 已经实现l
‑
赖氨酸脱羧酶的重复利用，但是并没有对辅因子plp进行一个固定化利用，在连续反应中还需要额外补充plp来实现催化。


技术实现要素：

5.针对现有的技术不足，本发明提供了一种辅因子与辅因子依赖性酶的共固定化连续催化的方法，一种材料易得、可再生的几丁质通过脱乙酰预处理，作为固定化材料对辅因子和其对应的依赖性酶进行共固定化研究，在连续催化合成戊二胺过程应用中，能够有效的防止plp的流失，提高辅因子和其对应的依赖性酶的催化效率，实现辅因子的循环利用。
6.为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：一种辅因子与辅因子依赖性酶的共固定化连续催化的方法，包括以下步骤：
步骤1，固定化材料制备取几丁质材料0.5
‑
10 g的加入100ml的蓝口瓶中，加入脱乙酰试剂，置于0
‑
100℃的水浴锅中，搅拌0.1
‑
72h后取出，获得不同脱乙酰几丁质；抽滤或者离心去掉脱乙酰试剂，用清水洗至中性ph；烘干备用；步骤2，先进行辅因子固定化、再进行辅因子依赖性酶固定化；或先进行辅因子依赖性酶固定化，再进行辅因子固定化，即得共固定化催化剂；步骤3，共固定化催化剂连续催化应用将共固定化催化剂放在ep管中，加入0.5
‑
50 g/l底物进行反应，ph5.5
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9.0，25
‑
60℃反应10
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60min；检测底物残留和产物的生成量计算转化率，离心去上清后，再加入底物进行下一批反应，整个过程中不额外添加辅因子。
7.作为改进的是，所述辅因子为5
‑
磷酸吡哆醛（pyridoxal
‑5’ꢀ
phosphate，plp），对应的辅因子依赖性酶为plp依赖性酶，或辅因子为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，nad ），对应的辅因子依赖性酶为nad 依赖性酶。
8.进一步改进的是，所述辅因子依赖性酶的碳端或者氮端融合了几丁质结合结构域（chbd）作为标签，能够使得辅因子依赖性能够与固定化材料吸附结合固定化。
9.进一步改进的是，所述辅因子plp固定化、再进行l
‑
赖氨酸脱羧酶固定化步骤为：所述辅因子plp固定化、再进行l
‑
赖氨酸脱羧酶固定化步骤为：将步骤1中获得的脱乙酰几丁质0.01
‑
1 g加入2 ml ep管中，加入0.5
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2 ml0.01
‑
1mm的辅因子plp溶液，加入转子在冰上搅拌1
‑
5 h使得plp被充分吸附，离心收集沉淀，再用蒸馏水清洗沉淀，去除游离plp，辅因子plp被吸附在材料表面，固定化辅因子plp材料制备完成；取l
‑
赖氨酸脱羧酶制备得0.5
‑
3.5g/l蛋白浓度上清1 ml加入吸附装有固定化材料的2 ml ep管中，加转子200 rpm搅拌10
‑
30 min，使酶进行特异性吸附在材料表面，离心收集去上清后，用1 m氯化钠清洗3次，洗去游离蛋白后，再用pbs清洗3次，去除氯化钠溶液，即得共固定化l
‑
赖氨酸脱羧酶和辅因子plp得材料。
10.进一步改进的是，先进行l
‑
赖氨酸脱羧酶固定化，再进行辅因子plp固定化，具体步骤如下：先进行l
‑
赖氨酸脱羧酶固定化，再进行辅因子plp固定化，具体步骤如下：将步骤1中获得的脱乙酰几丁质0.01
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1 g加入2 ml ep管中，取l
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赖氨酸脱羧酶制备得0.5
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3.5 g/l蛋白浓度上清1 ml，加转子200 rpm搅拌10
‑
30 min，使酶进行特异性吸附在材料表面，离心去上清后收集沉淀，向沉淀中加入1m氯化钠清洗3次，洗去游离蛋白后，再用pbs清洗3次，去除氯化钠溶液，收集沉淀，加入0.5
‑
2 ml 0.01
‑
1 mm的辅因子plp溶液，加入转子在冰上搅拌1
‑
5h使得plp被充分吸附，离心收集沉淀，再用蒸馏水清洗沉淀，去除游离plp，辅因子plp被吸附在材料表面，即得共固定化l
‑
赖氨酸脱羧酶和辅因子plp得材料。
11.作为改进的是，步骤1中所述的几丁质材料来源于虾壳、蟹壳或真菌菌丝体。
12.作为改进的是，步骤1中几丁质材料为粉末，纳米纤维、纳米微球、颗粒、凝胶膜或凝胶球。
13.作为改进的是，所述脱乙酰试剂为氢氧化钠、氢氧化钾或几丁质脱乙酰酶。
14.有益效果：与现有技术相比，本发明一种辅因子与辅因子依赖性酶的共固定化连续催化的方法，具有如下优势：
1.该方法是第一次利用天然高分子材料几丁质及其脱乙酰衍生物对酶和辅因子plp进行共固定的一种新的方式；2.本发明利用的几丁质材料是一种天然高分子材料，绿色，可降解，符合目前提倡的绿色可持续发展理念；3.本发明固定化材料制备简单，共固定化方式具有可推广性。
附图说明
15.图1为激光共聚焦显微镜图，其中，（a1）为400倍放大倍数图片，未激发材料表观图，（a2）为405nm波长激发下的plp图，表示有plp固定在材料表面，（a3）为488nm波长条件下固定的融合有绿色荧光蛋白的cada
‑
chbd图，表示酶同样固定在材料表面；（a4）是（a2）和（a3）重叠，表示plp和l
‑
赖氨酸脱羧酶共固定化成功。
16.图2为不同脱乙酰度（dda）材料共固定化l
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赖氨酸脱羧酶和辅因子plp连续催化的转化率。
具体实施方案
17.实施例1步骤1，取1g100目几丁质颗粒于100 ml的蓝口瓶中，加入浓度为20%的氢氧化钠溶液100 ml，将蓝口瓶放在温度为90℃的水浴锅中，搅拌2h后取出；获得30%的脱乙酰度几丁质；抽滤去除碱液，并用清水洗至中性，烘干后备用；步骤2，称取0.01g 30%脱乙酰度几丁质于2ml ep管中，再加入0.5ml浓度为0.1mm辅因子plp溶液，再加入转子于冰上搅拌1h，使得plp被充分吸附，离心收集沉淀，再用蒸馏水清洗沉淀，去除游离plp，辅因子plp被吸附在材料表面，固定化辅因子plp材料制备完成；步骤3，将制备的1.72g/l c
‑
端接有几丁质结合结构域的l
‑
赖氨酸脱羧酶蛋白浓度粗酶液上清（l
‑
赖氨酸脱羧酶spldc
‑
chbd，5od细胞破碎，离心获取上液）1ml加入收集沉淀的管内，加转子200rpm搅拌30min，使酶进行特异性吸附在材料表面，离心收集去上清后，向沉淀中加入1 m氯化钠清洗3次，然后再用pbs清洗三次得共固定化材料；步骤4，取步骤3的共固定化材料，加入50 g/l的底物l
‑
赖氨酸进行反应，ph6.0，37℃反应10 min；离心去上清后，再加入底物进行下一批反应，整个过程中不外源添加辅因子plp；连续分批反应5次，检测l
‑
赖氨酸残留和戊二胺的生成量，计算每批反应的转化率，其中，第五次反应转化率为29%。
18.spldc
‑
chbd氨基酸序列：mnviaimnhmgvyfkeepirelhnaleklnfrivypndredllkliennarlcgvifdwdkynlelcqeiselneymplyafantystldvslndlrmqvrffeyalgaandiadkikqntdeyvdtilppltkalfkyvregkytfctpghmggtafqkspvgslfydffgpnamksdvsisvselgslldhsgphkeaeeyiarvfnaersymvtngtstankivgmysapagntvlidrnchkslthlmmmsditpiyfrptrnaygilggipqsefsratiakrvkdtpnatwpvhavitnstydgllyntdfikstldvksihfdsawvpytnfhpiykgkcgmsggrvegkviyetqsthkllaafsqasmihvkgdineetfneaymmhtttsphygivastetaaammkgnagkrlingsieraikfrkeikrlnvesegwffdvwqpehideaecwplrsdsawhgfkgidnehmyldpikvtmltpgmskdgemesfgipaslvakyldehgiivektgpynllflfsigidktkalsllrgltdfkrsfdlnlrvknmlpslykeapefyenmriqelaqnihnlvkhhnlpdlmyrafevlpamvmnpfqafqkelhgeveevyledmvgkvnanmilpyppgvplvmpge
mlteesrpvleflqmlceigahypgfetdihgayrqadgrytvkvlkndkefgssgssgsscgssgssgssklvwqegntyaagtfvsyngkdyqaqvthtayvganwnpaatptlwkevgtstnptptpvaatptpvsatptpvvatptpkpatptpatatptpagqypawsasgvytqgnrvvyqgvvyeaqwwtqgdnpaqsgswgvwrvvg实施例2步骤1，取3 g 100目几丁质颗粒于100 ml的蓝口瓶中，加入浓度为30% 的氢氧化钠溶液100 ml，将蓝口瓶放在温度为90℃的水浴锅中，搅拌2 h后取出；获得36%的脱乙酰度几丁质；抽滤去除碱液，并用清水洗至中性ph, 60℃下烘干备用；步骤2，称取 0.01g 36%脱乙酰度几丁质加入2ml ep管中，再加入1ml浓度为0.1mm辅因子plp溶液，再加入转子在冰上搅拌1h，使得plp被充分吸附，再离心收集沉淀，再用蒸馏水清洗沉淀，去除游离plp，辅因子plp被吸附在材料表面；步骤3，将制备的1.72g/l c
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端接有几丁质结合结构域的l
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赖氨酸脱羧酶蛋白浓度粗酶液上清1ml（l
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赖氨酸脱羧酶cada
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chbd，5od细胞破碎，离心获取上液，其中l
‑
赖氨酸脱羧酶cada
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chbd的来源同cn201910256808.9）加入收集沉淀的管内，加转子200rpm搅拌30 min，离心去上清，并收集沉淀，向沉淀中加入1 m氯化钠清洗3次，洗去游离蛋白后，再用pbs清洗三次，去除氯化钠溶液，得共固定化材料；步骤4，取步骤3的共固定化材料，加入50 g/l的底物l
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赖氨酸进行反应，ph6.0，37℃反应10 min；离心去上清后，再加入底物进行下一批反应，整个过程中不外源添加辅因子plp；连续分批反应5次，检测l
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赖氨酸残留和戊二胺的生成量，计算每批反应的转化率，第五次反应转化率为49%。
19.cada
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chbd氨基酸序列：mnviailnhmgvyfkeepirelhralerlnfqivypndrddllkliennarlcgvifdwdkynlelceeiskmnenlplyafantystldvslndlrlqisffeyalgaaediankikqttdeyintilppltkalfkyvregkytfctpghmggtafqkspvgslfydffgpntmksdisisvselgslldhsgphkeaeqyiarvfnadrsymvtngtstankivgmysapagstilidrnchkslthlmmmsdvtpiyfrptrnaygilggipqsefqhatiakrvketpnatwpvhavitnstydgllyntdfikktldvksihfdsawvpytnfspiyegkcgmsggrvegkviyetqsthkllaafsqasmihvkgdvneetfneaymmhtttsphygivastetaaammkgnagkrlingsieraikfrkeikrlrtesdgwffdvwqpdhidttecwplrsdstwhgfknidnehmyldpikvtlltpgmekdgtmsdfgipasivakyldehgivvektgpynllflfsigidktkalsllraltdfkrafdlnlrvknmlpslyredpefyenmriqelaqnihklivhhnlpdlmyrafevlptmvmtpyaafqkelhgmteevyldemvgrinanmilpyppgvplvmpgemiteesrpvleflqmlceigahypgfetdihgayrqadgrytvkvgssgssgsscgssgssgssmypvwqegntyaagtfvsyngkdyqaqvthtayvganwnpaatptlwkevgtstnptptpvaatptpvsatptpvvatptpkpatptpatatptpagqypawsasgvytqgnrvvyqgvvyeaqwwtqgdnpaqsgswgvwrvvgle实施例3步骤1，取3 g 100目几丁质颗粒的加入100 ml的蓝口瓶中，加入浓度为40% 的氢氧化钠溶液100ml，将蓝口瓶放在温度为90℃的水浴锅中，搅拌2 h后取出；获得40%的脱乙酰度几丁质；抽滤去碱液，并用清水洗至中性, 60℃下烘干备用；步骤2，称取 40%脱乙酰度几丁质0.01g加入2 mlep管中，在加入1ml浓度为0.1mm辅因子plp溶液，再加入转子于冰上搅拌1h，使得plp被充分吸附；再离心收集沉淀，再用蒸馏水清洗沉淀，去除游离plp，辅因子plp被吸附在材料表面，固定化辅因子plp材料制备完
6.0，37℃反应10 min；离心去上清后，再加入底物进行下一批反应，整个过程中不外源添加辅因子plp；连续分批反应5次，检测l
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赖氨酸残留和戊二胺的生成量计算每批反应的转化率，第五次反应转化率为90%。
22.综上所述，本发明一种辅因子与辅因子依赖性酶的共固定化连续催化的方法，对来源广泛，易得，可再生的几丁质通过脱乙酰预处理，作为固定化材料对辅因子plp和l
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赖氨酸脱羧酶进行共固定化研究，在连续催化合成戊二胺过程中，能够有效的防止plp的流失，提高辅因子plp和l
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赖氨酸脱羧酶的催化效率，实现辅因子plp的循环利用。