一种适用于杜鹃花属物种鉴定的matK引物及方法与流程

一种适用于杜鹃花属物种鉴定的matk引物及方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学dna技术领域，具体的，涉及一种适用于杜鹃花属物种鉴定的matk引物及方法。


背景技术：

2.杜鹃花属是杜鹃花科中种类最多、特有性极强的大属。杜鹃花属植物具有重要的观赏价值和医药价值，市场前景广阔。由于其种类繁多，仅有极少数专家能够通过形态特征进行准确鉴定。目前，dna条形码技术已被广泛应用于物种(品种)的鉴定工作中，matk就是常用的dna条形码之一。但前人利用常用的matk引物对杜鹃花属植物进行扩增时，成功率却很低。
3.刘义梅在《杜鹃花属药用植物dna条形码的鉴定研究》中，对杜鹃花属38个物种68份样品进行物种鉴定，结果显示采用matk序列pcr扩增率过低，“故在后续的数据分析中排除了matk序列的数据”。yan l j等在《dna barcoding of rhododendron(ericaceae),the largest chinese plant genus in biodiversity hotspots of the himalaya
–
hengduan mountains》中，对杜鹃花属植物进行matk序列扩增，使用引物对3f/1r扩增时有16.6％的样本未能利用该引物组合获得高质量的双向序列，使用两次、四引物pcr扩增才获得最终序列。
4.因此，目前急需开发一种扩增成功率高的matk引物。


技术实现要素：

5.本发明提出一种适用于杜鹃花属物种鉴定的matk引物及方法，解决了现有技术中的引物对杜鹃花属植物进行扩增时成功率低的问题。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种适用于杜鹃花属物种鉴定的matk引物，所述引物为一对；
8.正向引物matk
‑
390f的核苷酸序列(5
’‑3’
)为cgatctattcattcaatatttc
9.反向引物matk
‑
rh_r的核苷酸序列(5
’‑3’
)为gcccgctataataatgagaaagayttc。
10.本发明还提出一种适用于杜鹃花属物种鉴定的方法，包括以下步骤：
11.s1、提取杜鹃花属植物标本的总dna；
12.s2、引物pcr扩增得到pcr产物，所述引物为：
13.matk
‑
390f(5
’‑3’
)(cgatctattcattcaatatttc)
14.matk
‑
rh_r(5
’‑3’
)(gcccgctataataatgagaaagayttc)；
15.s3、检测pcr扩增结果；
16.s4、将所述pcr产物进行测序；
17.s5、将dna序列进行比对调整；
18.s6、对调整好的序列进行建树并进行聚类分析。
19.作为进一步的技术方案，所述步骤s2中，用于测序的pcr扩增总反应体积为25μl，
其中包括2
×
taq mix 12.5μl，引物各1.25μl，浓度为(30
±
1)ng/μl的dna模板2.5μl，加灭菌的超纯水至25μl；pcr反应程序为，94℃预变性3min，94℃变性30s、54℃退火40s、72℃延伸40s(以上变性、退火、延伸进行34个循环)，72℃延伸10min。
20.作为进一步的技术方案，所述步骤s3中，采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，具体的方案为：将2μl pcr产物与4μl 0.5
×
预染的loading buffer在点样板中混匀，将混合物点入1％的琼脂糖凝胶胶孔内，使用2μl dna ladder作为标记物，使用1
×
tae缓冲液，5v/cm进行琼脂糖凝胶电泳检测。
21.作为进一步的技术方案，所述步骤s4使用abi3730测序仪进行sanger法测序。
22.作为进一步的技术方案，所述步骤s5包括以下步骤：
23.1)dna序列使用sequencher 5.3进行序列拼接及校对；
24.2)将拼接、校对好的序列文件放入mafft自动比对；
25.3)将自动比对后的文件用bioedit对序列调整修订自动比对的错误；
26.4)将调整好的序列导入sequencematrix中生成nexus、phylip格式的文件用于建树。
27.作为进一步的技术方案，所述步骤s6包括以下步骤：
28.1)对调整好的序列进行ild test，用以检测基因之间是否可联合建树，若p值>0.01，进行联合基因建树；
29.2)利用paup 4.0b10进行mp运算，number of replicates为1000，random reps为100；
30.3)利用mrbayes进行bi运算，设置mcmcp ngen于1 000 000
‑
5 000 000之间，使最终average standard deviation of split frequencies结果小于0.01；
31.4)利用cipres网站(www.phylo.org)使用raxml tools计算ml树，核苷酸选择模型gtrcat，抽样自展1000次；
32.5)利用maga 5.2计算遗传距离，评估各序列特性。
33.本发明的有益效果为：
34.根据genbank中杜鹃花属植物所有的matk基因序列信息，发明人通过数次实验探究，重新设计了matk反向引物matk
‑
rh_r(gcccgctataataatgagaaagayttc)。本研究利用62(品)种、116号杜鹃花属植物标本对引物“matk
‑
rh_r”进行验证。结果显示，使用新引物“matk
‑
rh_r”对供试材料进行pcr扩增和测序时，pcr扩增成功率和测序成功率均为100％。这说明，新引物“matk
‑
rh_r”可用于杜鹃花属植物相关研究工作中。利用测序得到的matk序列对供试的实验材料进行聚类分析，matk基因可将杜鹃花属62(品)种分为11类，且同一品种在同一分支中。这一结果说明matk基因可用于杜鹃花属的初步鉴定研究工作中，使得matk这一分子标记可以被很好地应用于杜鹃花属植物的鉴定、系统发育学研究、物种多样性保护及中医药研究等工作中。
附图说明
35.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
36.图1为新引物“matk
‑
rh_r”与其他引物位置比较图；
37.图2为基于matk数据集，利用最大简约法、贝叶斯分析法、最大似然法构建的系统
发育树，图中数字表示三种算法的支持率(后验概率)。
具体实施方式
38.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。本发明实施例的实验方法中，如没有详细记载，均为常规实验方法。
39.一、实验材料
40.本文选取62(品)种116号杜鹃花属植物标本，其中包括21(品)种71号高山杜鹃标本，35(品)种39号azalea标本，以及6(品)种6号其他杜鹃花属植物标本用以实验研究(表1)。实验材料采集于河北、湖南等地，凭证标本放置于河北师范大学标本馆(hbnu)保存。
41.表1杜鹃花属标品分类统计
[0042][0043]
二、实验方法
[0044]
1.引物设计
[0045]
1)下载genbank中杜鹃花属植物所有的matk基因序列，使用mafft(version 7.222)将所有的matk基因序列和常用的matk引物自动比对，常用的matk引物为matk
‑
390f。
[0046]
2)在bioedit(version 7.0.9.0)软件中打开自动比对好的序列，进行手工调整，把同源序列排列至相对应的位置，排除序列插入缺失，易位倒位的问题，比较序列相似性和差异。
[0047]
3)检查常用的matk引物与杜鹃花属植物的matk基因序列的匹配程度，使用第二步的方法通过同源性的原则，将引物与序列匹配对应，检查相似性和差异，从而发现匹配的问题。
[0048]
4)根据引物设计原则设计matk引物，即根据pcr原理，引物必须和要扩增的序列一致，调整不匹配的位置，把引物和要扩增的序列相对应的位置，如二者碱基不一样则调整之。
[0049]
2.引物验证
[0050]
2.1dna提取
[0051]
使用mctab法提取上述实验材料的总dna(mctab法参考李金璐,王硕,于婧,等.一种改良的植物dna提取方法[j].植物学报,2013(1):74
‑
80.)
[0052]
2.2pcr扩增
[0053]
引物：
[0054]
matk
‑
390f(5
’‑3’
)(cgatctattcattcaatatttc)
[0055]
matk
‑
rh_r(5
’‑3’
)(gcccgctataataatgagaaagayttc)。
[0056]
用于测序的pcr扩增总反应体积为25μl，其中包括2
×
taq mix 12.5μl，引物各1.25μl，dna模板2.5μl(模板浓度30
±
0.1ng/μl)，加灭菌的超纯水至25μl。
[0057]
pcr反应程序：
[0058]
1)94℃预变性3min；
[0059]
2)94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸40s，34个循环；
[0060]
3)72℃，10min；
[0061]
4)低温16℃维持20min，用以保护样品和pcr仪。
[0062]
2.3琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增结果
[0063]
将2μl pcr产物与4μl 0.5
×
预染的loading buffer在点样板中混匀，将此混合物点入1％的琼脂糖凝胶胶孔内，使用2μl dna ladder作为标记物。使用1
×
tae缓冲液，5v/cm进行琼脂糖凝胶电泳检测。紫外凝胶成像仪显示有符合目标序列长度的阳性条带，提示扩增成功。
[0064]
2.4测序
[0065]
将pcr产物送至上海美吉生物测序有限公司(北京分公司)，使用abi3730测序仪进行sanger法测序。
[0066]
2.5数据处理
[0067]
2.5.1调整与比对
[0068]
1)dna序列使用sequencher 5.3(gene codes corporation,michigan,usa)进行序列拼接及校对；
[0069]
2)将拼接、校对好的序列文件放入mafft(version 7.222)自动比对；
[0070]
3)将自动比对后的文件用bioedit(version 7.0.9.0)对序列手工调整，降低自动比对的错误率；
[0071]
4)将手工调整好的序列导入sequencematrix(version 1.7.8)中生成nexus、phylip格式的文件用于建树。
[0072]
2.5.2建树及比较
[0073]
对调整好的序列进行分析时，使用的方法为单基因建树、多基因联合建树及遗传距离的计算。其中建树的方法包括最大简约法(maximum parsimony，mp)、贝叶斯法(bayesian inference，bi)、最大似然法(maximum likelihood，ml)。
[0074]
1)对调整好的序列进行ild检测，用以检测基因之间是否可联合建树，若p值>0.01，可进行联合基因建树。
[0075]
2)利用paup 4.0b10进行mp运算，number of replicates为1000，random reps为100。
[0076]
3)利用mrbayes进行bi运算，设置mcmcp ngen于1000000
‑
5000000之间，使最终average standard deviation of split frequencies结果小于0.01。
[0077]
4)利用cipres网站(www.phylo.org)使用raxml tools计算ml树，核苷酸选择模型gtrcat，抽样自展1000次；
[0078]
5)利用maga 5.2计算遗传距离，同时评估各序列特性。
[0079]
三、实验结果
[0080]
1.将常用matk引物与genbank上杜鹃花属所有matk片段的序列进行比较，发现杜鹃花属的基因序列在matk反向引物处发生了变异，与常用的matk反向引物吻合度较低，这是前人研究中扩增失败的主要原因。因此，我们对matk的反向引物重新进行设计，得到了新引物即matk
‑
rh_r(5
’‑3’
)(gcccgctataataatgagaaagayttc)，图1为新引物“matk
‑
rh_r”与其他引物位置比较图。
[0081]
2.本文使用matk
‑
390f、matk
‑
rh_r对杜鹃花属植物进行体外扩增时扩增率及测序率均为100％，相比于现有技术，比如，刘义梅认为其研究中扩增“成功率极低”，故在后续的数据分析中排除了matk序列的数据，又如yan l j使用两对matk引物才能扩增出所有供试的杜鹃花属实验材料。这说明，新设计的matk
‑
rh_r引物可以被成功应用到杜鹃花属植物分子鉴定研究中。
[0082]
3.利用测序得到的matk序列对供试的实验材料进行聚类分析(图2)，可以看出，matk基因可将杜鹃花属62(品)种分为11类，且同一品种在同一分支中。这一结果说明，matk基因可用于杜鹃花属的初步鉴定研究工作中。
[0083]
本研究使用matk
‑
390f、matk
‑
rh_r这一对引物用以扩增杜鹃花属matk基因，扩增成功率和测序成功率均为100％。相较于以往的引物而言，大大提高了实验的成功率，使得matk这一分子标记可重新被应用于杜鹃花属dna条形码的研究工作中。
[0084]
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。