无机多孔质担载体及使用其的核酸的制造方法与流程

1.本专利申请主张基于日本专利申请2019
‑
067994号(于2019年3月29日提出申请)的巴黎公约上的优先权及权益，通过在此引用，上述申请所记载的全部内容被并入本说明书中。
2.本发明涉及无机多孔质担载体及使用其的核酸的制造方法、以及适合于向无机多孔质体中导入官能团的硅烷偶联剂。


背景技术：

3.作为核酸的化学合成法，基于亚磷酰胺法的固相合成法已被广泛使用。在该方法中，首先，使用硅烷偶联剂等在无机多孔质体上导入氨基等官能团，使成为核酸的3’末端的核苷键合于前述官能团。其后，将前述核苷作为起点，在固相担载体上进行核酸延伸反应。
4.在固相合成法中，若要合成的核酸的链长变长，则常常造成合成效率迅速降低、混入大量副产物的结果。认为这是因为，在固相担载体表面上延伸的核酸分子彼此干扰，产生了延伸反应的阻碍、副反应等。
5.作为防止固相担载体表面上的核酸分子彼此的干扰的技术，例如提出了增长在担载体上导入的烷基氨基的间隔物的方案(参见非专利文献1)。
6.现有技术文献
7.非专利文献
8.非专利文献1：j.katzhendler等人,tetrahedron,45,2777,1989


技术实现要素：

9.发明所要解决的课题
10.通常，要合成的核酸越长，则核酸分子彼此的干扰的影响越大，因此，在以往的固相合成法中，核酸合成的收率、纯度容易降低。
11.本发明是鉴于如上所述的情况而作出的，其课题在于，提供在核酸的制造中可进一步提高收率等的无机多孔质担载体及使用其的核酸的制造方法。
12.用于解决课题的手段
13.为了解决上述课题，本发明采用以下的构成。
14.即，本发明的第1方式为无机多孔质担载体，其特征在于，具有下述通式(1)表示的连接体，并且具有细孔径(众数直径，下同)为0.04μm以上的细孔分布。
15.[化学式1]
[0016][0017]
[式中，标有＊的键表示在无机多孔质体的硅烷醇基的氧原子上的键。
[0018]
r1及r2各自独立地表示可具有选自由烷氧基及氟原子组成的组中的取代基的碳原子数为3～10的烷基、或可具有选自由烷基、烷氧基及氟原子组成的组中的取代基的苯基。
[0019]
l表示单键、碳原子数为1～20的亚烷基、或者作为碳原子数为2～20的亚烷基的、包含在构成该亚烷基的至少一个
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ch2‑
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基团中插入有选自由
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及
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组成的组中的任一基团q的基团：
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ch2‑
q
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的基团。其中，不包括与基团q键合的亚甲基的碳原子进一步与另外的基团q同时键合的情况。]
[0020]
本发明的第2方式为无机多孔质担载体，其特征在于，具有下述通式(2)表示的连接体，并且具有细孔径(众数直径)为0.04μm以上的细孔分布(以下有时也将该无机多孔质担载体记载为“固相担载体”。)。
[0021]
[化学式2]
[0022][0023]
[式中，标有＊的键表示在无机多孔质体的硅烷醇基的氧原子上的键。
[0024]
r1及r2各自独立地表示可具有选自由烷氧基及氟原子组成的组中的取代基的碳原子数为3～10的烷基、或可具有选自由烷基、烷氧基及氟原子组成的组中的取代基的苯基。
[0025]
l表示单键、碳原子数为1～20的亚烷基、或者作为碳原子数为2～20的亚烷基的、包含在构成该亚烷基的至少一个
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ch2‑
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基团中插入有选自由
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及
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组成的组中的任一基团q的基团：
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q
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的基团。其中，不包括与基团q键合的亚甲基的碳原子进一步与另外的基团q同时键合的情况。
[0026]
r
b
表示反应性基团被保护或脱保护的核苷或核苷酸。
[0027]
l1表示与r
b
的伯羟基或仲羟基的氧原子键合的2价基团。]
[0028]
(以下，将第1方式的无机多孔质担载体及第2方式的无机多孔质担载体总称为本发明的无机多孔质担载体)。
[0029]
根据本发明的第2方式中的某一实施方式，前述通式(2)中的l1可以为琥珀酰连接体(succinyl linker)或通用连接体(universal linker)。
[0030]
根据本发明的第1方式或第2方式中的某一实施方式，前述无机多孔质体的单位体积的比表面积可以为0.1m2/ml以上100m2/ml以下。
[0031]
根据本发明的第1方式或第2方式中的某一实施方式，前述无机多孔质体的单位体积的细孔容积可以为0.05ml/ml以上0.6ml/ml以下。
[0032]
根据本发明的第1方式或第2方式中的某一实施方式，前述无机多孔质体的气孔率可以为50％以上。
[0033]
根据本发明的第2方式中的某一实施方式，前述连接体的担载密度相对于前述无机多孔质体的单位质量的比表面积而言可以为0.1μmol/m2以上5.0μmol/m2以下。
[0034]
根据本发明的第1方式或第2方式中的某一实施方式，前述无机多孔质体的粒径(中值粒径)可以为1μm以上1000μm以下。
[0035]
根据本发明的第1方式或第2方式中的某一实施方式，前述无机多孔质体可以为二氧化硅、硅胶、沸石或玻璃。
[0036]
本发明的第3方式为核酸的制造方法，其特征在于，包括：工序(a)，使用前述通式(2)中的r
b
表示作为反应性基团的羟基被保护的核苷或核苷酸的无机多孔质担载体，将前述的核苷的5’位的羟基的保护基脱保护；工序(b)，使前述工序(a)中生成的核苷的5’位的羟基、与具有第2核苷碱基的亚酰胺化合物进行缩合反应，生成亚磷酸酯；工序(c)，使前述工序(b)中生成的亚磷酸酯氧化，生成核苷酸；以及，工序(d)，将前述工序(c)中生成的核苷酸的5’位的羟基的保护基脱保护(以下，称为“本发明的核酸的制造方法”)。
[0037]
根据本发明的第3方式中的某一实施方式，核酸的制造方法可以包括：
[0038]
工序(b’)，使前述工序(d)中生成的产物、与具有接下来预定导入的核苷碱基的亚酰胺化合物进一步进行缩合反应，生成亚磷酸酯；
[0039]
工序(c’)，使前述工序(b’)中生成的亚磷酸酯氧化，生成寡核苷酸；以及，
[0040]
工序(d’)，将前述工序(c’)中生成的寡核苷酸链末端的5’位的羟基的保护基脱保护。
[0041]
根据本发明的第3方式中的某一实施方式，核酸的制造方法可以包括下述工序(e)：将由前述的工序(b’)、工序(c’)及工序(d’)组成的一系列工序进一步重复m次(m表示1以上的整数。)，使m个亚酰胺化合物进行反应后，将延伸得到的核酸切出。
[0042]
本发明的第4方式为硅烷偶联剂，其特征在于，由下述通式(3)表示(以下，称为“本发明的硅烷偶联剂”)。
[0043]
[化学式3]
[0044][0045]
[式中，r1及r2各自独立地表示可具有选自由烷氧基及氟原子组成的组中的取代基的碳原子数为3～10的烷基、或可具有选自由烷基、烷氧基及氟原子组成的组中的取代基的苯基。
[0046]
l表示单键、碳原子数为1～20的亚烷基、或者作为碳原子数为2～20的亚烷基的、包含在构成该亚烷基的至少一个
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ch2‑
ch2‑
基团中插入有选自由
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及
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组成的组中的任一基团q的基团：
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ch2‑
q
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ch2‑
的基团。其中，不包括与基团q键合的亚甲基的碳原子进一步与另外的基团q同时键合的情况。
[0047]
r3表示氢原子或碳原子数为1～4的烷基。
[0048]
其中，不包括下述情况：l为亚甲基、r1为异丙基、r2为异丙基、r3为乙基的情况；以及，l为亚甲基、r1为正丙基、r2为正丙基、r3为正丙基的情况。]
[0049]
本发明的第5方式为前述第1方式涉及的无机多孔质担载体、或前述第2方式涉及的固相担载体在基于亚磷酰胺法的核酸的制造中的用途。
[0050]
发明的效果
[0051]
根据本发明涉及的无机多孔质担载体，在核酸的制造中可进一步提高纯度或收率。
[0052]
根据本发明涉及的核酸的制造方法，可进一步提高纯度或收率，尤其能够以高收率得到长链核酸。
具体实施方式
[0053]
本说明书中，关于某个数值范围，在记为“a至b”或“a～b”的情况下，只要没有特别说明，则是指“a以上至(～)b以下”的范围。
[0054]
(无机多孔质担载体)
[0055]
对作为本发明的第1方式的无机多孔质担载体进行说明。
[0056]
构成本实施方式的无机多孔质担载体的无机多孔质体是具有细孔径为0.04μm以上的细孔分布的无机多孔质体，典型而言，是能够担载硅烷偶联剂、且具有硅烷醇基的无机多孔质体。作为所述无机多孔质体，典型而言，可例示二氧化硅、硅胶、沸石、玻璃、石英、或它们中的2种以上，优选为二氧化硅、硅胶、沸石或玻璃。这些物质可以使用市售品，或者也可以使用通过如下所述的合成方法制备的物质。
[0057]
[包含硅烷醇基的无机多孔质体的制造方法]
[0058]
作为包含硅烷醇基的无机多孔质体的制造方法，可例示干式法和湿式法。作为前者的具体例，可举出燃烧法、电弧法，作为后者的具体例，可举出沉降法、溶胶
‑
凝胶法、水热合成法等合成方法(参考文献：tosoh research&technology review vol.45(2001).)。
[0059]
关于所述无机多孔质体的制备，例如，将硅酸盐、烷氧基硅烷、氯硅烷类等作为原料，使用溶剂、模板通过如前所述的合成方法来制备。
[0060]
所述无机多孔质体的制备可以使用例如下述方法中的任意方法来进行：1.使二氧化硅析出后，将二氧化硅的骨架中包含的溶剂除去的方法；2.将二氧化硅以外的、例如铝、硼等不同种类的金属混合并使固体析出后，使其相分离为二氧化硅成分和二氧化硅以外的成分，将二氧化硅以外的成分除去的方法；3.混合铵盐、高分子作为模板剂使二氧化硅析出后，将模板剂除去的方法；或者，4.使所析出的二氧化硅凝集的方法。也可以组合使用它们中的2种以上的方法。
[0061]
作为前述1及3的、将溶剂或模板剂除去的方法，可以使用干燥、超临界萃取、烧成等。
[0062]
对于得到的无机多孔质体而言，作为其形态，优选为粒子，可以成型为球状，也可以为块状或破碎状，但在将它们用作担载体时，从在核酸合成柱中的填充性的观点考虑，优选为球状或破碎状。
[0063]
作为成型法，没有特别限定，可以使用喷雾干燥法、乳液法。
[0064]
前述无机多孔质体的大小没有特别限定，但从核酸的固相合成时的柱填充效率及柱填充时的送液速度等的观点考虑，利用激光衍射法(散射式)测定的粒径(中值粒径，下同)优选为1～1000μm，更优选为5～500μm，进一步优选为10～300μm。
[0065]
作为本实施方式中的无机多孔质体，使用具有0.04μm以上的细孔径的多孔质体。使用的无机多孔质体可根据要合成的核酸的链长而适当地选择。通常，在要合成的核酸的链长较长的情况下，优选选择细孔径大的无机多孔质体。例如，在合成40～200mer的rna的情况下，作为细孔径，优选为0.04μm以上0.5μm以下，更优选为0.04μm以上0.3μm以下。
[0066]
对于细孔径(众数直径)而言，在通过压汞法得到的细孔径分布(其为曲线图，其中，使x轴为细孔径的值，使y轴为将细孔容积以细孔径进行微分而得到的值)中，由峰顶的x轴的值求出。
[0067]
前述无机多孔质体的单位体积的比表面积没有特别限定。为了提高每根柱中的核
酸的生成量，与核酸的链长无关地，单位体积的比表面积越高越优选。作为单位体积的比表面积，具体而言，优选为0.1～100m2/ml，更优选为1～50m2/ml，进一步优选为3～20m2/ml。
[0068]
单位体积的比表面积利用通过压汞法得到的体积密度(g/ml)与通过n2吸附脱附等温线测定而得到的单位质量的比表面积(m2/g)之积来求出。需要说明的是，此处的单位质量的比表面积使用通过被称为αs
‑
plot法的方法而由αs＝1.7～2.1的范围的平均斜率求出的值。
[0069]
本实施方式的无机多孔质体的细孔容积没有特别限定。通常，为了提高每根柱中的核酸的生成量，与核酸的链长无关地，单位体积的细孔容积(ml/ml)越高越优选。单位体积的细孔容积优选为0.05～0.6ml/ml，更优选为0.05～0.5ml/ml。
[0070]
前述单位体积的细孔容积利用通过压汞法得到的体积密度(g/ml)、与细孔径在0.04μm至1μm的范围内的累积细孔容积(ml/g)之积来求出。
[0071]
无机多孔质体的气孔率没有特别限定，通常，为了提高每根柱中的核酸的生成量，与核酸的链长无关地，无机多孔质体的气孔率越高越优选。前述气孔率利用压汞法来求出，优选为50％以上，进一步优选为70％以上。
[0072]
此处的气孔率由作为压汞法的测定范围的细孔径0.004～200μm的范围内的细孔容积算出。即，利用在0.004μm至200μm的范围内的累积细孔容积(ml/g)与体积密度(g/ml)之积来求出。
[0073]
本实施方式的无机多孔质担载体具有下述通式(1)表示的连接体。
[0074]
[化学式4]
[0075][0076]
[式中，标有＊的键表示在无机多孔质体的硅烷醇基的氧原子上的键。
[0077]
r1及r2各自独立地表示可具有选自由烷氧基及氟原子组成的组中的取代基的碳原子数为3～10的烷基、或可具有选自由烷基、烷氧基及氟原子组成的组中的取代基的苯基。
[0078]
l表示单键、碳原子数为1～20的亚烷基、或者作为碳原子数为2～20的亚烷基的、包含在构成该亚烷基的至少一个
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ch2‑
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基团中插入有选自由
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及
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组成的组中的任一基团q的基团：
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ch2‑
q
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ch2‑
的基团。其中，不包括与基团q键合的亚甲基的碳原子进一步与另外的基团q同时键合的情况。]
[0079]
前述式(1)中，r1及r2中的烷基为直链状烷基、支链状烷基或环状烷基中的任意均可，从容易提高收率的方面考虑，优选为支链状烷基。r1及r2中的烷基的碳原子数为3～10，优选碳原子数为3～6，更优选碳原子数为3或4。
[0080]
作为r1及r2中的烷基，可举出例如正丙基、正丁基、正己基、正辛基等直链状烷基；异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、2
‑
乙基己基、3,7
‑
二甲基辛基等支链状烷基；及环丙基、环己基等环状烷基。
[0081]
可对r1及r2表示的烷基进行取代的取代基为烷氧基、氟原子。作为该烷氧基，可举出例如碳原子数为1～3的烷氧基。
[0082]
可对r1及r2表示的苯基进行取代的取代基为烷基、烷氧基、氟原子。作为此处的烷
基，可举出例如碳原子数为1～5的烷基。作为此处的烷氧基，可举出例如碳原子数为1～3的烷氧基。
[0083]
r1及r2可以彼此相同，也可以不同，从合成上(例如，简便性、效率性)的观点考虑，优选相同。
[0084]
前述式(1)中，对于l中的碳原子数为1～20的亚烷基而言，为直链状亚烷基、支链状亚烷基中的任意均可，从容易提高收率的方面考虑，优选为直链状亚烷基。该l中的亚烷基的碳原子数为1～20，优选碳原子数为1～10，更优选碳原子数为1～6。
[0085]
另外，前述式(1)中，l也可以表示作为碳原子数为2～20的亚烷基的、包含在构成该亚烷基的至少一个
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基团中插入有选自由
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组成的组中的任一基团q的基团：
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q
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的基团。其中，不包括与基团q键合的亚甲基的碳原子进一步与另外的基团q同时键合的情况。
[0086]
[对连接体进行担载的无机多孔质体(无机多孔质担载体)的制造方法]
[0087]
本实施方式的无机多孔质担载体例如可以通过利用下述通式(3a)表示的硅烷偶联剂对前述无机多孔质体进行表面处理的方法来制造。
[0088]
[化学式5]
[0089][0090]
[式中，r1及r2各自独立地表示可具有选自由烷氧基及氟原子组成的组中的取代基的碳原子数为3～10的烷基、或可具有选自由烷基、烷氧基及氟原子组成的组中的取代基的苯基。
[0091]
l表示单键、碳原子数为1～20的亚烷基、或者作为碳原子数为2～20的亚烷基的、包含在构成该亚烷基的至少一个
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ch2‑
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基团中插入有选自由
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及
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组成的组中的任一基团q的基团：
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ch2‑
q
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ch2‑
的基团。其中，不包括与基团q键合的亚甲基的碳原子进一步与另外的基团q同时键合的情况。
[0092]
r3表示氢原子或碳原子数为1～4的烷基。]
[0093]
前述式(3a)中，关于r1、r2及l的说明与关于前述式(1)中的r1、r2及l的说明同样。
[0094]
前述式(3a)中，r3中的烷基优选为碳原子数为1～3的烷基，更优选为甲基或乙基。
[0095]
以下举出前述通式(3a)表示的硅烷偶联剂的优选的具体例。
[0096]
[化学式6]
[0097][0098]
[化学式7]
[0099][0100]
[化学式8]
[0101][0102]
[化学式9]
[0103][0104]
[化学式10]
[0105][0106]
上述的通式(3a)的硅烷偶联剂可以通过以下所示的反应路径(合成路线1、合成路线2、或合成路线3)来制造。
[0107]
[化学式11]
[0108][0109]
合成路线1(步骤1
→
步骤2
→
步骤3)的说明：
[0110]
例如化合物1为三氯硅烷的情况下，使该化合物1和与r1及r2对应的有机锂化合物或有机镁化合物进行反应(亲核取代反应)，得到化合物2(步骤1)。接着，使r3oh(例如甲醇、乙醇、或丙醇等)在碱的存在下进行反应，或者使r3ona等醇盐或水(r3：氢)进行反应，得到硅烷化合物3(步骤2)。其后，在铂催化剂的存在下，使具有末端烯烃的胺化合物或卤素化合物(例如，烯丙基胺或6
‑
氯
‑1‑
己烯)进行氢化硅烷化反应，从而能够合成硅烷化合物4(步骤
3)。
[0111]
或者，化合物1为烷氧基硅烷(三甲氧基硅烷或三乙氧基硅烷等)的情况下，也可以通过与前述同样的反应，利用亲核取代反应而向该化合物1中导入取代基(r1、r2)，其后，利用前述氢化硅烷化反应而合成硅烷化合物4。
[0112]
合成路线2(步骤4
→
步骤5
→
步骤6)的说明：
[0113]
例如化合物1为三氯硅烷的情况下，在铂催化剂的存在下使该化合物1进行氢化硅烷化反应，由此加成作为间隔物的链，得到化合物5(步骤4)。接着，利用亲核取代反应而导入前述同样的取代基(r1、r2)，得到化合物6(步骤5)。接着，使r3oh(例如甲醇、乙醇、或丙醇等)在碱的存在下进行反应，或者使r3ona等醇盐或水(r3：氢)进行反应，得到硅烷化合物4(步骤6)。
[0114]
步骤2、步骤6中的r3o基团(甲氧基、乙氧基、或丙氧基等)的导入可以通过下述方法来进行：将作为试剂r3oh的甲醇、乙醇、丙醇等添加至包含化合物2或化合物6的溶液中的方法；或者，将化合物2或化合物6滴加至对应的醇或包含对应的醇的溶液中的方法。
[0115]
合成路线3(步骤7)的说明：
[0116]
在上述的合成路线1及合成路线2中，可得到具有官能团y(氨基或卤素原子)的硅烷化合物4。
[0117]
官能团y为氨基的情况下，通过使用将硅烷化合物4的氨基进行氨基甲酰化或酰胺化或酰脲化的方法，能够制造各种硅烷偶联剂。
[0118]
官能团y为卤素原子的情况下，通过使硅烷化合物4a与氨或伯胺化合物进行反应，从而使卤素原子脱离而导入氨基或亚氨基(
‑
nh
‑
)，由此得到硅烷化合物4b，可以将其直接作为硅烷偶联剂，或者通过与上述同样的方法来制造各种硅烷偶联剂(步骤7)。
[0119]
在上述的任意反应中，均优选使用反应溶剂。作为该反应溶剂，优选为戊烷、己烷、庚烷、甲苯、四氢呋喃等、或它们中的2种以上有机溶剂。
[0120]
硅烷化合物的纯化中通常使用常压或减压条件下的蒸馏。得到的硅烷偶联剂的纯化中使用例如分液、蒸馏、柱色谱法。
[0121]
就具有前述通式(1)表示的连接体的无机多孔质担载体的制造而言，例如通过在将前述无机多孔质体、特定的硅烷偶联剂与溶剂混合之后除去溶剂的方法来进行。在该情况下，通过前述混合，特定的硅烷偶联剂与无机多孔质体的表面的硅烷醇基共价键合，生成担载通式(1)表示的连接体的无机多孔质担载体。
[0122]
作为此处的溶剂，例如可以使用乙腈、甲苯、苯甲醚、2
‑
庚酮、丙二醇单甲基醚乙酸酯、n,n
‑
二甲基甲酰胺、四氢呋喃、戊烷、己烷、庚烷、二甲苯、均三甲苯、二氯甲烷、氯苯、水等、或它们中的2种以上，这些之中，优选甲苯。
[0123]
对于前述的无机多孔质体及溶剂而言，从抑制硅烷偶联剂彼此的聚合、促进硅烷偶联剂与无机多孔质体表面的反应的观点考虑，优选进行脱水后使用。脱水方法没有特别限定，可举出例如：在减压下对无机多孔质体进行加热的方法；使无机多孔质体分散于溶剂后，在常压或减压下将溶剂蒸馏除去并进行共沸脱水的方法。
[0124]
在无机多孔质体和硅烷偶联剂与溶剂的前述混合时，通常为了促进反应而加热至溶剂的沸点附近，但并不限定于此，也可以为室温，还可以冷却至室温以下。
[0125]
无机多孔质体与硅烷偶联剂的反应通常进行1～12小时左右，但在具有氨基的硅
烷偶联剂的情况下，由于其本身具有促进反应的催化效果，因此也可以进行数分钟左右。
[0126]
关于硅烷偶联剂的添加量，相对于通过n2吸附脱附测定而求出的、无机多孔质体的单位质量的比表面积而言，通常为连接体的担载密度成为0.1～5.0μmol/m2的量，优选为连接体的担载密度成为0.5～2.0μmol/m2的量。
[0127]
对于在与硅烷偶联剂的反应中未被使用的硅烷醇基而言，期望的话，可以用三甲基甲硅烷基这样的对核酸合成而言为非活性的官能团进行封端。
[0128]
如上所述，通过利用特定的硅烷偶联剂对前述无机多孔质体进行表面处理，能够制造利用具有取代基(r1、r2)的氨基甲硅烷基进行了修饰的无机多孔质担载体。
[0129]
(核酸的制造方法)
[0130]
本实施方式的核酸的制造方法可以使用上述的无机多孔质担载体，应用已知的方法来合成核酸。其中，基于亚磷酰胺法的核酸的制造是优选的。以下，对基于亚磷酰胺法的核酸合成法进行说明。
[0131]
[固相担载体的制作]
[0132]
固相担载体是指：在上述的无机多孔质担载体所具有的氨基(
‑
nh2)上介由2价基团而键合有反应性基团被保护或脱保护的核苷或核苷酸的固相担载体。
[0133]
本实施方式中，可以使用具有下述通式(2)表示的连接体、并且具有细孔径(众数直径)为0.04μm以上的细孔分布的无机多孔质担载体作为固相担载体。
[0134]
[化学式12]
[0135][0136]
[式中，标有＊的键表示在无机多孔质体的硅烷醇基的氧原子上的键。
[0137]
r1及r2各自独立地表示可具有选自由烷氧基及氟原子组成的组中的取代基的碳原子数为3～10的烷基、或可具有选自由烷基、烷氧基及氟原子组成的组中的取代基的苯基。
[0138]
l表示单键、碳原子数为1～20的亚烷基、或者作为碳原子数为2～20的亚烷基的、包含在构成该亚烷基的至少一个
‑
ch2‑
ch2‑
基团中插入有选自由
‑
o
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
nh
‑
co
‑
及
‑
nh
‑
co
‑
nh
‑
组成的组中的任一基团q的基团：
‑
ch2‑
q
‑
ch2‑
的基团。其中，不包括与基团q键合的亚甲基的碳原子进一步与另外的基团q同时键合的情况。
[0139]
r
b
表示反应性基团被保护或脱保护的核苷或核苷酸。l1表示与r
b
的伯羟基或仲羟基的氧原子键合的2价基团。]
[0140]
前述式(2)中，关于r1、r2及l的说明与关于前述式(1)中的r1、r2及l的说明同样。
[0141]
前述式(2)中，作为与亚氨基(
‑
nh
‑
)键合的2价基团l1，优选为具有琥珀酰基作为官能团的2价基团。
[0142]
作为2价基团l1的典型例，可例示琥珀酰连接体、通用连接体、或由将前述式(2)中的亚氨基(
‑
nh
‑
)与通用连接体连接的基团、和通用连接体构成的连接基团。
[0143]
所谓通用连接体，含有与成为核酸合成的起点的核苷酸的羟基形成亚磷酸酯的官能团(典型而言为羟基)、和具有与前述式(1)表示的连接体末端的氨基键合的能力的官能团，并且，在同一分子内含有具有在将所合成的核酸切去时的条件下对磷酸的磷原子进行
亲核攻击的能力的、相邻的被保护的官能团(例如，均被保护的氨基、羟基、硫醇基)。
[0144]
更详细而言，作为2价基团l1，可例示下述的式l
10
表示的连接基团、或式l
11
表示的连接基团。
[0145]
[化学式13]
[0146][0147]
此处，式l
10
及式l
11
中，标有
●
的键表示在前述式(2)中的亚氨基(
‑
nh
‑
)上的键。标有#的键表示与前述式(2)中的r
b
的伯羟基或仲羟基的氧原子之间的键。
[0148]
式l
11
中，z1表示均被保护的氨基、羟基或硫醇基。键合在z上的氧原子及z1表示彼此相邻(例如，存在于邻位，各自所键合的z的碳原子之间彼此相互直接键合)的基团。
[0149]
l
12
表示将亚氨基(
‑
nh
‑
)与通用连接体连接的基团(例如，表示
●‑
co(ch2)2co
‑
&。
[0150]
标有&的键表示与z之间的键)。
[0151]
需要说明的是，使用通用连接体的情况下，无论想要合成的核酸的3’末端为何种核苷或核苷酸，均可以使成为3’末端的核苷亚磷酰胺以与通常的核酸自动合成中使核酸延伸的工序相同的方式进行反应从而将其导入。作为所述通用连接体，可例示例如下述的文献中记载的化合物，但不限定于这些。
[0152]
文献：a.p.guzaev,和m.manoharan,j amchem soc,2003,125,2380
‑
2381.
[0153]
文献：r.k.kumar,a.p.guzaev,c.rentel,和v.t.ravikumar,tetrahedron,2006,62,4528.
[0154]
前述式(2)中，r
b
优选是将成为核酸延伸反应的起点的核苷的5’位的羟基用三苯甲基系保护基(例如，4,4
’‑
二甲氧基三苯甲基(dmtr)等)保护而得到的。
[0155]
使用通用连接体时也同样，优选将成为核酸延伸反应的起点的羟基用三苯甲基系保护基(例如，4,4
’‑
二甲氧基三苯甲基(dmtr)等)保护。
[0156]
关于具有前述式(2)表示的连接体的固相担载体的制备，典型而言，可使具有前述通式(1)表示的连接体的无机多孔质担载体、与化合物(r
b
‑
l
10
‑
w)进行缩合反应来实施。该l
10
表示前述的式l
10
表示的连接基团。w表示反应性的官能团(例如，羟基)。
[0157]
使用核苷连接体的情况下，根据要合成的rna的序列来选择与3’末端的碱基对应的核苷连接体。作为前述核苷连接体，可举出具有琥珀酰基作为与氨基(
‑
nh2)反应的官能团的核苷连接体。
[0158]
以下例示包含琥珀酰基的核苷连接体。
[0159]
式中的＊表示在前述式(2)中的亚氨基(
‑
nh
‑
)上的键。tbdms是指叔丁基二甲基甲硅烷基。ac是指乙酰基。me是指甲基。ph是指苯基。
[0160]
[化学式14]
[0161][0162]
对于此处的缩合反应而言，将前述无机多孔质担载体、前述化合物(r
b
‑
l
10
‑
w)、缩合剂、和适当的溶剂混合，通常，于室温进行振荡，或者为了促进缩合反应而进行升温来实施。对于该缩合反应而言，也可以在不振荡的情况下静置，一边搅拌一边实施。
[0163]
对于在前述缩合反应时使用的缩合剂而言，只要是通常在酰胺缩合中使用的缩合剂，就可以使用。作为缩合剂，具体而言，可例示n,n
’‑
二环己基碳二亚胺(dcc)、n,n
’‑
二异丙基碳二亚胺(dic)、1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edac)、1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)、1
‑
[双(二甲基氨基)亚甲基]
‑
1h
‑
1,2,3
‑
三唑并[4,5
‑
b]吡啶鎓3
‑
氧化物六氟磷酸盐(hatu)、1
‑
[双(二甲基氨基)亚甲基]
‑
1h
‑
1,2,3
‑
苯并三唑鎓3
‑
氧化物六氟磷酸盐(hbtu)、1
‑
[双(二甲基氨基)亚甲基]
‑
1h
‑
1,2,3
‑
三唑并[4,5
‑
b]吡啶鎓3
‑
氧化物四氟硼酸盐(tatu)、1
‑
[双(二甲基氨基)亚甲基]
‑
1h
‑
1,2,3
‑
苯并三唑鎓3
‑
氧化物四氟硼酸盐(tbtu)、(1
‑
氰基
‑2‑
乙氧基
‑2‑
氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基吗啉基碳鎓六氟磷酸盐(comu)、o
‑
[(乙氧基羰基)氰基亚甲基氨基]
‑
n,n,n’,n
’‑
四甲基脲鎓六氟磷酸盐(totu)等、或它们中的2种以上。也可以加入n,n
‑
二甲基
‑4‑
氨基吡啶(dmap)、n,n
‑
二异丙基乙基胺等添加剂。
[0164]
对于缩合反应后的固相担载体而言，通过使用溶剂进行过滤从而滤出。作为过滤用溶剂，可举出乙腈等。可以对未反应的氨基进行封端处理。作为封端处理剂，可使用例如乙酸酐(乙酸酐
‑
四氢呋喃溶液等)、苯氧基乙酸酐(苯氧基乙酸酐/n
‑
甲基咪唑溶液等)。关于封端的成功与否，可以利用茚三酮试验来进行。使用具有4,4
’‑
二甲氧基三苯甲基(dmtr)等保护基的核苷连接体、通用连接体的情况下，可以通过基于酸的dmtr基团的切断和吸光度测定来进行已反应的核苷的定量。
[0165]
关于前述(r
b
‑
l1)的担载量，相对于通过n2吸附脱附测定而求出的、无机多孔质体的单位质量的比表面积而言，通常为0.1～5.0μmol/m2的量，优选为0.5～2.0μmol/m2的量。
[0166]
本实施方式的固相担载体适合作为核酸(dna、rna)的固相合成用基材。其中，本实施方式的固相担载体特别适合于被认为与dna相比在稳定性上存在问题的rna的合成。
[0167]
以下，举出rna的固相合成为例，参照以下所示的反应路径(缩合反应、氧化、脱保护)来对核酸的制造方法进行说明。
[0168]
需要说明的是，关于以下所示的反应路径，示出使用核苷作为前述式(2)中的r
b
的例子。
[0169]
[化学式15]
[0170][0171]
在示出反应路径的化学式中，分别地，r4表示碱基；tr表示保护基；x表示
‑
h、
‑
oh或
‑
or5(r5为保护基)。
[0172]
构成具有前述通式(2)表示的连接体的固相担载体(sp
‑
nu)及亚酰胺单体(am
‑
1)的核苷的碱基(r4)通常为核酸，典型而言为构成rna的天然碱基，但也可以根据情况而使用非天然碱基。作为所述非天然碱基，可例示天然或非天然碱基的修饰类似物。
[0173]
作为r4表示的碱基，可举出例如腺嘌呤、异鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤及鸟嘌呤等嘌呤碱基；以及胞嘧啶、尿嘧啶及胸腺嘧啶等嘧啶碱基等。
[0174]
另外，作为r4表示的碱基，可举出例如：2
‑
氨基腺嘌呤、2
‑
氨基嘌呤、2,6
‑
二氨基嘌呤等氨基衍生物；5
‑
甲基尿嘧啶、5
‑
甲基胞嘧啶、7
‑
甲基鸟嘌呤、6
‑
甲基嘌呤、2
‑
丙基嘌呤等烷基衍生物；5
‑
卤代尿嘧啶及5
‑
卤代胞嘧啶；5
‑
丙炔基尿嘧啶及5
‑
丙炔基胞嘧啶；6
‑
氮杂尿嘧啶、6
‑
氮杂胞嘧啶及6
‑
氮杂胸腺嘧啶；5
‑
尿嘧啶(假尿嘧啶)、4
‑
硫代尿嘧啶、5
‑
(2
‑
氨基丙基)尿嘧啶、5
‑
氨基烯丙基尿嘧啶；8
‑
卤化、氨基化、硫醇化、硫代烷基化、羟基化及其他的8
‑
取代嘌呤；5
‑
三氟甲基化及其他的5
‑
取代嘧啶；6
‑
氮杂嘧啶；n
‑
2、n
‑
6及o
‑
6取代嘌呤(包括2
‑
氨基丙基腺嘌呤)；二氢尿嘧啶；3
‑
去氮
‑5‑
氮杂胞嘧啶；7
‑
去氮腺嘌呤；n6
‑
甲基腺嘌呤、n6,n6
‑
二甲基腺嘌呤；5
‑
氨基
‑
烯丙基
‑
尿嘧啶；n3
‑
甲基尿嘧啶；取代1,2,4
‑
三唑；2
‑
吡啶酮；5
‑
硝基吲哚；3
‑
硝基吡咯；5
‑
甲氧基尿嘧啶；尿嘧啶
‑5‑
氧基乙酸；5
‑
甲氧基羰基甲基尿嘧啶；2
‑
硫代尿嘧啶、5
‑
甲基
‑2‑
硫代尿嘧啶；5
‑
甲氧基羰基甲基
‑2‑
硫代尿嘧啶；5
‑
甲基氨基甲基
‑2‑
硫代尿嘧啶；3
‑
(3
‑
氨基
‑3‑
羧基丙基)尿嘧啶；3
‑
甲基胞嘧啶；n4
‑
乙酰基胞嘧啶；2
‑
硫代胞嘧啶；n6
‑
甲基腺嘌呤；n6
‑
异戊基腺嘌呤；2
‑
甲硫基
‑
n6
‑
异戊烯基腺嘌呤；n
‑
甲基鸟嘌呤；o
‑
烷基化碱基等；及它们中的2种以上。
[0175]
另外，嘌呤化合物及嘧啶化合物包括例如在美国专利第3,687,808号、“concise encyclopedia of polymer science and engineering”,第858～859页,kroschwitz j.i.编,john wiley&sons,1990、及englisch等人,angewandte chemie,国际版,1991,第30卷,p.613中公开的化合物。
[0176]
作为优选的亚酰胺单体(am
‑
1)，可例示下述化学式(am
‑1’
)表示的化合物中保护基r5为叔丁基二甲基甲硅烷基(tbdms)基团、双(2
‑
乙酰氧基)甲基(ace)基团、(三异丙基甲硅烷氧基)甲基(tom)基团、(2
‑
氰基乙氧基)乙基(cee)基团、(2
‑
氰基乙氧基)甲基(cem)基团、对甲苯磺酰基乙氧基甲基(tem)基团、(2
‑
氰基乙氧基)甲氧基甲基(emm)基团等的、tbdms亚酰胺(tbdms rna amidites，商品名，chemgenes corporation)、ace亚酰胺、tom亚酰胺、cee亚酰胺、cem亚酰胺、tem亚酰胺(chakhmakhcheva的综述：protective groups in the chemical synthesis of oligoribonucleotides,russian journal of bioorganic chemistry,2013,vol.39,no.1,pp.1
‑
21.)、emm亚酰胺(记载于国际公开第2013/027843号中)等。
[0177]
[化学式16]
[0178][0179]
[式中，r5表示羟基的保护基。r4表示被保护的核酸碱基。]
[0180]
本实施方式的固相担载体也可以用于将核苷、核苷酸以外的2价基团组入核酸序列中。例如，可以利用亚酰胺法将具有脯氨酸骨架的亚酰胺(后述的亚酰胺p等)组入核酸序列中(参照与国际公开第2012/017919号的实施例a4的方法同样的方法)。另外，也可以使用分别由下述的结构式(am
‑
11)、(am
‑
12)及(am
‑
13)表示的亚酰胺(参照国际公开第2013/103146号的实施例a1～a3)。
[0181]
[化学式17]
[0182][0183]
[式中，ipr表示异丙基。dmtr表示4,4
’‑
二甲氧基三苯甲基。tfa表示三氟乙酰基。]
[0184]
[rna的固相合成]
[0185]
对具有前述通式(2)表示的连接体的固相担载体(sp
‑
nu)进行脱保护(
‑
tr)，得到固相担载体(am
‑
2)。其后，使亚酰胺单体(am
‑
1)、与固相担载体(am
‑
2)进行缩合反应，得到反应产物(am
‑
3)。其后，对反应产物(am
‑
3)进行氧化，得到产物(am
‑
4)。其后，对产物(am
‑
4)进行脱保护(
‑
tr)，得到产物(am
‑
5)。接着，使亚酰胺单体(am
‑
1)与产物(am
‑
5)进一步进行缩合反应，从而使磷酸二酯键延伸。
[0186]
如上所述，针对延伸得到的寡核苷酸链末端的5’位的羟基，以成为所期望的序列的方式，将一系列的脱保护、缩合反应、氧化的循环仅重复必要次，其后，从固相担载体切
出，由此能够制造所期望的序列的核酸分子。
[0187]
更详细而言，可利用包括以下工序的制造方法来制造核酸。
[0188]
工序(a)：使用前述通式(2)中的r
b
表示作为反应性基团的羟基被保护的核苷或核苷酸的无机多孔质担载体，将前述的核苷的5’位的羟基的保护基脱保护的工序；
[0189]
工序(b)：使前述工序(a)中生成的核苷的5’位的羟基、与具有第2核苷碱基的亚酰胺化合物进行缩合反应，生成亚磷酸酯的缩合工序；
[0190]
工序(c)：使前述工序(b)中生成的亚磷酸酯氧化，生成核苷酸的氧化工序；
[0191]
工序(d)：将前述工序(c)中生成的核苷酸的5’位的羟基的保护基脱保护的工序。
[0192]
包括前述工序(a)～(d)的制造方法任选地包括以下工序。
[0193]
工序(b’)：使前述工序(d)中生成的产物、与具有接下来预定导入的核苷碱基的亚酰胺化合物进一步进行缩合反应，生成亚磷酸酯的工序；
[0194]
工序(c’)：使前述工序(b’)中生成的亚磷酸酯氧化，生成寡核苷酸的工序；
[0195]
工序(d’)：将前述工序(c’)中生成的寡核苷酸链末端的5’位的羟基的保护基脱保护的工序；
[0196]
工序(e)：将由前述的工序(b’)、工序(c’)及工序(d’)组成的一系列工序进一步重复m次(m表示1以上的整数。)，使m个亚酰胺化合物进行反应(核酸延伸反应)后，将延伸得到的核酸切出的工序。
[0197]
本实施方式中的核酸延伸反应可以按照通常的亚磷酰胺法的步骤来进行。
[0198]
本说明书中，“核酸延伸反应”是指下述反应：介由磷酸二酯键而使核苷酸依次键合，由此使核酸链、尤其是rna链延伸。核酸延伸反应也可以使用采用亚磷酰胺法的核酸自动合成装置等来进行。
[0199]
在脱保护的工序中，将固相担载体上所担载的rna链末端的5’位的羟基的保护基脱保护。作为通常的保护基，可使用三苯甲基系保护基(典型而言为dmtr基团)。脱保护可以使用酸来进行。作为用于脱保护的酸，可举出例如三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、三氟甲磺酸、甲磺酸、盐酸、乙酸、及对甲苯磺酸等、或它们中的2种以上。
[0200]
在缩合工序中，使核苷亚磷酰胺与通过前述脱保护的工序而进行了脱保护的rna链末端的5’位的羟基键合，生成亚磷酸酯。作为前述核苷亚磷酰胺，使用5’位的羟基被保护基(例如dmtr基团)保护的核苷亚磷酰胺。
[0201]
另外，缩合工序可以使用将前述核苷亚磷酰胺活化的活化剂来进行。作为活化剂，可举出例如5
‑
苄硫基
‑
1h
‑
四唑(btt)、1h
‑
四唑、4,5
‑
二氰基咪唑(dci)、5
‑
乙硫基
‑
1h
‑
四唑(ett)、n
‑
甲基苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(n
‑
mebit)、苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(bit)、n
‑
苯基咪唑鎓三氟甲磺酸盐(n
‑
phimt)、咪唑鎓三氟甲磺酸盐(imt)、5
‑
硝基苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(nbt)、1
‑
羟基苯并三唑(hobt)或5
‑
(双
‑
3,5
‑
三氟甲基苯基)
‑
1h
‑
四唑(activator
‑
42)等、或它们中的2种以上。
[0202]
在缩合工序之后，可以适当地对未反应的5’位的羟基进行封端。封端可以使用乙酸酐
‑
四氢呋喃溶液、苯氧基乙酸/n
‑
甲基咪唑溶液等、或它们中的2种以上的已知的封端溶液来进行。
[0203]
氧化工序是对通过前述缩合工序形成的亚磷酸酯进行氧化的工序。氧化工序可以使用氧化剂来进行。作为氧化剂，可举出碘、间氯过苯甲酸、叔丁基过氧化氢、过氧化
‑2‑
丁
酮、双(三甲基甲硅烷基)过氧化物、1,1
‑
二氢过氧化环十二烷、过氧化氢等、或它们中的2种以上。
[0204]
氧化工序可以在前述封端操作之后进行，反之，也可以在氧化工序之后进行封端操作，该顺序不受限定。
[0205]
在氧化工序之后，返回到脱保护工序，根据应合成的rna的核苷酸序列，重复上述的缩合反应、氧化、脱保护的工序，由此能够合成具有所期望的序列的rna。
[0206]
具有所期望的序列的rna链的合成结束之后，使用氨或胺类等，从固相担载体将rna链切断并进行回收。
[0207]
作为此处的胺类，可举出例如甲基胺、乙基胺、异丙基胺、乙二胺、二乙基胺、三乙基胺等、或它们中的2种以上。
[0208]
使用通用连接体的情况下，在rna链的合成结束之后，使用氨或胺类等，进行从固相担载体的切断，利用亲核试剂来进行通用连接体的除去。在除去结束之时，末端核苷酸的3’位成为羟基，磷酸酯与通用连接体键合而形成环状磷酸二酯。所回收的rna可以适当地利用已知的方法进行纯化。
[0209]
在以上说明的本实施方式中，无机多孔质体利用具有取代基(r1、r2)的氨基硅烷进行了修饰。通过该取代基(r1、r2)，使得本实施方式的无机多孔质担载体抑制了氨基硅烷对担载体的过密修饰，以氨基彼此适度地相隔的状态导入至担载体中。若氨基之间如此相隔，则在核酸延伸反应时，不易产生寡核酸彼此的空间位阻，延伸反应容易稳定地进行至目标链长。因此，通过使用本实施方式的无机多孔质担载体，在rna的制造中可进一步提高收率。另外，根据本实施方式的rna的制造方法，在rna的制造中可进一步提高收率，尤其能够以更高的收率稳定地得到长链rna。
[0210]
此外，通过将本实施方式的无机多孔质担载体应用于核酸合成，从而即使在合成尤其是40mer以上的长链rna的情况下，也能够收率良好地得到高纯度的rna。
[0211]
本说明书中，“rna的收率”是指相对于根据供于反应的核苷的量在理论上计算的rna的量而言的、实际分离出的rna的比例(％)。由uv的吸光度的测定来算出核酸量。作为所述测定的方法，具体而言，使核酸溶解于水或缓冲水溶液中，装入光程为1cm的比色皿中。使用uv吸光度计，由波长为260nm处的吸光度，利用下式计算光密度c，算出核酸量。系数使用40μg/ml。
[0212]
c＝α
·
l
·
a
260
[0213]
(a
260
：吸光度，α：系数，l：光程，c：光密度)
[0214]“rna的纯度”是指所得到的目标链长的核酸的比例(％)。可利用基于液相色谱法的色谱图中的面积百分值(即，面积百分率)、或主峰的10％宽度来求出。
[0215]
实施例
[0216]
以下，利用实施例来更详细地说明本发明，但本发明不限定于这些例子。
[0217]
＜无机多孔质体的制作＞
[0218]
作为无机多孔质体，使用下述的sp(1)～sp(7)。对于无机多孔质体sp(1)～sp(7)，各自求出细孔径(众数直径；μm)、粒径(中值粒径；μm)、单位体积的比表面积(m2/ml)、气孔率(％)。将其结果示于表1、2。
[0219]
细孔径(众数直径；μm)及气孔率(％)利用压汞法来求出。对于粒径(μm)而言，通过
激光衍射(散射式)来测定中值粒径。单位体积的比表面积(m2/ml)利用通过压汞法得到的体积密度(g/ml)与通过n2吸附脱附等温线测定而得到的、单位质量的比表面积(m2/g)之积来求出。
[0220]
无机多孔质体sp(1)：
[0221]
利用与日本专利第5875843号公报中记载的实施例1同样的方法，得到沸石成型体。使得到的沸石成型体在乙腈溶剂中悬浮，从而制备悬浮液。接着，利用网眼为125μm及38μm的jis筛依次对前述悬浮液进行筛分。其后，于室温使残存于网眼为38μm的筛上的粉末固体风干，制作成为白色粉末状固体的无机多孔质体sp(1)。
[0222]
无机多孔质体sp(2)：
[0223]
作为无机多孔质体sp(2)，使用市售的球状硅胶粉末(商品名：m.s.gel，agc si
‑
tech株式会社制)。
[0224]
无机多孔质体sp(3)：
[0225]
利用与日本专利第5875843号公报中记载的实施例1同样的方法，得到沸石烧成物。接着，将得到的烧成物10g装入平皿中，静置于装有100ml水的2升的可分离式烧瓶中，盖上盖子后，将可分离式烧瓶装入80℃的恒温槽中，放置24小时。将可分离式烧瓶取出后，放置冷却至20℃。将该固体8g装入高压釜中，向其中加入7.5质量％硝酸铵水溶液88g与25质量％氨水溶液134g的混合液222g，于90℃搅拌1小时后，通过过滤而分离固体。针对该固体，将利用与前文同样的硝酸铵水溶液与氨水溶液的混合液进行的处理进一步重复9次，然后进行水洗、干燥，得到无机多孔质体sp(3)。
[0226]
无机多孔质体sp(4)：
[0227]
在容量为1.5l的不锈钢制高压釜中装入原硅酸四乙酯[si(oc2h5)4]115g、40质量％四正丙基氢氧化铵水溶液57g、氢氧化钾(纯度为85％)0.9g及水325g，于室温快速搅拌120分钟。相对于得到的混合液中的硅而言，水、四正丙基铵离子、氢氧根离子及钾离子的摩尔比分别为36、0.20、0.24及0.048。于105℃将该混合液以300rpm的转速搅拌48小时，进行水热合成反应。对得到的反应混合物进行过滤，反复用纯水进行清洗直至滤液的ph变为9.0以下。于110℃使得到的湿滤饼干燥后，在研钵中粉碎。利用网眼为2.36mm及网眼为1.00mm的筛依次对得到的粉碎品进行筛选。使用管状炉，将其于530℃在氮流通下烧成1小时，接着，进一步于530℃在氮与空气的混合气体〔氮：空气(体积比)＝9：1〕流通下烧成1小时，由此得到白色的烧成物。
[0228]
接着，将上文中得到的烧成物10g装入平皿中，静置于装有100ml水的2升的可分离式烧瓶中，盖上盖子后，将可分离式烧瓶装入80℃的恒温槽中，放置34小时。将可分离式烧瓶取出后，放置冷却至20℃。将该固体4g装入高压釜中，向其中加入7.5质量％硝酸铵水溶液110g与25质量％氨水溶液168g的混合液278g，于90℃搅拌1小时后，通过过滤而分离固体。针对该固体，将利用与前文同样的硝酸铵水溶液与氨水溶液的混合液进行的处理进一步重复3次，然后进行水洗、干燥。最后，将得到的白色固体在研钵中粉碎，利用网眼为106μm及网眼为38μm的筛依次进行筛选，得到无机多孔质体sp(4)。
[0229]
无机多孔质体sp(5)：
[0230]
在容量为1.5l的不锈钢制高压釜中装入原硅酸四乙酯[si(oc2h5)4]155g、40质量％四正丙基氢氧化铵水溶液136g、氢氧化钾(纯度为85％)0.3g及水162g，于室温快速搅
拌120分钟。相对于得到的混合液中的硅而言，水、四正丙基铵离子、氢氧根离子及钾离子的摩尔比分别为18、0.36、0.38及0.048。于105℃将该混合液以300rpm的转速搅拌48小时，进行水热合成反应。对得到的反应混合物进行过滤，反复用纯水进行清洗直至滤液的ph变为9.0以下。于110℃使得到的湿滤饼干燥后，在研钵中粉碎。利用网眼为2.36mm及网眼为1.00mm的筛依次对得到的粉碎品进行筛选。使用管状炉，将其于530℃在氮流通下烧成1小时，接着，进一步于530℃在氮与空气的混合气体〔氮：空气(体积比)＝9：1〕流通下烧成1小时，由此得到白色的烧成物。
[0231]
接着，将上文中得到的烧成物10g装入平皿中，静置于装有100ml水的2升的可分离式烧瓶中，盖上盖子后，将可分离式烧瓶装入80℃的恒温槽中，放置5小时。将可分离式烧瓶取出后，放置冷却至20℃。将该固体8g装入高压釜中，向其中加入7.5质量％硝酸铵水溶液88g与25质量％氨水溶液134g的混合液222g，于90℃搅拌1小时后，通过过滤而分离固体。针对该固体，将利用与前文同样的硝酸铵水溶液与氨水溶液的混合液进行的处理进一步重复2次，然后进行水洗、干燥。最后，将得到的白色固体在研钵中粉碎，利用网眼为106μm及网眼为38μm的筛依次进行筛选，得到无机多孔质体sp(5)。
[0232]
无机多孔质体sp(6)：
[0233]
在容量为1600l的不锈钢制高压釜中装入原硅酸四乙酯[si(oc2h5)4]186kg、40质量％四正丙基氢氧化铵水溶液166kg、氢氧化钾(纯度为85％)0.3kg及水490kg，于室温搅拌120分钟。相对于得到的混合液中的硅而言，水、四正丙基铵离子、氢氧根离子及钾离子的摩尔比分别为37、0.36、0.39及0.049。于105℃将该混合液以60rpm的转速搅拌12小时，进行水热合成反应。与无机多孔质体sp(5)同样地用纯水对得到的反应混合物进行清洗。清洗后，回收包含晶体的浆料。利用雾化器式喷雾干燥器对该浆料进行喷雾干燥，成型为粒子状。将其于550℃在氮流通下烧成2.5小时，接着，进一步于550℃在氮与空气的混合气体〔氮：空气(体积比)＝3：1〕流通下烧成2.5小时，由此得到白色的烧成物。
[0234]
接着，将上文中得到的烧成物50g装入平皿中，静置于装有100ml水的可分离式烧瓶中，盖上盖子后，将可分离式烧瓶装入80℃的恒温槽中，放置4小时。将该固体5.00g装入高压釜中，向其中加入7.5质量％硝酸铵水溶液176g与25质量％氨水溶液268g的混合液444g，于86℃搅拌1小时后，通过过滤而分离固体。针对该固体，将利用与前文同样的硝酸铵水溶液与氨水溶液的混合液进行的处理进一步重复4次，然后进行水洗、干燥，得到无机多孔质体sp(6)。
[0235]
无机多孔质体sp(7)：
[0236]
作为无机多孔质体sp(7)，使用市售的多孔质玻璃(商品名：cpg
‑
1000，geneact,inc.制)。
[0237]
＜硅烷偶联剂的合成＞
[0238]
作为硅烷偶联剂，使用下述的(c1)成分、(c2)成分、(c3)成分、(c4)成分、(c5)成分、(c6)成分、及(c7)成分。
[0239]
(c1)成分：
[0240]
购入市售的3
‑
氨基丙基二异丙基乙氧基硅烷来使用。
[0241]
(c2)成分：
[0242]
于室温将三氯硅烷(5ml，50mmol)、6
‑
氯
‑1‑
己烯(3.80g，32mmol)及六氯铂(iv)酸
六水合物的异丙醇溶液(1m，5μl，5μmol)搅拌18.5小时。在得到的混合液中加入thf(50ml)，在冰冷却条件下缓慢地滴加异丙基氯化镁的thf溶液(1m，150ml，150mmol)，于室温搅拌73.5小时。在冰冷却条件下将得到的反应液滴加至异丙醇(40ml)、三乙基胺(80ml)及thf(120ml)的混合液中，于室温搅拌1.5小时后，滤除不溶物。在减压下将溶剂蒸馏除去，在得到的残余物中加入己烷(30ml)，滤除不溶物后，在减压下将滤液浓缩，得到6
‑
氯己基异丙氧基二异丙基硅烷4.37g(收率为47％)。
[0243]
在封闭式溶解坩埚中，在得到的6
‑
氯己基异丙氧基二异丙基硅烷(1.46g，5mmol)中加入氨的甲醇溶液(7n，21.4ml，150mmol)，于142℃搅拌3小时。使得到的混合物流入至thf(200ml)中，进行过滤后，在减压下将滤液的溶剂蒸馏除去。在得到的残余物中加入庚烷(20ml)，滤除不溶物后，在减压下将溶剂蒸馏除去，得到6
‑
氨基己基异丙氧基二异丙基硅烷1.83g。
[0244]
对得到的化合物进行nmr测定，由以下的测定结果鉴定其结构。
[0245]1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ:10.90
‑
1.11(18h,m),1.13
‑
1.45(10h,m),2.92
‑
2.96(2h,m),4.00
‑
4.04(1h,m)
[0246]
(c3)成分：
[0247]
在四氢呋喃(thf)(20ml)中加入3
‑
氯丙基三甲氧基硅烷(3.97g，20mmol)，冷却至5℃，缓慢地滴加苯基溴化镁的thf溶液(1m，60ml，60mmol)。
[0248]
其后，于室温搅拌15.5小时。在反应溶液中加入乙醇4.36ml，于室温搅拌1小时。在减压下将溶剂蒸馏除去，将得到的残余物供于硅胶柱色谱(展开溶剂：己烷)，得到3
‑
氯丙基二苯基甲氧基硅烷3.61g(收率为62％)。
[0249]
在封闭式溶解坩埚中，在得到的3
‑
氯丙基二苯基甲氧基硅烷(0.7g，2.4mmol)中加入甲醇(2ml)和氨的甲醇溶液(7n，10ml，72mmol)，于142℃搅拌3小时。
[0250]
使得到的混合物流入至thf(100ml)中，进行过滤后，在减压下将滤液的溶剂蒸馏除去。在得到的残余物中加入庚烷(10ml)和甲醇(10ml)，在减压下将甲醇层的溶剂蒸馏除去，得到3
‑
氨基丙基二苯基甲氧基硅烷0.4g(收率为61％)。
[0251]
对得到的化合物进行nmr测定，由以下的测定结果鉴定其结构。
[0252]1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ:1.20(2h,dd),1.78(2h,m),2.94(2h,m),3.44(3h,s),7.24
‑
7.58(10h,m)
[0253]
(c4)成分：
[0254]
在正己烷(20ml)中加入三氯硅烷(2ml，20mmol)进行搅拌后，缓慢地滴加正丁基锂的己烷溶液(1.6m，27.5ml，44mmol)，于室温搅拌1.5小时。加入乙醇(5ml)和三乙基胺(5ml)，滤除不溶物，在减压下将溶剂蒸馏除去。将得到的残余物供于使用kugelrohr的蒸馏(～70℃，7mmhg)，得到二丁基乙氧基硅烷0.53g(收率为54％)。
[0255]
于100℃将得到的二丁基乙氧基硅烷(0.49g，2.6mmol)、烯丙基胺(0.15g，2.6mmol)及六氯铂(iv)酸六水合物的异丙醇溶液(1m，1.3μl，1.3μmol)搅拌1小时。补加烯丙基胺(0.15g，2.6mmol)和六氯铂(iv)酸六水合物的异丙醇溶液(1m，5μl，5μmol)，进一步搅拌2小时。将得到的混合物供于使用kugelrohr的蒸馏(～120℃，5mmhg)，得到3
‑
氨基丙基二丁基乙氧基硅烷0.26g(收率为41％)。
[0256]
(c5)成分：
[0257]
使用3
‑
氨基丙基二甲基乙氧基硅烷(aldrich，cas rn：18306
‑
79
‑
1产品编号：588857)。
[0258]
(c6)成分：
[0259]
使用3
‑
氨基丙基三乙氧基硅烷(tci，cas rn：919
‑
30
‑
2产品编号：a0439)。
[0260]
(c7)成分：
[0261]
在氯二异丙基硅烷(5.0ml，37.5mmol)及烯丙基溴(1.6ml，18.8mmol)的甲苯溶液(26ml)中加入六氯铂(iv)酸六水合物的异丙醇溶液(1m，9.7μl，9.7μmol)，于140℃搅拌3小时。将反应液冷却，流入乙醇及三乙基胺，进一步进行搅拌。对得到的沉淀进行过滤，对滤液进行浓缩，得到3
‑
溴丙基二异丙基乙氧基硅烷的混合物。其后，加入1,6
‑
二氨基己烷(0.58g，5.0mmol)，于100℃进行2小时反应。对得到的混合物进行过滤，在减压下进行蒸馏除去后，用硅胶柱进行纯化(氯仿/乙醇＝80/20)，得到[3
‑
(6
‑
氨基己基氨基)丙基]二异丙基乙氧基硅烷(0.36g，22％)。
[0262]
＜对连接体进行担载的无机多孔质体(无机多孔质担载体)的制造方法＞
[0263]
各例的无机多孔质担载体通过利用硅烷偶联剂(c1)～(c7)成分中的任一者对无机多孔质体sp(1)～sp(7)中的任一者进行表面处理而得到。
[0264]
(实施例1)
[0265]
将无机多孔质体sp(1)2.00g装入四颈瓶中，加入甲苯100ml。在搅拌下，进一步加入(c1)成分4.8mg，于室温搅拌3小时。其后，对反应液进行过滤，用甲苯进行清洗后，在减压下进行干燥，得到实施例1的无机多孔质担载体。
[0266]
(实施例2)
[0267]
将(c1)成分变更为(c2)成分(添加量：27.2mg)，除此以外，与实施例1的制造方法同样地操作，得到实施例2的无机多孔质担载体。
[0268]
(实施例3)
[0269]
将(c1)成分变更为(c3)成分(添加量：14.2mg)，除此以外，与实施例1的制造方法同样地操作，得到实施例3的无机多孔质担载体。
[0270]
(实施例4)
[0271]
将(c1)成分变更为(c4)成分(添加量：8.3mg)，除此以外，与实施例1的制造方法同样地操作，得到实施例4的无机多孔质担载体。
[0272]
(实施例5)
[0273]
将无机多孔质体sp(1)变更为无机多孔质体sp(2)(1.00g)，并且，将(c1)成分的添加量变更为2.4mg，除此以外，与实施例1的制造方法同样地操作，得到实施例5的无机多孔质担载体。
[0274]
(实施例6)
[0275]
将无机多孔质体sp(1)变更为无机多孔质体sp(3)(2.00g)，并且，将(c1)成分的添加量变更为6.8mg，除此以外，与实施例1的制造方法同样地操作，得到实施例6的无机多孔质担载体。
[0276]
(实施例7)
[0277]
将无机多孔质体sp(1)变更为无机多孔质体sp(4)(0.40g)，并且，将(c1)成分的添加量变更为1.2mg，除此以外，与实施例1的制造方法同样地操作，得到实施例7的无机多孔
质担载体。
[0278]
(实施例8)
[0279]
将无机多孔质体sp(1)变更为无机多孔质体sp(5)(2.00g)，并且，将(c1)成分的添加量变更为9.5mg，除此以外，与实施例1的制造方法同样地操作，得到实施例8的无机多孔质担载体。
[0280]
(实施例9)
[0281]
将无机多孔质体sp(1)变更为无机多孔质体sp(6)(0.35g)，并且，将(c1)成分的添加量变更为3.0mg，除此以外，与实施例1的制造方法同样地操作，得到实施例9的无机多孔质担载体。
[0282]
(实施例10)
[0283]
将针对无机多孔质体sp(1)(1.00g)添加的硅烷偶联剂由(c1)成分变更为(c7)成分(添加量：7.1mg)，除此以外，与实施例1的制造方法同样地操作，得到实施例10的无机多孔质担载体。
[0284]
(实施例11)
[0285]
在玻璃小瓶中将(c1)成分(55mg)与甲苯(72.32g)混合，制备(c1)成分/甲苯溶液。将无机多孔质体sp(7)(7.00g)装入圆底烧瓶中，在室温下向其中加入所制备的(c1)成分/甲苯溶液(34.23g)。将前述圆底烧瓶导入100℃的油浴中，进行5小时反应。其后，对反应混合物进行过滤，用甲苯对固态成分进行清洗后，在减压下进行干燥，得到实施例11的无机多孔质担载体。
[0286]
(比较例1)
[0287]
将(c1)成分变更为(c5)成分(添加量：3.8mg)，除此以外，与实施例1的制造方法同样地操作，得到比较例1的无机多孔质担载体。
[0288]
(比较例2)
[0289]
将(c1)成分变更为(c6)成分(添加量：4.9mg)，除此以外，与实施例1的制造方法同样地操作，得到比较例2的无机多孔质担载体。
[0290]
(比较例3)
[0291]
将无机多孔质体sp(1)变更为无机多孔质体sp(2)(1.00g)，并且，将(c1)成分变更为(c6)成分(添加量：2.4mg)，除此以外，与实施例1的制造方法同样地操作，得到比较例3的无机多孔质担载体。
[0292]
(比较例4)
[0293]
将无机多孔质体sp(1)变更为无机多孔质体sp(3)(0.50g)，并且，将(c1)成分变更为(c6)成分(添加量：2.7mg)，除此以外，与实施例1的制造方法同样地操作，得到比较例4的无机多孔质担载体。
[0294]
(比较例5)
[0295]
在玻璃小瓶中将(c6)成分(54mg)与甲苯(72.32g)混合，制备(c6)成分/甲苯溶液。将无机多孔质体sp(7)(7.00g)装入圆底烧瓶中，在室温下向其中加入所制备的(c6)成分/甲苯溶液(34.23g)。将前述圆底烧瓶导入100℃的油浴中，进行5小时反应。其后，对反应混合物进行过滤，用甲苯对固态成分进行清洗后，在减压下进行干燥，得到比较例5的无机多孔质担载体。
[0296]
＜固相担载体的制造＞
[0297]
(实施例1～10及比较例1～4)
[0298]
将u
‑
succinate(5
’‑
o
‑
二甲氧基三苯甲基
‑2’‑
o
‑
叔丁基二甲基甲硅烷基
‑3’‑
o
‑
琥珀酰基尿苷)25.1mg、1
‑
[双(二甲基氨基)亚甲基]
‑
1h
‑
1,2,3
‑
苯并三唑鎓3
‑
氧化物六氟磷酸盐(hbtu)12.5mg、n,n
‑
二异丙基乙基胺5.9μl、和乙腈2.7ml混合，在该混合物中分别加入实施例1～10及比较例1～4中任一者的无机多孔质担载体300.0mg。
[0299]
于25℃静置18小时后，进行过滤，用乙腈10ml对固体(残余物)进行清洗。在清洗后的固体中加入乙酸酐、2,6
‑
二甲基吡啶的thf溶液(乙酸酐/2,6
‑
二甲基吡啶/thf，容量比为1/1/8)1ml、和n
‑
甲基咪唑的thf溶液(n
‑
甲基咪唑/thf，容量比为16/84)1ml。在静置1分钟后进行过滤，用乙腈10ml对固体进行清洗。对清洗后的固体进行真空干燥，得到在无机多孔质担载体上担载有核苷的固相担载体。
[0300]
(实施例11及比较例5)
[0301]
在玻璃小瓶中将u
‑
succinate(5
’‑
o
‑
二甲氧基三苯甲基
‑2’‑
o
‑
叔丁基二甲基甲硅烷基
‑3’‑
o
‑
琥珀酰基尿苷)211mg、1
‑
[双(二甲基氨基)亚甲基]
‑
1h
‑
1,2,3
‑
苯并三唑鎓3
‑
氧化物六氟磷酸盐(hbtu)105mg、n,n
‑
二异丙基乙基胺121μl、和乙腈11ml混合。将所制备的混合溶液1.63ml、分别与实施例11及比较例5中任一者的无机多孔质担载体300.0mg混合。于25℃静置18小时后，进行过滤，用乙腈10ml对固体(残余物)进行清洗。在清洗后的固体中加入乙酸酐、2,6
‑
二甲基吡啶的thf溶液(乙酸酐/2,6
‑
二甲基吡啶/thf，容量比为1/1/8)1ml、和n
‑
甲基咪唑的thf溶液(n
‑
甲基咪唑/thf，容量比为16/84)1ml。在静置1分钟后进行过滤，用乙腈10ml对固态成分进行清洗。对清洗后的固态成分进行真空干燥，得到在无机多孔质担载体上担载有核苷的固相担载体。
[0302]
(核苷担载密度的测定)
[0303]
将70％高氯酸溶液用甲醇稀释，制备30％高氯酸/甲醇溶液。采集上文中制造的实施例1～11及比较例1～5的担载有核苷的各固相担载体10mg至容量瓶中，用30％高氯酸/甲醇溶液稀释至10ml。将该溶液用30％高氯酸/甲醇溶液进一步稀释10倍后，测定498nm处的吸光度，由下式算出核苷担载密度。将其结果示于表1、2。
[0304]
[数学式1]
[0305][0306]
＜寡核酸的固相合成＞
[0307]
序列(a)：5
’‑
gcagaguacacacagcauauacc
‑
p
‑
gguauaugcuguguguacucugcuu
‑3’
(序列号1、2)(49mer)。gcagaguacacacagcauauacc(序列号1)及gguauaugcuguguguacucugcuu(序列号2)。
[0308]
序列(b)：5
’‑
auaacucaauuuguaaaaaaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuuu
‑3’
(序列号3)(103mer)
[0309]
前述的序列(a)中，p表示下述的由波浪线划分的键合部位。
[0310]
[化学式18]
[0311][0312]
基于亚磷酰胺法，使用核酸合成机(商品名nts m
‑4‑
mx
‑
e，日本techno service株式会社制)，以从3’侧向5’侧的方式合成由前述的序列(a)或序列(b)形成的寡核苷酸(参照反应路径(上述缩合反应、氧化、脱保护))。
[0313]
在上述固相合成中，使用上文中制造的各固相担载体。
[0314]
另外，作为亚酰胺单体，使用以下所示的腺苷emm亚酰胺(记载于美国专利申请公开第2012/035246号说明书的实施例4中)、胞苷emm亚酰胺(记载于上述us文献的实施例3中)、鸟苷emm亚酰胺(记载于上述us文献的实施例5中)、尿苷emm亚酰胺(记载于上述us文献的实施例2中)、及亚酰胺p(记载于国际公开第2017/188042号中)。
[0315]
[化学式19]
[0316]
[0317]
另外，在上述固相合成中，使用高纯度三氯乙酸甲苯溶液作为解封闭(deblocking)溶液，使用5
‑
苄巯基
‑
1h
‑
四唑作为缩合剂，使用碘溶液作为氧化剂，使用苯氧基乙酸溶液和n
‑
甲基咪唑溶液作为封端溶液。
[0318]
将合成结束后的固相担载体装入带盖的玻璃小瓶中，加入28％nh4oh与etoh的1：1或2：1溶液。其后，于40℃下静置4小时。对反应后的溶液进行过滤，用水、etoh依次进行清洗。对得到的溶液进行干燥，制成作为未脱保护体的粗寡核苷酸，接着，在硝基甲烷的存在下使四正丁基氟化铵(tbaf)进行作用从而进行脱保护，得到粗产物。
[0319]
[寡核酸的收率的测定]
[0320]
针对使用得到的粗寡核苷酸制备的溶液，利用uv吸光度计来测定波长为260nm处的吸光度od
260
，算出收获量，求出基于各固相担载体的寡核酸合成的收率(％)。将其结果示于表1。
[0321]
[表1]
[0322][0323]
由表1所示的结果可以确认，与使用比较例1～2的固相担载体的情况相比，使用实施例1～4及实施例10的固相担载体的情况下的寡核酸的收率更高。
[0324]
可以确认，与使用比较例3的固相担载体的情况相比，使用实施例5的固相担载体的情况下的寡核酸的收率更高。
[0325]
可以确认，与使用比较例4的固相担载体的情况相比，使用实施例6的固相担载体的情况下的寡核酸的收率更高。
[0326]
可以确认，与使用比较例5的固相担载体的情况相比，使用实施例11的固相担载体的情况下的寡核酸的收率更高。
[0327]
[寡核酸的纯度的测定]
[0328]
针对使用得到的粗寡核苷酸制备的溶液(实施例6、7及比较例4)，利用高效液相色谱hplc(波长260nm，色谱柱dnapac
tm pa1004
×
250mm)分离为各成分，求出所得到的色谱图的、主产物的lc峰顶点高度的10％高度处的峰宽度，作为“10％宽度”。将其结果示于表2。
[0329]
此处，寡核酸的纯度高的情况下，“10％宽度”成为小的数值，纯度低的情况下，“10％宽度”成为大的数值。
[0330]
[表2]
[0331]
由表2所示的结果可以确认，与使用比较例4的固相担载体的情况相比，使用实施例6～7的固相担载体的情况下的寡核酸的纯度更高。
[0332]
根据以上的结果，可以说如果使用本发明的固相担载体，则在寡核酸的制造中可
进一步提高收率及纯度。
[0333]
产业上的可利用性
[0334]
通过本发明，可提供在长链核酸的合成中也能够提高收率及纯度的核酸的制造方法。通过采用本发明涉及的无机多孔质担载体的制造方法得到的核酸作为医药品的原料是有用的。
[0335]
序列表自由文本
[0336]
序列表的序列号1～3表示按照本发明的制造方法制造的寡核苷酸的碱基序列。