一株具有降胆固醇功能的植物乳杆菌的应用的制作方法

1.本发明属于益生菌功能领域，具体涉及一株具有降胆固醇功能的植物乳杆菌的应用。


背景技术：

2.体内胆固醇含量过高会影响人体正常生活，引发心血管疾病，造成健康隐患。高含量的血清胆固醇更易引发心脑血管病。血清胆固醇含量每增加1％，心脑血管疾病发病率增加3％。人体中的胆固醇除少量自身合成外，大部分来自于食物。1989年美国饮食与健康研究委员会提出要限制食物中的胆固醇。但是随着人们生活水平提高，人们往往追求高营养的饮食，导致膳食不合理，饮食摄入胆固醇过多，导致心血管疾病发病率也逐年攀升。因此，研究如何降低饮食中的胆固醇含量以及开发降低胆固醇食品势在必行。
3.高血脂、高血压会造成机体多个器官损伤，引发心血管疾病，现如今心血管疾病发病率逐年攀升，降血脂、降血压成为近些年的研究热点。乳酸菌作为食品安全微生物，经研究发现有降胆固醇的能力，利用乳酸菌降胆固醇可以避免因药物治疗引发的一些副作用，并且可以治疗由降胆固醇药物引起的肠道菌群失调，在临床应用上有一定的优势，同时，乳酸菌还具有多种益生功能，有益于人类机体健康。


技术实现要素：

4.为了缓解胆固醇摄入过多引起的血脂过高，进而引发各种心血管疾病，对人类健康造成一定的威胁。本发明提供了一株具有降胆固醇功能的植物乳杆菌在制备降血脂的保健品或药品中的应用，所述植物乳杆菌为lactobacillus plantarum j26。
5.在本发明的一种实施方式中，是将所述植物乳杆菌活化后获得菌液，离心后收集菌泥，生理盐水洗涤2～3次，调整菌落数获得菌悬液。
6.进一步地限定，所述活化选用的培养基为mrs培养基、lb培养基和nb培养基中的任意一种。
7.进一步地限定，所述菌悬液的浓度为108cfu/ml～109cfu/ml。
8.本发明的有益效果：
9.本发明通过体外实验和动物实验评价了植物乳杆菌j26的降胆固醇能力，证明其在体外具有良好的降胆固醇能力，在体内能降低高脂小鼠血清中的胆固醇、甘油三酯的含量，并且能降低小鼠的肝重比。此外，植物乳杆菌j26还对多种抗生素具有抗性，无抗生素转移风险，具有不产生tyramine、cadaverine、putrescine、histamin等有害物质的优点，可用于制备降血脂的保健品或药品。
附图说明：
10.图1为胆固醇标准曲线图；
11.图2为植物乳杆菌j26与实验室保存的另外24株乳杆菌的胆固醇脱除率比较结果；
12.图3为植物乳杆菌j26质粒提取电泳图；其中，m为mark，1
‑
3均为植物乳杆菌j26；
13.图4为硝基还原酶活性检测结果图；
14.图5为氨基酸脱羧酶活性检测结果图；
15.图6为溶血试验结果图；
16.图7为靛基质试验结果图。
具体实施方式
17.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
18.以下实施例中所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
19.植物乳杆菌j26记载在yichao h,xuesong li,xinyu liu,yashuo zhang,weizhang,chaoxin man,yujun jiang.2019.transcriptomic responses of caco
‑
2 cellsto lactobacillus rhamnosus gg and lactobacillus plantarum j26 againstoxidative stress.journal of dairy science.公众可通过东北农业大学获得。
20.实施例1：植物乳杆菌j26的降胆固醇功能
21.植物乳杆菌j26降胆固醇功效的测定步骤如下：
22.(1)取植物乳杆菌j26和实验室保藏的其他24株乳杆菌，以及实验室保藏的e.coli atcc 25922、s.aureus atcc 25923和salmonella atcc 14028，分别将其接种至mrs培养基、lb培养基和nb培养基，生长到对数期后，分离单菌落，传代培养两代后为工作液，工作液与甘油混匀保种，
‑
80℃保存。
23.(2)胆固醇标准曲线绘制
24.分别取胆固醇储备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml于干净试管中，氮吹后先后加入邻苯二甲醛和浓硫酸，混匀，静置后，测定550nm处吸光值，绘制标准曲线，获得的标注曲线如图1所示，线性回归方程为：y＝0.0074x 0.0044，相关系数r2＝0.9951，说明线性关系较好，标准曲线可用于胆固醇浓度测定。
25.(3)根据标准曲线得出胆固醇浓度，并根据以下公式计算包括植物乳杆菌j26在内的25株乳杆菌的胆固醇脱除率。
[0026][0027]
式中：c1—菌株接至mrs
‑
chol
‑
thio培养24h后上清液中胆固醇的质量浓度
[0028]
c0—初始培养基中胆固醇的质量浓度
[0029]
本实验以包括植物乳杆菌j26在内的25株分离自西藏地区传统乳制品及实验室保藏的乳酸菌为研究对象，包括8个菌种。利用邻苯二甲醛法测定菌株对胆固醇的脱除率，结果如图2所示，25株乳酸菌均有一定的降胆固醇能力，但对胆固醇的脱除率各不相同。脱除率越大说明菌株体外降胆固醇能力越强。选取胆固醇脱除率最高的l.plantarum j26作为后续实验研究对象。
[0030]
(4)将植物乳杆菌j26活化两代后的菌液离心收集菌泥，生理盐水洗涤三次，分别调整菌落总数为108cfu/ml和109cfu/ml，作为菌悬液用以灌胃备用。
[0031]
(5)使用步骤(4)获得的新鲜菌悬液每日灌胃用于降胆固醇体内实验。
[0032]
实验动物选用40只昆明系小白鼠，雌雄各半，鼠龄4周左右，体重20
±
2g，将40只小白鼠分成四组，每组10只，具体分组及饲喂方式如表1所示。小鼠购买后，实验第一周，适应环境，四组均自由采食基础饲料。实验第二周，除对照组外另外三组饲喂高脂饲料，建立高脂模型。从实验第三周起，四组小鼠均每日灌胃，连续灌胃28天，灌胃剂量按照体重每日1ml/100g。
[0033]
表1体内实验的实验分组及饲喂方式
[0034][0035]
(6)在灌胃第28天，对步骤(5)中的四组小鼠分别进行称重，眼球取血，之后断颈处死，解剖取出肝脏，取空肠，洗涤干净后，液氮速冻，
‑
80℃保存备用。
[0036]
(7)将步骤(6)中的采集得到的血液进行离心后取血清于干净离心管中，测定血清总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl
‑
c)，并利用公式计算动脉粥样硬化指数(ai)，公式如下：
[0037][0038]
各组小鼠血脂变化情况如表2所示。
[0039]
表2不同组小鼠血脂(mmol/l)变化情况
[0040][0041]
注：a,b,c,d代表同一时间内不同组内的差异性(p<0.05)。
[0042]
(8)对经灌胃28天后的各组小鼠进行进行肝重比的计算，肝重比＝肝脏重量/体重，不同组小鼠肝重比变化情况如表3所示。
[0043]
表3不同组小鼠肝重比(mg/g)变化情况
[0044][0045]
注：a,b,c,d代表同一时间内不同组内的差异性(p<0.05)。
[0046]
植物乳杆菌j26的安全性评价
[0047]
(1)抗生素敏感性分析
[0048]
①
最小抑制浓度(mic)测定
[0049]
选用氯霉素、庆大霉素、万古毒素、红霉素、氨苄青霉素和四环素六种临床常用抗
生素对菌株进行敏感性分析，分别配制含有以下浓度不同抗生素的mrs培养基：0、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024μg/ml。将活化两代后的l.plantarum j26以2％接种量接种至上述含有抗生素的培养基中，37℃培养24h后观察结果，确定最小抑制浓度，以欧洲食品安全局(efsa)制定的细菌对抗生素抗性的规定为标准进行比较评定。植物乳杆菌j26针对不同抗生素的mic值如表4所示。
[0050]
表4植物乳杆菌j26针对不同抗生素的mic值结果(μg/ml)
[0051][0052]
将测定结果与微生物截止值比较可知，l.plantarum j26对氨苄青霉素未表现出抗性，即敏感，对其他5种抗生素表现出抗性。
[0053]
②
l.plantarum j26质粒提取检测
[0054]
提取l.plantarum j26菌株质粒，将提取的质粒溶液在琼脂糖凝胶中进行电泳，150v，20min，检测其有无质粒条带，质粒提取电泳图如图3所示，由图3可知，通过对l.plantarum j26进行质粒检测，未出现条带，可以由此推测l.plantarum j26不含有耐药质粒，或是耐药基因存在于细菌dna上，这两种情况都不会出现抗性转移，初步判定l.plantarum j26无抗性转移风险。
[0055]
(2)硝基还原酶活性分析
[0056]
将活化两代后的l.plantarum j26接种至硝基还原酶检测培养基中，37℃培养24h后，依次加入3
‑
5滴α
‑
萘胺溶液和对氨基苯磺酸溶液，观察颜色改变。若培养基变为红色，即为阳性；反之，则为阴性。以e.coli atcc 25922作为阳性对照菌株。检测结果如图4所示，接种阳性对照菌株e.coli atcc 25922的硝基还原酶培养基呈红色，为阳性；而接种l.plantarum j26的培养基未发生颜色变化。由此说明，l.plantarum j26不能产生硝基还原酶。
[0057]
(3)氨基酸脱酸酶活性分析
[0058]
对l.plantarum j26在生长过程中是否产生酪胺(tyramine)、组胺(cadaverine)、尸胺(putrescine)和腐胺(histamine)四种生物胺进行检测。将活化两代后的l.plantarum j26以2％接种量分别接种于四种氨基酸脱羧酶检测培养基中，37℃培养72h后，观察颜色改变。若培养基变为紫色，即为阳性；反之，则为阴性。以salmonella atcc 14028作为阳性对照菌株。检测结果如图5所示，接种阳性对照菌株salmonella atcc 14028的尸胺、腐胺检测培养基颜色呈现紫色，为阳性结果；而接种l.plantarum j26的tyramine、cadaverine、putrescine、histamine检测培养基颜色均呈现黄色，为阴性结果。由此说明，l.plantarum j26在生长过程中并不会产生tyramine、cadaverine、putrescine、histamin的有害代谢产物。
[0059]
(4)溶血实验分析
[0060]
将活化两代后的l.plantarum j26划线接种于哥伦比亚血琼脂培养基上，37℃培养48h，若出现草绿色溶血环，即为α
‑
溶血；若出现无色透明的溶血环，即为β
‑
溶血；若无溶血环，即为γ
‑
溶血。以s.aureus atcc 25923作为阳性对照菌株。检测结果如图6所示，s.aureus atcc 25923菌落周围出现了透明圈，发生了β
‑
溶血现象，而l.plantarum j26菌落周围无溶血环出现，为γ
‑
溶血。
[0061]
(5)靛基质试验分析
[0062]
将活化两代后的l.plantarum j26接种至蛋白胨水培养基中，37℃培养24h后，加入少量二甲苯，摇动试管提取靛基质，待其浮于培养基表面后沿管壁加入kovacs试剂，观察二甲苯层颜色变化。若二甲苯层呈玫瑰红色，即为阳性；反之，则为阴性。以e.coli atcc 25922作为阳性对照菌株。检测结果如图7所示，接种阳性对照菌株e.coli atcc 25922的检测培养基液面出现玫瑰红色，为阳性结果；而接种l.plantarum j26的培养基液面无玫瑰红色，为阴性结果。由此说明，l.plantarum j26不能产生色氨酸酶分解色氨酸生成吲哚。
[0063]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。