一种血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒及其制备方法与流程

一种血清淀粉样蛋白a的检测试剂盒及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及体外诊断试剂技术领域，尤其涉及一种血清淀粉样蛋白a的检测试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.血清淀粉样蛋白a(serum amyloid a protein，saa)是一种急性时限反应蛋白，属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质，相对分子量约12000。在炎症、感染性和非感染性疾病期间，他在血液中的浓度能在数小时内急剧升高，在急性时限反应中，经il
‑
1、1l
‑
6和tnf刺激，saa在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成，可升高到最初浓度的100
‑
1000倍，但半衰期极短，只有50分钟左右。血清淀粉样蛋白a与髙密度脂蛋白(hdl)有关，它能在炎症期间调节高密度脂蛋白的代谢。
3.血淸淀粉样蛋白a—个特别重要的特性是其降解产物能以淀粉样蛋白a(aa)原纤维的方式沉积在不同的器官中，在慢性炎症疾病中这是一种严重的并发症，血清淀粉样蛋白a升高还见于动脉粥硬化、糖尿病肾病、急性心肌梗死、冠心病、慢性肾脏疾病。在评价炎症、监控其活动及治疗中，saa与c反应蛋白(crp)有相似的作用。saa检测在诊断发生病毒感染、肾移植排斥反应的患者(特别是进行免疫机制治疗的患者)以及肾上腺皮质激素治疗的囊性纤维化患者方面，比crp检测更确凿。目前，应用于血清saa检测的方法包括酶联免疫吸附法、放射性免疫检测法、免疫层析法、免疫散射比浊法、胶乳增强免疫比浊法等等。酶联免疫吸附法操作繁琐，耗吋，自动化水平低:放射性免疫分析法虽然具有特异性强灵敏度高的特点，但也存在潜在放射性污染，因此也逐渐不被接受；胶乳增强免疫比浊法较之免疫层析法具有更商的灵敏度和准确度。羧基微球和saa抗体的化学交联是乳胶增强免疫比浊法的关键,edc可将微球上的羧基活化，活化的羧基能与saa抗体中的氨基反应形成肽键。但此方法制备得到的蛋白质
‑
微球中，蛋白质和胶乳微球直接接触，胶乳微球的表面会对抗体的结构产生影响，从而会使蛋白质的活性有所下降，最终会降低试剂的灵敏度。为此，我们提出了一种胶乳增强免疫比浊法测定血清淀粉样蛋白a检测试剂盒。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种血清淀粉样蛋白a的检测试剂盒及其制备方法，所述血清淀粉样蛋白a的检测试剂盒
5.为达到上述技术效果，本发明采用了以下技术方案：
6.第一方面，一种血清淀粉样蛋白a的检测试剂盒，包括r1试剂和r2试剂，其中：r1试剂包括缓冲液、增强剂、防腐剂，其中所述增强剂为peg和明胶、氯化钠的混合溶液；r2试剂包括包被有抗人血清淀粉样蛋白a抗体的胶乳颗粒、缓冲液、防腐剂以及表面活性剂。
7.进一步地，所述r1试剂中的缓冲液具体为pbs缓冲液和三羟甲基氨基甲烷tris缓冲液的混合物。
8.进一步地，所述r1试剂中的缓冲液具体为pbs缓冲液和三羟甲基氨基甲烷tris缓
冲液的混合物按质量配比1:3制备而成。
9.进一步地，所述r1试剂中的peg为peg 2000、peg 6000或者peg 8000中的任意一种或多种的混合物。
10.进一步地，所述r1试剂和r2试剂中的防腐剂为叠氮钠。
11.进一步地，所述r2试剂中的胶乳颗粒的直径为100nm
‑
300nm；所述缓冲液为pbs缓冲液；
12.进一步地，所述r2中的表面活性剂为tritonx
‑
100。
13.进一步地，所述r1试剂和r2试剂的ph均为7.2
‑
7.6。
14.进一步地，所述r1试剂包括：pbs磷酸盐缓冲液20mmol/l、tris三羟甲基氨基甲烷缓冲液60mmol/l、peg600010g/l、叠氮钠1g/l、明胶1g/l以及氯化钠1.5g/l；所述r2试剂为pbs磷酸盐缓冲液60mmol/l、tritonx
‑
1000.3％、叠氮钠1g/l、抗人血清淀粉样蛋白a抗体、胶乳颗粒0.25％(w/v)以及氯化钠2g/l。
15.第二方面，本发明还提供一种血清淀粉样蛋白a的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
16.步骤s1：将部分缓冲液加入至容器中，加入防腐剂，继续搅拌至防腐剂完全溶解，然后加入增强剂后用缓冲液定容。
17.步骤s2：将纯化水加入容器中，搅拌均匀；加入包被有抗人血清淀粉样蛋白a抗体的胶乳颗粒，搅拌至完全溶解；加入叠氮钠，搅拌至完全溶解；加入tritonx
‑
100和氯化钠，搅拌至完全溶解；用纯化水定容。
18.进一步地，所述包被有抗人血清淀粉样蛋白a抗体的胶乳颗粒的制备方法如下：取表面羟基化的聚苯乙烯胶乳颗粒，加入mes缓冲液100ml，再加入抗人血清样蛋白a抗体12g及edc19g，加水至1l，室温下搅拌反应2小时，1800rpm离心20分钟，去除上清，所得沉淀即为包被有抗人血清淀粉样蛋白a抗体的胶乳颗粒。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果为：采用新型胶乳增强免疫比浊法，在edc的存在下，抗人血清淀粉样蛋白a抗体通过与表面羟基化的聚苯乙烯胶乳颗粒反应形成中间活化酯，并且在反应体系中添加表面活性剂tritonx
‑
100使微球不会对蛋白质的结构产生影响，最大程度保持了蛋白质的稳定，而不会发生蛋白质凝聚，影响检测吸光度变化不稳定的现象。同时，还通过在r2试剂中适当的增强剂并对r1试剂和r2试剂的配方进行优化，使得该血清淀粉样蛋白a的检测试剂盒检测的准确性好、稳定性高。此外，该血清淀粉样蛋白a检测试剂盒的制备方法简单，检测成本较低，利于大面积推广应用。
附图说明
20.图1为本发明的实施例1相对于对比例1的准确性验证结果；
21.图2为本发明的实施例2相对于对比例1的准确性验证结果；
22.图3为本发明的实施例3相对于对比例1的准确性验证结果；
23.图4为本发明的实施例4相对于对比例1的准确性验证结果；
24.图5为本发明的实施例1相对于对比例1的稳定性验证结果；
25.图6为本发明的实施例2相对于对比例1的稳定性验证结果；
26.图7为本发明的实施例3相对于对比例1的稳定性验证结果；
27.图8为本发明的实施例4相对于对比例1的稳定性验证结果；
具体实施方式
28.下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
29.实施例1
30.本实施例所提供的血清淀粉样蛋白a的检测试剂盒，包括r1试剂和r2试剂，所述r1试剂和r2试剂的组成如下：
31.r1试剂：
[0032][0033]
r2试剂：
[0034][0035][0036]
实施例2
[0037]
本实施例所提供的血清淀粉样蛋白a的检测试剂盒，包括r1试剂和r2试剂，所述r1试剂和r2试剂的组成如下：
[0038]
r1试剂：
[0039][0040]
r2试剂：
[0041][0042]
实施例3
[0043]
本实施例所提供的血清淀粉样蛋白a的检测试剂盒，包括r1试剂和r2试剂，所述r1试剂和r2试剂的组成如下：
[0044]
r1试剂：
[0045][0046]
r2试剂：
[0047][0048]
实施例4
[0049]
本实施例所提供的血清淀粉样蛋白a的检测试剂盒，包括r1试剂和r2试剂，所述r1试剂和r2试剂的组成如下：
[0050]
r1试剂：
[0051][0052]
r2试剂：
[0053][0054]
对比例1
[0055]
本对比例1采用国家食品药品监督管理局认可的北京九强生物科技公司的血清淀粉样蛋白a(saa)检测试剂盒
[0056]
实施例5
[0057]
采用本实施例1
‑
4及对比例1的检测试剂盒制备方法，进行准确度及稳定性性能评价：
[0058]
在评价过程中，实施例1
‑
4以及对比例1的血清淀粉样蛋白a检测试剂盒的测试方法如下：
[0059]
在检测过程中采用全自动贝克曼au480生化分析仪，设置主波长为：546nm，副波长为800nm；比色杯光径为1.0cm；终点法(end)；上升反应。
[0060]
具体的操作步骤如表1所示：
[0061]
表1测定血清淀粉样蛋白a含量的检测步骤
[0062][0063]
在测定样本前，需要进行校准和质控程序，使用配套的校准品作校准曲线，采用6点非线性法定标。校准曲线每7天重新制作一次，当发生如下情形时，需要重新校准:试剂批号更换时，仪器更换零部件或者保养时，质控品或样本结果异常时。质控程序:采用配套的质控品，每天进行质控实验；每个浓度质控品重复测量10次，计算精密度cv，控制在质控品偏差范围内。
[0064]
根据校准曲线，计算样本的血清淀粉样蛋白a含量，计算式如下：
[0065][0066]
5.1实施例1
‑
4及对比例1的准确度验证
[0067]
参照ep9a2的方法，收集新鲜的临床样本共40份，所选saa浓度在试剂线性范围内并均匀分布。用实施例1
‑
3与对比例1进行对比实验，实验结果如表1所示，计算对比结果的相关系数(r)和直线回归方程，其结果如附图1
‑
附图4所示：
[0068]
表2三种实施例试剂盒检测40例样本中的saa含量(mg/l)
[0069][0070][0071]
如附图1
‑
附4统计结果显示，根据线性回归方程：y＝ax b，从三组对比结果的r2可以看出，实施例4与对比例1的对比结果相关性要明显优于实施例1、实施例2、实施例3，说明采用本发明方法实施例4制备的血清淀粉样蛋白a液体双试剂准确度较高。
[0072]
5.2实施例1
‑
4及对比例1的稳定性实验
[0073]
将采用本发明实施例1
‑
4的方法配制的检测试剂进行稳定性验证实验。将以上4种试剂每种平均分成两份，一份至于2
‑
8℃保存，另一份至于37℃水浴中保存，每隔一天测定一次，连续监测一周，观察同一血清样本测定值(血清定值12.8mg/l，允许误差范围
±
10％)，通过连续的测定结果比较试剂的稳定性，测试结果如表3
‑
表6所示，统计结果如附图
5
‑
附图8所示：
[0074]
表3采用实施例1的方法配制的试剂稳定性数据单位(mg/l)
[0075][0076][0077]
表4采用实施例2的方法配制的试剂稳定性数据单位(mg/l)
[0078][0079]
表5采用实施例3的方法配制的试剂稳定性数据单位(mg/l)
[0080][0081]
表6采用实施例4的方法配制的试剂稳定性数据单位(mg/l)
[0082][0083][0084]
如附图5
‑
附8统计结果显示可以看出，采用实施例1
‑
4方法制得的试剂在2
‑
8℃保存稳定性相对良好。采用实施例4方法制得的试剂于37℃水浴一周，虽然测定saa浓度有一定程度下降，但是下降幅度不大，在允许范围内，而且明显优于实施例1、实施例2、实施例3方法制得的试剂。说明加入配比合适的缓冲剂和合适的增强剂组合可以有效的提高试剂的稳定性，大大提高试剂盒稳定周期。
[0085]
综上性能评价可知，采用本发明实施例4方法配制的血清淀粉样蛋白a液体双试剂具有准确度高、稳定性好的优点，可以满足临床需求，在临床诊断病毒感染、慢性炎症等病情方面有很好的应用价值。
[0086]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。