新的间皮素抗体和包含其的组合物的制作方法

新的间皮素抗体和包含其的组合物
1.本技术为申请号为201680062531.0的中国专利申请(申请日：2016年9月23日，发明名称：新的间皮素抗体和包含其的组合物)的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及一种与间皮素(msln)特异性结合的抗体、编码所述抗体的核酸、包含所述核酸的载体和宿主细胞、用于产生所述抗体的方法以及用于治疗癌症或肿瘤的包含所述抗体作为活性成分的药物组合物。


背景技术：

3.抗体用于治疗包括实体瘤在内的多种癌症或肿瘤是高效的。例如，赫赛汀(herceptin)已经成功用于乳腺癌的治疗中，并且阿瓦斯汀(avastin)已经成功用于结肠癌的治疗中。开发使用抗体的癌症或肿瘤治疗的核心是开发抗肿瘤细胞中优势表达(过表达)的膜表面蛋白的抗体。
4.间皮素(msln)是一种作为69至71kda前体多肽的糖蛋白，并且作为糖基磷脂酰肌醇(gpi)结合的蛋白的前体形式在细胞表面表达。前体被从前体中的弗林蛋白酶位点(rprfrr)分离，并形成32kda的巨核细胞强化因子(mpf)，mpf是从具有gpi结合的间皮素膜蛋白即40kda的c
‑
末端多肽的细胞上释放的n
‑
末端多肽(hassan r.et al.,clin.cancer res.,10(12pt 1):3937
‑
3942,2004；chang,k.et al.,proc.natl.acad.sci.usa,93(1):136
‑
40,1996)。
5.间皮素被命名为巨核细胞强化因子(mpf)是由于其从人胰细胞系hpc
‑
y5中纯化，并被观察到具有巨核细胞强化活性(yamaguchi n.et al.,j.biol.chem.269:805
‑
808,1994)。
6.尚未清楚地发现间皮素的功能。此外，当产生间皮素基因表达缺陷型小鼠时，未观察到致命的生殖、血液或解剖学异常(bera,t.k.et al.,mol.cell.biol.20(8):2902
‑
2906,2000)。
7.间皮素是一种在腹膜、胸膜和心包腔的间皮细胞系的细胞表面存在的糖蛋白。间皮素在间皮瘤即癌症/肿瘤细胞、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肺癌和子宫内膜癌中优势表达(过表达)。与此相反，其表达在正常细胞例如间皮细胞中受限，间皮细胞可以是肿瘤治疗的理想靶标(argani,p.et al.,clin.cancer res.,7(12):3862
‑
8,2001；hassan,r.,et al.,clin.cancer res.,10(12pt 1):3937,2004)。
8.此外，间皮素与在肿瘤细胞的细胞表面存在的被证实为卵巢癌的抗原的黏蛋白样糖蛋白的ca125(muc
‑
16)特异性反应(相互作用)。具体地，看来ca125与膜结合的间皮素的结合能够介导异型细胞粘附和转移，并且ca125和间皮素在晚期卵巢腺癌中共表达(rump,a.et al.,j.biol.chem.,279(10):9190
‑
8,2004)。间皮素在腹膜腔的内皮中的表达与用于形成卵巢癌转移的优选部分相互关联，并且间皮素
‑
ca125结合促进卵巢肿瘤的腹膜转移(gubbels,j.a.et al.,mol.cancer,5(1):50,2006)。
9.近年来，已经开发了靶向表达间皮素的肺癌、卵巢癌和胰腺癌的基于抗体的靶向治疗。作为示例，通过免疫小鼠产生的mab k1已经被开发为抗膜结合的间皮素多肽的一级抗体(chang,k.,et al.,int.j.cancer,50(3):373,1992)。但是，由于mab k1抗体的低亲和性和差的内化率，由连接至截断型化学修饰的假单胞菌外毒素a的mab k1组成的免疫毒素不适于临床开发(hassan,r.,et al.,j.immunother.,23(4):473,2000；hassan,r.,et al.,clin.cancer res.,10(12pt 1):3937,2004)。并且，已经开发了包括ss1
‑
(dsfv)
‑
pe38在内的具有较高亲和性的单链抗体，其具有在体外杀死肿瘤细胞的能力(hassan,r.,et al.,clin.cancer res.,8(11):3520,2002)，并且在人间皮素表达型肿瘤的啮齿动物模型中有效(fan,d.,et al.,mol.cancer ther.,1(8):595,2002)。从以上结果得出，间皮素是适用于多种癌症的免疫治疗的靶标。但是，观察到，ss1
‑
(dsfv)
‑
pe38在临床试验中具有免疫原性，使得其在大多数患者中的第二次给药被中断，并且ss1
‑
(dsfv)
‑
pe38倾向于被快速从血液中除去，因此，尝试将ss1
‑
(dsfv)
‑
pe38的聚乙二醇修饰引入融合蛋白形式中，由此增加抗体在体内的留存(filpula,d.,et al.,bioconjugate chem.,18(3):773,2007)。
10.使用异种移植啮齿动物作为癌症模型的免疫毒素癌症疗法的临床试验经常受到治疗抗体与其啮齿动物相应物之间的交叉反应性不足的限制。另外，中和从用啮齿动物来源的抗体或嵌合抗体治疗的患者形成的抗小鼠fv抗体可以导致剂量限制毒性或者可以降低治疗功效。因此，为了增加癌症治疗的功效，需要兼具增加的亲和性、降低的离解速率和对于间皮素抗原的啮齿动物交叉反应性的靶向抗体。
11.另外，作为新的抗间皮素(msln)抗体的额外性质，其需要保持对于在不同癌症或肿瘤细胞的细胞表面表达的间皮素的亲和性。间皮素是一种高度可变的蛋白质，在多个部位中经过翻译后的糖基化以及蛋白质水解(hassan,r.,et al.,clin cancer res.,10(12pt 1):3937,2004)。看来，转录变体1(genbank nm_005823)代表了目前测试的肿瘤细胞系中展示的主要种类，但是由于检测到了三种不同的剪接变体，可变性延伸到转录水平(muminova,z.e.,et al.,bmc cancer,4:19,2004；hellstrom,i.,et al.,cancer epidemiol.biomarkers prev.15(5):1014,2006)。因此，有效的抗内皮缩血管肽抗体包括表达不同形式的间皮素的糖基化方式的可变性，但是需要不变地被结合至来源于不同患者的癌症或肿瘤细胞表面表达的间皮素表位，这独立于个体可变性。
12.因此，本发明人努力制备出一种与msln特异性结合的新的抗体，因此，发明了具有对于在癌症细胞中过表达的msln具有高度亲和性的新的抗体。并且发现了根据本发明的抗体作为有效抗癌治疗剂的潜力，并完成了本发明。
13.发明公开
14.技术问题
15.本发明的目的是提供一种与间皮素(msln)特异性结合的抗体、编码所述抗体的核酸、包含所述核酸的载体和宿主细胞、用于产生所述抗体的方法以及用于治疗癌症或肿瘤的包含所述抗体作为活性成分的药物组合物。
16.本发明的另一个目的是提供一种与间皮素(msln)特异性结合的新的抗体。
17.技术方案
18.为实现上述目的，本发明提供了一种间皮素特异性抗体，其包含：包含具有seq id no:9、15、21、27或59的氨基酸序列的重链cdr1、具有seq id no:10、16、22、28、60、65、71、
75、80、84、121、122、123或125的氨基酸序列的重链cdr2、具有seq id no:11、17、23、29、61、66、72、76、81、85、124或126的氨基酸序列的重链cdr3的重链可变区。
19.另外，本发明提供了一种间皮素特异性抗体，其包含：包含具有seq id no:12、18、24、30、62、67、70、77、86或117的氨基酸序列的轻链cdr1、具有seq id no:13、19、25、63、68、73、78或82的氨基酸序列的轻链cdr2、具有seq id no:14、20、26、64、69、74、79、83、87、118、119或120的氨基酸序列的轻链cdr3的轻链可变区。
20.此外，本发明提供了一种间皮素特异性抗体，其包含：包含seq id no:1、3、5、7、46、48、51、53、55、57、112、113、114、115或116的氨基酸序列的重链可变区以及包含seq id no:2、4、6、8、47、52、54、56、58、109、110或111的氨基酸序列的轻链可变区。
21.另外，本发明提供了一种编码所述msln特异性抗体的核酸；和一种包含所述核酸的载体；和一种其中引入所述载体的细胞。
22.此外，本发明提供了一种用于治疗癌症或肿瘤的包含所述抗msln抗体作为活性成分的药物组合物。
附图说明
23.图1示出了克隆ms502的轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)在抗间皮素(msln)抗体中的预测结构。
24.图2示出了轻链可变区突变体在结合力方面的相对比较。
25.图3示出了重链可变区突变体在结合力方面的相对比较。
26.图4示出了用于在细胞系中表达msln的载体。
27.图5在sds
‑
page上示出了msln的前体形式和成熟形式。
28.图6示出了表达msln的细胞系和肿瘤细胞系的msln表达量的分析。
29.图7示出了通过使用本发明的抗间皮素(msln)抗体对于表达msln的细胞系的选择性结合的分析。
30.图8示出了通过通过facs确定抗msln抗体是否与间皮瘤(h226,h2052)和胰腺癌(aspc
‑
1)的细胞膜结合而获得的mfi。
31.图9示出了通过确定本发明的抗msln抗体是否选择性地与表达msln的肿瘤细胞结合而获得的结果。
具体实施方式
32.如本文所使用的术语“间皮素”或“msln”是指由细胞天然表达的人msln的任何变体、同种型和物种同源物(species homolog)。
33.术语“人间皮素”是指人序列间皮素，诸如具有genbank登录no.np_005814的人间皮素的完整氨基酸序列。
34.本发明的一个实施方案制备了在结构上表征为与由seq id no:127代表的间皮素特异性结合的单克隆抗体和单独的抗体，所述单独的抗体诸如”克隆mi323",“克隆mi329”、“克隆mi403”和“克隆mi407”以及“克隆ms501”、“克隆ms502”、“克隆ms503”、“克隆ms504”、“克隆ms505”和“克隆ms506”以及“克隆c2g1”、“克隆c2g4”、“克隆c3c8”、“克隆54”、“克隆56”、“克隆2
‑
30”、“克隆2
‑
73”和“克隆2
‑
78”以及“克隆56
‑
c2g4”、“克隆2
‑
30
‑
c2g4”、“克隆
2
‑
73
‑
c2g4”和“克隆2
‑
78
‑
c2g4”。
35.对于每种抗体的重链cdr和轻链cdr的氨基酸序列在下表2、5、12和16中示出。如表1、4、11和15中所示，抗msln抗体可以包含重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列或者具有其同源物的序列。
36.在本发明的另一个实施方案中，通过使用酶联免疫吸附试验(elisa)选择了对于重组人msln的纯化的抗体的单个抗体克隆，即，“克隆mi323”、“克隆mi329”、“克隆mi403”、“克隆ms502”和“克隆c2g1”、“克隆c2g4”、“克隆c3c8”和“克隆56
‑
c2g4”、“克隆2
‑
30
‑
c2g4”、“克隆2
‑
73
‑
c2g4”和“克隆2
‑
78
‑
c2g4”(数据未显示)，并且通过使用biacore t
‑
200(ge healthcare,美国)生物传感器测量了定量的结合力(实施例2
‑
5、实施例3
‑
11、实施例3
‑
14)。因此，如下表8、14和18中所示，虽然存在轻微差异，所有产生的克隆抗体都对间皮素具有亲和性。
37.在本发明的另一个实施方案中，为了评价来源于免疫和合成文库的抗msln抗体是否与表达msln的细胞选择性地结合，在癌细胞系中测量msln的表达量，并且通过facs测试来证实抗体与每种细胞的结合。因此，如图5中所示出的，通过测量是否存在来自每种癌细胞系的具有70kda前体形式和40至50kda成熟形式的msln，证实h28、miapaca
‑
2、bxpc
‑
3、capan
‑
1细胞系是msln
‑
阴性的，并且h226,h2452(h2052),aspc
‑
1是mlsn
‑
阳性的。
38.另外，作为通过进行抗msln候选抗体对于表达msln的细胞系(h226、h2452(h2052)、aspc
‑
1)的选择性结合的分析获得的结果，如图8和表19中所示出的，所有mi323、mi329、mi403、ms502候选抗体对于间质瘤和胰腺癌细胞系的msln都具有显著的结合力，虽然在结合程度上存在轻微差异。具体地，mi323候选抗体具有卓越的结合状况。
39.此外，作为通过评价具有卓越的对于msln的结合状况的mi323候选抗体、具有biacore k
d
(koff/kon)值的不同图案的ms502候选抗体以及从ms502候选抗体产生的重链可变区突变2
‑
78
‑
c2g4候选抗体是否与表达msln的肿瘤细胞选择性结合所获得的结果，在过表达msln的miapaca
‑
msln#2细胞和不过表达msln的miapaca
‑
2中，如图9中所示出的，与miapaca
‑
2相比，mi323、ms502和2
‑
78
‑
c2g4候选抗体在过表达msln的miapaca
‑
msln#2细胞中具有卓越的结合状况。
40.因此，本发明涉及一种与间皮素(msln)特异性结合的抗体，优选一种与由seq id no:127代表的间皮素特异性结合的抗体。
41.根据本发明的与间皮素特异性结合的抗体的特征在于包含重链可变区，所述重链可变区包含具有seq id no:9、15、21、27或59的氨基酸序列的重链cdr1，具有seq id no:10、16、22、28、60、65、71、75、80、84、121、122、123或125的氨基酸序列的重链cdr2，具有seq id no:11、17、23、29、61、66、72、76、81、85、124或126的氨基酸序列的重链cdr3。
42.根据本发明的与间皮素特异性结合的抗体的特征在于包含轻链可变区，所述重链可变区包含具有seq id no:12、18、24、30、62、67、70、77、86或117的氨基酸序列的轻链cdr1，具有seq id no:13、19、25、63、68、73、78或82的氨基酸序列的轻链cdr2，具有seq id no:14、20、26、64、69、74、79、83、87、118、119或120的氨基酸序列的轻链cdr3。
43.在本发明中，与间皮素特异性结合的抗体可以包含重链可变区，所述重链可变区包含与seq id no:1、3、5、7、46、48、51、53、55、57、112、113、114、115或116的氨基酸序列具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，并且更优选100％同源性的序列，并且所述抗体
可以包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与seq id no:2、4、6、8、47、52、54、56、58、109、110或111的氨基酸序列具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，并且更优选100％同源性的序列。
44.在本发明中，与间皮素特异性结合的抗体的特征在于包含包含seq id no:1、3、5、7、46、48、51、53、55、57、112、113、114、115或116的氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:2、4、6、8、47、52、54、56、58、109、110或111的氨基酸序列的轻链可变区，并且所述抗体可以是人单克隆抗体，但不限于此。
45.抗体的氨基酸序列可以通过保守置换来置换。“保守置换”是指多肽修饰，其包括用对于相应的多肽具有相似生物化学特性的氨基酸置换至少一个氨基酸而不会导致生物学功能或生物化学功能丧失。“保守氨基酸置换”是指其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基代替的置换。本领域定义了具有相似侧链的氨基酸残基的种类。这些种类包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β分支的侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。预计本发明的抗体当具有保守氨基酸置换时仍能保持活性。
46.术语“基本上同源性”是指当两种核酸或两种多肽或其指定序列被最佳排列和比对时，具有恰当的核苷酸或氨基酸插入或缺失的核酸和多肽与所述核苷酸或氨基酸具有至少约80％同一性，一般地，与所述核苷酸或氨基酸具有至少约85％，优选约90％、91％、92％、93％、94％或95％，更优选至少约96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％或99.5％同一性。或者，当片段与其互补链在选择性杂交条件下杂交时，与该核酸存在基本上同源性。本发明包括与以上所述的具体的核酸序列和氨基酸序列具有基本上同源性的核酸序列和多肽序列。
47.在根据本发明的抗体中，例如，表2、表5、表12和表16中所示的重链(v
h
)cdr1、2和3序列和轻链(v
l
)cdr1、2和3序列可以通过混合结构上相似的重链(v
h
)和轻链(v
l
)序列以被以重链(v
h
)/轻链(v
l
)对的cdr1、2和3的形式排列而形成。
48.如本文所使用的“抗体”或“抗体组成”是指具有单一分子组成的抗体分子的制备。在此，单克隆抗体组成表示对于特定表位的单一结合特异性和亲和性。因此，术语“人单克隆抗体”是指具有衍生自人布线(wiring)免疫球蛋白序列的可变区和恒定区并且表现出单一结合特异性的抗体。本发明的人抗体可以包含不由人布线免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引起的突变体)。
49.本文使用的“抗体”是与特异性抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白分子，并且意指充当特异性识别抗原的受体的蛋白质分子，并且可以包括所有多克隆抗体、单克隆抗体(单一克隆抗体)、全抗体和抗体片段。此外，抗体可以包括嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)和二价或双特异性分子(例如双特异性抗体)、双抗体、三抗体和四抗体。
50.全抗体具有具有两条全长轻链和两条全长重链的结构，并且每条轻链可以经由二硫键连接至重链。全抗体包括iga、igd、ige、igm和igg，并且igg是一种亚型，包括igg1、igg2、igg3和igg4。抗体片段意指保留抗原结合功能的片段，包括fab、fab'、f(ab')2、scfv
和fv等。
51.fab具有以下结构：其具有一条轻链和一条重链的可变区以及该轻链的恒定区和该重链的第一恒定区(ch1结构域)，并且具有一个抗原结合位点。fab'与fab的区别在于fab'具有包含在重链ch1结构域的c末端处的一个或多个半胱氨酸残基的铰链区。f(ab')2抗体是通过实现将fab'的铰链区中的半胱氨酸残基形成二硫键而产生的。
52.fv(可变片段)是指仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段。在双链fv(dsfv)中，重链可变区和轻链可变区通过二硫键连接。在单链fv(scfv)中，重链可变区和轻链可变区一般使用连接肽通过共价键连接。这些抗体片段可以通过使用蛋白质水解酶获得(例如，fab可以通过使用木瓜蛋白酶限制性切割全抗体而获得，并且f(ab')2片段可以通过使用胃蛋白酶切割而获得)，并且可以通过重组dna技术构建(例如，通过使用编码抗体的重链或其可变区的dna以及编码轻链或其可变区的dna作为模板，并且使用引物对的pcr(聚合酶链式反应)的扩增方法，并且结合编码引物对的连接肽的dna进行扩增，这允许其两个末端分别连接至重链或其可变区以及轻链或其可变区)。
53.免疫球蛋白具有重链和轻链，其中各个重链和轻链包含恒定区和可变区(这些区域也被称为结构域)。轻链可变区和重链可变区包含3个被称为互补决定区(在下文中，被称为“cdr”)的多可用区(multi
‑
available region)和四个框架区。cdr主要功能是结合抗原的表位。各个链的cdr一般从n末端开始被依次称为cdr1、cdr2和cdr3，还通过特定cdr所位于的链来识别。
54.本文使用的单克隆抗体(单一克隆抗体)意指基本上在同一抗体群中获得的具有单一分子组成的抗体分子，并且可以具有对于特异性表位的单一结合特异性和亲和性。
55.本文使用的单克隆抗体(单一克隆抗体)是衍生自人免疫球蛋白的分子，并且配置包含互补决定区(一种结构区域)的抗体的所有氨基酸序列被配置为人免疫球蛋白氨基酸序列。人抗体通常用于治疗人类疾病，其优势在于：i)其更加有利地与人免疫系统相互作用，这更加有效地通过补体依赖性细胞毒性反应(cdc)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性反应(adcc)破坏靶细胞，ii)人免疫系统不将该抗体识别为外源性物质，和iii)甚至当以更低的频率给予更小量的药物时，在人循环系统中的半衰期与天然产生的抗体的半衰期相似。
56.本文使用的术语与msln特异性结合的抗体“克隆mi323”、“克隆mi329”、“克隆mi403”和“克隆mi407”以及“克隆ms501”、“克隆ms502”、“克隆ms503”、“克隆ms504”、“克隆ms505”和“克隆ms506”以及“克隆c2g1”、“克隆c2g4”、“克隆c3c8”、“克隆54”、“克隆56”、“克隆2
‑
30”、“克隆2
‑
73”和“克隆2
‑
78”以及“克隆56
‑
c2g4”、“克隆2
‑
30
‑
c2g4”、“克隆2
‑
73
‑
c2g4”和“克隆2
‑
78
‑
c2g4”意指与msln结合并且引起msln的生物活性抑制的抗体，并且可以通过混合抗msln抗体来使用。
57.在此，“克隆mi323”、“克隆mi329”、“克隆mi403”和“克隆mi407”是通过用重组人msln免疫小鼠而获得的抗体，并且“克隆ms501”、“克隆ms502”、“克隆ms503”、“克隆ms504”、“克隆ms505”和“克隆ms506”是来自scfv文库通过噬菌体展示而获得的抗体，并且“克隆c2g1”、“克隆c2g4”、“克隆c3c8”、“克隆54”、“克隆56”、“克隆2
‑
30”、“克隆2
‑
73”和“克隆2
‑
78”是如表9中所示的通过将突变引入“克隆ms502”中而获得的抗体，并且“克隆56
‑
c2g4”、“克隆2
‑
30
‑
c2g4”、“克隆2
‑
73
‑
c2g4”和“克隆2
‑
78
‑
c2g4”是通过引入突变抗体之间的组合
而产生的抗体。
58.抗体对于msln的k
d
(平衡解离常数)可以举例说明如下。
59.(1)克隆mi323可以具有1.8x10
‑8m或更小，优选1.8x10
‑9m或更小，并且更优选1.8x10
‑
10
m或更小的平衡解离常数(k
d
)，
60.(2)克隆mi329可以具有3.5x10
‑9m或更小，优选3.5x10
‑
10
m或更小，并且更优选3.5x10
‑
11
m或更小的平衡解离常数(k
d
)，
61.(3)克隆mi403可以具有4.5x10
‑8m或更小，优选4.5x10
‑9m或更小，并且更优选4.5x10
‑
10
m或更小的平衡解离常数(k
d
)，
62.(4)克隆mi502可以具有2.3x10
‑8m或更小，优选2.3x10
‑9m或更小，并且更优选2.3x10
‑
10
m或更小的平衡解离常数(k
d
)(参见表8)，
63.(5)克隆c2g1可以具有9.39x10
‑9m或更小，优选9.39x10
‑
10
m或更小，并且更优选9.39x10
‑
11
m或更小的平衡解离常数(k
d
)，
64.(6)克隆c2g4可以具有4.32x10
‑9m或更小，优选4.32x10
‑
10
m或更小，并且更优选4.32x10
‑
11
m或更小的平衡解离常数(k
d
)，
65.(7)克隆c3c8可以具有1.22x10
‑8m或更小，优选1.22x10
‑9m或更小，并且更优选1.22x10
‑
10
m或更小的平衡解离常数(k
d
)(参见表14)，
66.(8)克隆56可以具有1.25x10
‑8m或更小，优选1.25x10
‑9m或更小，并且更优选1.25x10
‑
10
m或更小的平衡解离常数(k
d
)，
67.(9)克隆2
‑
30可以具有1.66x10
‑8m或更小，优选1.66x10
‑9m或更小，并且更优选1.66x10
‑
10
m或更小的平衡解离常数(k
d
)，
68.(10)克隆2
‑
78可以具有1.63x10
‑9m或更小，优选1.63x10
‑
10
m或更小，并且更优选1.63x10
‑
11
m或更小的平衡解离常数(k
d
)，
69.(11)克隆56
‑
c2g4可以具有1.63x10
‑8m或更小，优选1.63x10
‑9m或更小，并且更优选1.63x10
‑
10
m或更小的平衡解离常数(k
d
)，
70.(12)克隆2
‑
30
‑
c2g4可以具有2.34x10
‑8m或更小，优选2.34x10
‑9m或更小，并且更优选2.34x10
‑
10
m或更小的平衡解离常数(k
d
)，
71.(13)克隆2
‑
73
‑
c2g4可以具有1.65x10
‑8m或更小，优选1.65x10
‑9m或更小，并且更优选1.65x10
‑
10
m或更小的平衡解离常数(k
d
)，和
72.(14)克隆2
‑
78
‑
c2g4可以具有3.72x10
‑9m或更小，优选3.72x10
‑
10
m或更小，并且更优选3.72x10
‑
11
m或更小的平衡解离常数(k
d
)(参见表18)。
73.在本发明的另一个实施方案中，鉴定了来源于与人msln结合的免疫文库的小鼠的重链可变区和轻链可变区的基因，将该重链可变区基因连接至1型人免疫球蛋白重链恒定区(igg1重链恒定区)基因，并且将该轻链可变区连接至人κ轻链恒定区，并且将这些基因分别插入用于动物细胞的蛋白表达载体，以产生载体，随后在expi293f
tm
细胞系中转染，并且培养以产生抗体，并且通过蛋白a纯化产生的抗体以产生抗体(实施例1
‑
3)。
74.在本发明的又另一个实施方案中，鉴定了来源于与人msln结合的合成scfv文库的重链可变区和轻链可变区的基因，将重链可变区连接至1型人免疫球蛋白重链恒定区(igg1重链恒定区)基因，并且将该轻链可变区连接至人κ轻链恒定区，并且将这些基因分别插入用于动物细胞的蛋白表达载体，以产生载体，随后在expi293f
tm
细胞系中转染，并且培养以
产生抗体，并且通过蛋白a纯化产生的抗体以产生抗体(实施例2
‑
4、3
‑
10、3
‑
12和3
‑
13)。
75.因此，在本发明的另一方面，本发明提供了一种编码所述抗体的核酸。本文使用的核酸可以存在于细胞、细胞裂解物中，或者还可以以部分纯化的形式或基本上纯的形式存在。当通过常规技术将核酸从其它细胞组分或其它污染物例如其它细胞核酸或蛋白质中纯化时，该核酸是“分离的”或“是基本上纯的”，所述常规技术包括碱性/sds处理、cscl分带(cscl banding)、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳以及本领域公知的其它技术。本发明的核酸可以是，例如，dna或rna，并且可以包含内含子序列，或者可以不包含内含子序列。
76.在本发明的又另一方面，本发明提供了一种包含所述核酸的载体。为了为了表达抗体或其抗体片段，可以通过常规分子生物学技术(例如，pcr扩增或使用表达靶抗体的杂交瘤进行cdna克隆)获得编码具有部分长度或全长的轻链和重链的dna，并且可以将该dna“可操作地连接”至转录和翻译控制序列以插入到表达载体中。
77.本文使用的术语“可操作地连接”可以指将抗体基因连到载体中，使得载体中的转录和翻译控制序列具有控制抗体基因的转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列以与待使用的用于表达的宿主细胞具有相容性。将抗体的轻链基因和抗体的重链基因插入各自的载体，或者将两个基因插入同一表达载体。通过常规方法(例如，在载体上连接抗体基因片段与互补限制性内切酶位点，或者当根本不存在限制性内切酶位点时，平末端连接)将抗体插入表达载体。在一些情况下，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽与根据框架的抗体链基因的氨基末端连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来源于除了免疫球蛋白之外的蛋白质的信号肽)。此外，重组表达载体具有控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调控序列。“调控序列”可以包括控制抗体链基因的表达或翻译的启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。本领域技术人员能够认识到，可以通过根据诸如待转化的宿主细胞的选择、蛋白质的表达水平等之类的因素改变调控序列，而改变表达载体的设计。
78.在本发明的又另一方面，本发明提供了一种包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。将所述核酸或所述载体转染到宿主细胞中。对于“转染”，多种通常使用的技术诸如电泳、磷酸钙沉淀、deae
‑
右旋糖酐转染、脂转染等可以用于将外源性核酸(dna或rna)引入原核宿主细胞或真核宿主细胞。根据本发明的抗体可以在真核细胞中表达，考虑到进入哺乳动物细胞中的适应性优选在哺乳动物宿主细胞中表达。例如，适用于表达抗体的哺乳动物宿主细胞可以包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞(例如，包括与dhfr选择标记一起使用的dhfr
‑
cho细胞)、nso骨髓瘤细胞、cos细胞或sp2细胞等。
79.在本发明的又另一方面，本发明提供了一种用于产生抗体的方法，所述方法包括培养宿主细胞以表达所述抗体。当将编码所述抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，抗体的产生可以通过培养宿主细胞持续足以使抗体在宿主细胞中表达的时间段，或者更优选地，持续足以使抗体分泌到其中培养宿主细胞的培养基中的时间段。
80.在一些情况下，为了一致性，可以将表达的抗体从宿主细胞中分离并纯化。抗体的分离或纯化可以通过一般用于蛋白质的分离方法、纯化方法例如色谱来进行。色谱可以包括，例如，包括蛋白a柱和蛋白g柱在内的亲和色谱、离子交换色谱或疏水色谱。除了色谱之外，还可以通过额外与过滤、超滤、盐析、透析等结合来分离或纯化抗体。
81.在本发明的又另一方面，本发明提供了一种用于治疗癌症或肿瘤的包含所述抗体作为活性成分的药物组合物。
82.术语“癌症”或“肿瘤”通常是指或描述由不受控制的细胞生长/增殖表征的哺乳动物的生理条件。癌症的实例包括癌、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、胚细胞瘤、肉瘤和白血病，但不限于此。癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、白血病和其它淋巴增生性紊乱，以及多种类型的头颈癌。本发明的癌症优选是间皮素阳性癌症，并且选自由胰腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、子宫内膜癌和间皮瘤组成的组。
83.本发明提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的抗msln抗体和药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是能够被添加到活性成分中以帮助制剂的形成和稳定的物质，并且它不会对患者引起显著的不良毒理学作用。
84.载体是指在不刺激患者的同时不抑制给予的化合物的生物学活性和性质的载体或稀释剂。待配制成液体溶液的组合物中的药学上可接受的载体被灭菌并且适用于活体。盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇可以用作载体，或者至少其中一种组分可以混合以待使用，并且可以根据需要添加其它传统添加剂诸如抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等。另外，组合物可以被配制成用于注射的制剂，例如水溶液、悬浮液、乳液等、通过进一步向其中添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂的丸剂、胶囊、颗粒或片剂。其它载体在例如[remington's pharmaceutical sciences(e.w.martin)]中记载。组合物可以含有治疗有效量的至少一种抗msln抗体。
[0085]
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散物以及用于制备即配即用的无菌可注射溶液或分散物的无菌粉末。用于药物活性物质的这样的介质和剂的使用是本领域已知的。组合物优选被配制成用于胃肠外注射。组合物可以被配制成溶液、微乳液、脂质体或其它适用于高药物浓度的订购的结构。载体可以是，例如，含有水、乙醇、多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质以及其适当的混合物。在一些情况下，组合物可以包括等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。可以通过将所需量的活性化合物纳入适当的含有上述组分的一种类型或其组合的溶剂中，随后根据需要进行无菌微过滤，来配制无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物纳入含有来自上述组分的基本分散介质和其它所需组分的无菌媒介物中来制备分散物。通过从预先无菌过滤的溶液中真空干燥和冷冻干燥(冻干法)活性成分粉末和任何额外需要的组分粉末来获得用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末。
[0086]
药物组合物可以以可以根据患病患者的严重性改变的剂量和频率口服给予或胃肠外给予。可以将组合物根据需要作为大丸药或者通过连续注入给予患者。例如，表示为fab片段的本发明的抗体的大丸药给予可以具有0.0025至100mg/kg体重，0.025至0.25mg/kg，0.010至0.10mg/kg或0.10至0.50mg/kg的量。对于连续注入，表示为fab片段的本发明的抗体可以以0.001至100mg/kg/min，0.0125至1.25mg/kg/min，0.010至0.75mg/kg/min，0.010至1.0mg/kg/min或0.10至0.50mg/kg/min，持续1至24小时，1至12小时，2至12小时，6至12小时，2至8小时或1至2小时被给予。当表示为全长抗体(具有完整恒定区)的本发明的
抗体被给予时，给予量可以是约1至10mg/kg体重，2至8mg/kg或5至6mg/kg。通常经由持续30分钟至35分钟的注射来给予全长抗体。给予频率取决于病症的严重性。频率可以是每周3次至每周1次或两周一次。
[0087]
另外，可以经由皮下注射将组合物给予患者。例如，可以将具有10至100mg的给予量的抗msln抗体每周、每两周或每月通过皮下注射给予患者。
[0088]
如本文所使用的“治疗有效量”意指足以以适用于医疗的合理的益处/风险比率治疗疾病的量，以及抗msln抗体的组合的量。准确的量可以根据很多因素而改变，这些因素包括治疗组合物的组分和物理性质，预期的患者群体、个体患者考虑等，但不限于此，并且可以由本领域技术人员容易地确定。当完全考虑这些因素时，重要的是给予足以在没有副作用的同时获得最大效果的最小量，并且该剂量可以由本领域专家容易地确定。
[0089]
不具体限制本发明的药物组合物的剂量，但是根据多个因素改变该剂量，这些因素包括健康状况和体重、患者的疾病严重性和药物类型、给予途径和给予时间。可以以每天单剂量或多剂量以通常在包括大鼠、小鼠、牛、人等在内的哺乳动物中允许的途径例如口服、直肠、静脉、皮下、子宫内或脑室内给予组合物。
[0090]
实施例
[0091]
以下，会参考以下实施例详细描述本发明。但是，以下实施例仅用于示例性说明本发明，并且会对本领域普通技术人员显而易见的是，这些实施例仅用作示例说明的目的，并且不被解释为被限制到这些实施例。
[0092]
实施例1：用于从免疫文库中产生抗msln抗体的方法
[0093]
目的是使用抵抗在癌细胞表面过表达的间皮素(msln)的抗体产生抗癌抗体治疗剂。
[0094]1‑
1：抗msln抗体的选择
[0095]
用重组人msln免疫小鼠，并且去除脾以提取b淋巴细胞。从b淋巴细胞中分离总rna，并合成cdna。使用聚合酶链式反应(pcr)从合成的cdna克隆小鼠的多种抗体基因，并且将该抗体基因插入pcomb3x噬菌粒以产生展示具有多种序列的抗体片段的抗体文库。为了从抗体文库中找到与人msln特异性结合的抗体，将具有固定于其上的msln的磁珠与抗体文库混合，并且分离和培养与靶抗原结合的克隆。然后通过酶联免疫吸附试验(elisa)分别鉴定与靶抗原(人msln)特异性结合的克隆(mi323、mi329、mi403和mi407)，并且通过碱基顺序分析鉴定抗体基因序列和其氨基酸序列。
[0096]
因此，如表1中所示，能够选择到与人msln特异性结合的克隆，并且鉴定了其氨基酸序列。
[0097]
表2示出了依据kabat编号，表1的克隆抗体的cdr氨基酸序列。
[0098]
【表1】
[0099][0100]
【表2】
[0101][0102]1‑
2：mi323、mi329、mi403和mi407单克隆抗体的igg基因克隆
[0103]
提取pcomb3x噬菌粒，所述噬菌粒含有编码mi323、mi329、mi403和mi407克隆抗体的重链可变区的基因，并且将该噬菌粒用作模板用于pcr，pcr使用含有noti的正向引物(表3：seq id no:31至34)和含有apai的反向引物(表3：seq id no:35)使用accupower pfu pcr premix(bioneer)。通过暴露于94℃10分钟，然后暴露于94℃15秒、56℃30秒和72℃90秒，重复30次，然后在72℃反应持续10分钟，进行pcr。在扩增的基因中，在1％琼脂糖凝胶上确认具有期望大小的dna条带，并且分别使用凝胶提取试剂盒分离dna条带。然后，使分离的基因与noti、apai限制性内切酶在37℃反应持续12小时或更长，并且再次在1％琼脂糖凝胶上分离与限制性内切酶反应的基因。还通过以上相同方法切割含有人1型免疫球蛋白重链恒定区(igg1重链恒定区)基因的pciw质粒载体，并且在琼脂糖凝胶上将其分离。通过使用t4dna连接酶(cat.no.m0203s,new england biolabs(neb))将分离的mi323、mi329、mi403和mi407重链可变区基因插入含有人重链恒定区的线性pciw载体的noti、apai位点。将连接反应物质转化到xl1
‑
blue细菌(电穿孔感受性细胞；cat.no.200228,stratagene)中，将其
铺到含有羧苄青霉素的lb平板(cat.no.ln004ca,naraebiotech)上，并且在37℃培养持续12小时或更长。然后选择并培养单菌落，并且通过使用质粒小试剂盒(cat.no.27405,qiagen)分离质粒，并且通过dna测序确认。
[0104]
提取pcomb3x噬菌粒，所述噬菌粒含有编码mi323、mi329、mi403和mi407克隆抗体的轻链可变区的基因，并且将该噬菌粒用作模板用于mi323、mi329、mi403和mi407克隆抗体的轻链可变区的pcr，其中该pcr使用含有noti的正向引物(表3：seq id no:36、38、40、42)和反向引物(表3：seq id no:37、39、41、43)通过使用accupower pfu pcr premix进行。此外，对人抗体κ轻链恒定区进行pcr，该pcr使用正向引物(表3：seq id no:44)和含有hind iii的反向引物(表3：seq id no:45)。通过暴露于94℃10分钟，然后暴露于94℃15秒、56℃30秒和72℃90秒，重复30次，然后在72℃反应持续10分钟，进行pcr。在扩增的基因中，在1％琼脂糖凝胶上确认具有期望大小的dna条带，并且分别使用凝胶提取试剂盒分离dna条带。然后，将各自的轻链可变区和轻链恒定区混合，随后进行重叠pcr，使得克隆表达轻链区的基因。通过重复暴露于94℃持续10分钟，然后30次的暴露于94℃持续15秒、56℃持续30秒和72℃持续90秒，并且在72℃反应持续10分钟，进行pcr。在扩增的基因中，在1％琼脂糖凝胶上确认具有期望大小的dna条带，并且分别使用凝胶提取试剂盒分离dna条带。然后，使分离的基因与noti、hind iii限制性内切酶在37℃反应持续12小时或更长，并且再次在1％琼脂糖凝胶上分离与限制性内切酶反应的基因。还通过以上相同方法切割pciw质粒载体，并且在琼脂糖凝胶上将其分离。通过使用t4 dna连接酶(cat.no.m0203s,new england biolabs(neb))将分离的mi323、mi329、mi403和mi407轻链区基因插入线性pciw载体的noti、hindiii位点。将连接反应物质转化到xl1
‑
blue细菌(电穿孔感受性细胞；cat.no.200228,stratagene)中，将其铺到含有羧苄青霉素的lb平板(cat.no.ln004ca,naraebiotech)上，并且在37℃培养持续12小时或更长。然后选择并培养单菌落，并且通过使用质粒小试剂盒(cat.no.27405,qiagen)分离质粒，并且通过dna测序确认。
[0105]
【表3】
[0106][0107]1‑
3：mi323、mi329、mi403和mi407克隆抗体的igg的产生和纯化
[0108]
为了产生和纯化通过小鼠免疫应答获得的抗msln抗体mi323、mi329、mi403和mi407克隆，在转染前一天以2.0x106个细胞/ml的浓度孵育expi293f
tm
细胞。孵育(37℃,8％co2,125rpm)24小时后，添加expi293
tm
表达培养基(cat.no.a1435101,gibco)，以制备具有
2.5x 106个细胞/ml浓度的30ml的产物(存活率＝95％)。将30μg的dna(pciw
‑
ms502重链可变区：15μg，pciw
‑
抗间皮素轻链可变区：15μg)稀释在optipro
tm sem培养基(cat.no.12309019,gibco)中，以得到1.5ml的总体积，并且在室温下反应5分钟。将1.5ml的optipro
tm sem培养基(cat.no.12309019,gibco)与80μl的expifectamine
tm 293试剂(cat.no.a14524,gibco)混合，使得总体积为1.5ml，并且在室温下反应5分钟。反应5分钟后，将1.5ml的稀释的dna与1.5ml的稀释的expifectamine
tm 293试剂彼此很好地混合，并且在室温下反应20至30分钟。在expi293f
tm
细胞中处理3ml的dna和expifectamine
tm 293试剂的混合物。悬浮培养(37℃,8％co2,125rpm)16至18小时后，向其中添加150μl的expifectamine
tm 293增强剂1(cat.no.a14524,gibco)和1.5ml的expifectamine
tm 293增强剂2(cat.no.a14524,gibco)，随后悬浮培养5天。培养后，通过在4000rpm下离心20分钟去除细胞碎片，并且使上清液穿过0.22μm过滤器以被制备。对于，制备100μl的蛋白质a树脂mabselect xtra(cat.no.17
‑
5269
‑
02,ge healthcare)用于每30ml的培养液，随后在1000rpm下离心2分钟以除去存储溶液，并且将获得的产物用400μl的蛋白质a结合缓冲液(cat.no.21007,pierce)洗涤3次。将蛋白质a树脂添加到制备的培养液中，并且在室温下旋转反应30分钟。将培养液与树脂的混合物放到pierce spin column snap
‑
cap(cat.no.69725,thermo)中，然后，使用qiavac 24plus(cat.no.19413,qiagen)真空歧管仅将树脂留在柱中。添加5ml的蛋白质a结合缓冲液以洗涤树脂，向其中加入200μl的蛋白质a洗脱缓冲液(cat.no.21009,pierce)。通过在室温下重悬2分钟使所得的物质反应，并且在1000rpm下离心1分钟，并且洗脱。通过添加2.5μl的1.5m tris
‑
hcl(ph 9.0)来中和每个洗脱液。进行4至6次洗脱，并且通过使用nanodrop 200c(thermo scientific)对每个级分定量。收集其中检测出蛋白质的级分，并且使用zeba spin desalting columns,7k mwco,5ml(cat.no.0089892,pierce)与pbs(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液进行交换。然后，在还原和非还原条件下进行蛋白质电泳(sds
‑
page)，以最终核实浓度定量和抗体状态，并且将抗体保持在4℃。
[0109]
实施例2：用于从噬菌体展示合成的scfv文库产生抗msln抗体的方法
[0110]2‑
1：使用噬菌体展示的抗人msln的scfv抗体的选择
[0111]
为了第一淘选，使1ml的10
13
或更多的文库储备在37℃下在用msln包被的固相聚苯乙烯管(cat.no.444202,nunc)中反应2小时。同时，用10μl的sb 10ml/四环素孵育10μl的xl1
‑
blue细菌(电穿孔感受性细胞；cat.no.200228,stratagene)，并且将细菌培养至od
600
为0.8至1.0。将在37℃下反应2小时后获得的文库储备用5ml的0.05％吐温20/pbs洗涤四次，并且从第二淘选开始，用0.05％吐温20/pbs洗涤的次数随着淘选次数的增加而增加。然后，将所得物质用1％bsa/0.1m甘氨酸ph2.0在室温下培养10分钟以纯化噬菌粒。将纯化的噬菌粒转移到50ml管中，并且用70μl的2m tris中和。处理9ml的xl1
‑
blue细菌(电穿孔感受性细胞；cat.no.200228,stratagene)并且在洗涤的管中处理1ml的细菌。在室温下感染细菌30分钟，并且向其中加入10ml的sb、20μl的四环素、10μl的羧苄青霉素，随后在37℃和220rpm下悬浮培养1小时。然后，将细菌用1ml的vcs m13辅助噬菌体(10
11
pfu)处理，将其在37℃和220rpm下悬浮培养1小时，并且用80ml的sb、100μl的卡那霉素和100μl的羧苄青霉素处理，并且在37℃和220rpm下培养12小时或更长。将培养超过12小时的细菌在3500rpm和4℃下离心10分钟，并且将上清液转移到新管中。向其中加入20ml的20％peg/15％nacl，混合
均匀，并且在冰里反应30分钟。然后，弃置上清液，收集片状沉淀并且用2ml的1％bsa/pbs在8000rpm和4℃下重悬片状沉淀30分钟，并且在15000rpm和4℃下离心10分钟。在此，弃置收集的片状沉淀，并且将上清液(2ml)中的1ml保存在
‑
20℃下，将剩余物(1ml)用于以下顺序淘选。
[0112]2‑
2：根据elisa获得个体克隆(individual clone)
[0113]
收集噬菌体展示合成scfv文库最终扩增的群体的单克隆，并且在37℃下以220rpm用1.5ml的sb/羧苄青霉素培养至od 600为0.8至1.0，然后在30℃下以200rpm用1mm iptg培养12小时或更长。将反应物质在5500rpm下离心5分钟，仅将每个上清液添加至含有下层(underlying)msln抗原的elisa板，并且在室温下反应2小时。然后，将所得物质用pbst(1xpbs,0.05％吐温20)洗涤4次，并且向其中加入用1％bsa/1xpbs稀释5000倍的hrp/anti
‑
hfab
‑
hrp缀合物，并且在室温下反应1小时，用pbst(1xpbs,0.05％吐温20)洗涤4次。然后，向其中加入tmb溶液并且反应5至10分钟，并向其中加入tmb终止溶液。接下来，使用tecan sunrise在450nm的测量波长下测量o.d值，并获得具有高o.d.值的克隆作为个体克隆。
[0114]
因此，如表4中所示，能够选择到与人msln特异性结合的克隆，并且鉴定了其氨基酸序列。
[0115]
表5示出了依据kabat编号，表4的克隆抗体的cdr氨基酸序列。
[0116]
【表4】
[0117]
[0118][0119]
【表5】
[0120][0121]2‑
3：抗间皮素抗体的igg基因克隆
[0122]
提取pcomb3x噬菌粒，所述噬菌粒含有编码获得的ms501、ms502、ms503、ms504、
ms505和ms506克隆抗体的轻链可变区的基因，并且将该噬菌粒用作模板用于ms501、ms502、ms503、ms504、ms505和ms506克隆抗体的轻链可变区的pcr，其中pcr使用含有noti的正向引物(seq id no:86)和反向引物(表3：seq id no:87)通过使用accupower pfu pcr premix(bioneer)进行。此外，对人抗体κ轻链恒定区进行使用正向引物(表6：seq id no:88)和反向引物(表6：seq id no:89)的pcr。通过重复暴露于94℃持续10分钟，然后30次的暴露于94℃持续15秒、56℃持续30秒和72℃持续90秒，并且在72℃反应持续10分钟，进行pcr。在扩增的基因中，在1％琼脂糖凝胶上确认具有期望大小的dna条带，并且分别使用凝胶提取试剂盒分离dna条带。然后，将各自的轻链可变区和轻链恒定区混合，随后进行重叠pcr，使得克隆表达轻链区的基因。通过重复暴露于94℃持续10分钟，然后30次的暴露于94℃持续15秒、56℃持续30秒和72℃持续90秒，并且在72℃反应持续10分钟，进行pcr。在扩增的基因中，在1％琼脂糖凝胶上确认具有期望大小的dna条带，并且分别使用凝胶提取试剂盒分离dna条带。然后，使分离的基因与noti、hind iii限制性内切酶在37℃反应持续12小时或更长，并且再次在1％琼脂糖凝胶上分离与限制性内切酶反应的基因。还通过以上相同方法切割pciw质粒载体，并且在琼脂糖凝胶上将其分离。通过使用t4 dna连接酶(cat.no.m0203s,new england biolabs(neb))将分离的ms501、ms502、ms503、ms504、ms505和ms506轻链区基因插入线性pciw载体的noti、hindiii位点。将连接反应物质转化到xl1
‑
blue细菌(电穿孔感受性细胞；cat.no.200228,stratagene)中，将其铺到含有羧苄青霉素的lb平板(cat.no.ln004ca,naraebiotech)上，并且在37℃培养持续12小时或更长。然后选择并培养单菌落，并且通过使用质粒小试剂盒(cat.no.27405,qiagen)分离质粒，并且通过dna测序确认。
[0123]
提取pcomb3x噬菌粒，所述噬菌粒含有编码ms501、ms502、ms503、ms504、ms505和ms506克隆抗体的重链可变区的基因，并且将该噬菌粒用作模板用于pcr，pcr使用含有noti的正向引物(表6：seq id no:90)和含有apai的反向引物(表6：seq id no:91)使用accupower pfu pcr premix(bioneer)。通过重复暴露于94℃持续10分钟，然后30次的暴露于94℃持续15秒、56℃持续30秒和72℃持续90秒，并且在72℃反应持续10分钟，进行pcr。在扩增的基因中，在1％琼脂糖凝胶上确认具有期望大小的dna条带，并且分别使用凝胶提取试剂盒分离dna条带。然后，使分离的基因与noti、apai限制性内切酶在37℃反应持续12小时或更长，并且再次在1％琼脂糖凝胶上分离与限制性内切酶反应的基因。还通过以上相同方法切割含有人1型免疫球蛋白重链恒定区(igg1重链恒定区)基因的pciw质粒载体，并且在琼脂糖凝胶上将其分离。通过使用t4 dna连接酶(cat.no.m0203s,new england biolabs(neb))将分离的ms501、ms502、ms503、ms504、ms505和ms506重链可变区基因插入含有人重链恒定区的线性pciw载体的noti、apai位点。将连接反应物质转化到xl1
‑
blue细菌(电穿孔感受性细胞；cat.no.200228,stratagene)中，将其铺到含有羧苄青霉素的lb平板(cat.no.ln004ca,naraebiotech)上，并且在37℃培养持续12小时或更长。然后选择并培养单菌落，并且通过使用质粒小试剂盒(cat.no.27405,qiagen)分离质粒，并且通过dna测序确认。
[0124]
【表6】
[0125][0126]2‑
4：ms501、ms502、ms503、ms504、ms505和ms506克隆抗体的产生和纯化
[0127]
为了产生和纯化从噬菌体展示scfv文库获得的ms501、ms502、ms503、ms504、ms505和ms506克隆抗体，在转染前一天以2.5x106个细胞/ml的浓度孵育expi293f
tm
细胞。孵育(37℃,8％co2,125rpm)24小时后，添加expi293
tm
表达培养基(cat.no.a1435101,gibco)，以制备具有2.5x106个细胞/ml浓度的30ml的产物(存活率＝95％)。将30μg的dna(pciw
‑
ms502重链可变区：15μg，pciw
‑
抗
‑
msln轻链可变区：15μg)稀释在optipro
tm sem培养基(cat.no.12309019,gibco)中，以得到1.5ml的总体积，并且在室温下反应5分钟。将1.5ml的optipro
tm sem培养基(cat.no.12309019,gibco)与80μl的expifectamine
tm 293试剂(cat.no.a14524,gibco)混合，使得总体积为1.5ml，并且在室温下反应5分钟。反应5分钟后，将1.5ml的稀释的dna与1.5ml的稀释的expifectamine
tm 293试剂彼此很好地混合，并且在室温下反应20至30分钟。在expi293f
tm
细胞中处理3ml的dna和expifectamine
tm 293试剂的混合物。悬浮培养(37℃,8％co2,125rpm)16至18小时后，向其中添加150μl的expifectamine
tm 293增强剂1(cat.no.a14524,gibco)和1.5ml的expifectamine
tm 293增强剂2(cat.no.a14524,gibco)，随后悬浮培养5天。培养后，通过在4000rpm下离心20分钟去除细胞碎片，并且使上清液穿过0.22μm过滤器以被制备。制备100μl的蛋白质a树脂mabselect xtra(cat.no.17
‑
5269
‑
02,ge healthcare)用于每30ml的培养液，随后在1000rpm下离心2分钟以除去存储溶液，并且将产物用400μl的蛋白质a结合缓冲液(cat.no.21007,pierce)洗涤3次。将蛋白质a树脂添加到制备的培养液中，并且在室温下旋转反应30分钟。将培养液与树脂的混合物放到pierce spin column snap
‑
cap(cat.no.69725,thermo)中，然后，使用qiavac 24plus(cat.no.19413,qiagen)真空歧管仅将树脂留在柱中。添加5ml的蛋白质a结合缓冲液以洗涤树脂，向其中加入200μl的蛋白质a
洗脱缓冲液(cat.no.21009,pierce)。通过在室温下重悬2分钟使所得的物质反应，并且在1000rpm下离心1分钟，并且洗脱。通过添加2.5μl的1.5m tris
‑
hcl(ph 9.0)来中和每个洗脱液。进行4至6次洗脱，并且通过使用nanodrop 200c(thermo scientific)对每个级分定量。收集其中检测出蛋白质的级分，并且使用zeba spin desalting columns,7k mwco,5ml(cat.no.0089892,pierce)与pbs(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液进行交换。然后，在还原和非还原条件下进行蛋白质电泳(sds
‑
page)，以最终核实浓度定量和抗体状态，并且将抗体保持在4℃。
[0128]2‑
5：抗msln抗体对于抗原的定量结合力的测量
[0129]
通过使用biacore t
‑
200(ge healthcare,美国)生物传感器测量纯化的抗msln抗体即mi323、mi329、mi403、ms502克隆抗体对于重组人间皮素(msln)的定量结合力(亲和性)。通过使用胺
‑
羧基反应将从hek293细胞纯化的msln(cat.no.3265
‑
ms,r&d systems)固定到cm5芯片(ge healthcare,美国)上，以满足200rmax。然后，允许用hbs
‑
ep缓冲液(10mm hepes,ph7.4,150mm nacl,3mm edta,0.005％表面活性剂p20)系列稀释的克隆c2g1抗体、克隆c2g4抗体或克隆c3c8抗体以0.078nm至5nm的浓度范围和30μl/min的流速流动，用于进行120秒的缔合和1800秒的解离。通过使10mm甘氨酸
‑
hcl ph 1.5以30μl/min的流速流动30秒，诱导与msln结合的抗体的解离(表7)。通过使用biacore t
‑
200评估软件获得作为运动速度常数(k
on
和k
off
)和平衡解离常数(k
d
)的亲和性(表8)。
[0130]
【表7】
[0131]
sprbiacore t200芯片cm5运行缓冲液hbs
‑
ep ph7.4流速30μl/min缔合/解离时间120sec/600secigg浓度0.078～5nm,1/2系列稀释再生10mm甘氨酸
‑
hcl ph1.5,30sec
[0132]
【表8】
[0133] k
on
k
off
k
d
mi3232.7x1054.8x10
‑51.8x10
‑
10
mi3291.4x1065.1x10
‑53.5x10
‑
11
mi4038.9x1044.0x10
‑54.5x10
‑
10
ms5021.9x1074.3x10
‑32.3x10
‑
10
[0134]
实施例3：用于产生ms502克隆亲和性成熟抗体的方法
[0135]3‑
1：ms502克隆亲和性成熟文库的设计
[0136]
将抗间皮素ms502克隆的氨基酸序列输入swiss model主页(http://swissmodel.expasy.org/)以找到模板序列。基于同源序列发现50条序列，并且通过指定每条序列为模板进行建模。基于qmean4值(cβ，所有原子，溶剂化作用，扭力)按优先级列出50条序列，并且除了qmean4之外还考虑序列同一性和分辨率选择模板。选择3g6a.1.b用于重链可变区，选择3qhz.1.b(lcdr1,2)和4o5l.1.a(lcdr3)用于轻链可变区。通过pymol程序分析基于所选择模板获得的ms502结构，基于cdr的突出的氨基酸来选择抗原互补位(参见图
1)。由于tyr和lys是通常对结合具有积极作用的氨基酸，将vl cdr2y49、y50、k53从突变候选氨基酸中排除，虽然预计它们是抗原互补位。使用handmix primer(idt,美国)通过50％保留现有序列、增加tyr、ser、gly比率和控制核苷酸序列使得一律包括亲水性、疏水性、带正电荷和带负电荷的比率，来设计突变的引入。由于将突变引入cdr1、cdr2和cdr3中的全部，将重链可变区分成三个片段中的每个，并且使它们进行片段pcr和重叠pcr以构建文库，并且由于仅将突变引入cdr1和cdr3，将轻链可变区分成两个片段中的每个，并且使它们进行片段pcr和重叠pcr以构建文库。
[0137]
根据在重链可变区的情况下引入突变的文库的理论大小是5.83x10
10
，并且根据在轻链可变区的情况下引入突变的文库的理论大小是2.16x104。
[0138]
【表9】
[0139][0140]3‑
2：轻链可变区文库的构建
[0141]
为了将突变引入文库，首先，将轻链可变区分成2部分，并且对其进行片段pcr。1号
轻链可变区片段使用抗间皮素ms502克隆的轻链可变区基因序列作为模板，并且向其中加入正向引物(seq id no:93)和反向引物(seq id no:94)，并且2号轻链可变区片段使用抗间皮素ms502克隆的轻链可变区基因序列作为模板，并且向其中加入正向引物(表10：seq id no:95)和反向引物(表10：seq id no:96)，然后，使用primestar polymerase premix(takara)对每个片段进行pcr。通过重复暴露于98℃持续2分钟，然后30次的暴露于98℃持续10秒、60℃持续15秒和72℃持续20秒，并且在72℃反应持续10分钟，进行pcr。在扩增的基因中，在1％琼脂糖凝胶上确认具有期望大小的dna条带，并且分别使用凝胶提取试剂盒(qiaquick gel extraction kit,cat.no.28706,qiagen)分离dna条带。轻链恒定区使用轻链λ区作为模板，并且向其中加入正向引物(表10：seq id no:97)和反向引物(表10：seq id no:98)，并且使用primestar polymerase premix对每个片段进行pcr。通过重复暴露于98℃持续2分钟，然后30次的暴露于98℃持续10秒、60℃持续15秒和72℃持续30秒，并且在72℃反应持续10分钟，进行pcr。在扩增的基因中，在1％琼脂糖凝胶上确认具有期望大小的dna条带，并且分别使用凝胶提取试剂盒分离dna条带。将摩尔比率为1:1:1的获得的轻链可变区片段1和2以及轻链恒定区用作模板，并且向其中加入正向引物(seq id no:92)和反向引物(seq id no:98)，并且使用primestar polymerase premix对每个片段进行pcr。通过重复暴露于98℃持续2分钟，然后30次的暴露于98℃持续20秒、60℃持续30秒和72℃持续60秒，并且在72℃反应持续10分钟，进行pcr。在扩增的基因中，在1％琼脂糖凝胶上确认具有期望大小的dna条带，并且使用凝胶提取试剂盒分离dna条带，以获得轻链可变
‑
恒定区亲和性成熟基因。使获得的基因与nrui和xbai(neb)限制性内切酶在37℃反应4小时。再次在1％琼脂糖凝胶上分离与限制性内切酶反应的基因。通过使用t4 dna连接酶(cat.no.m0203s,neb)将分离的基因插入含有ms502重链可变
‑
恒定区的线性pcomb3x载体的nrui、xbai位点。将连接反应物质转化到xl1
‑
blue细菌(电穿孔感受性细胞；cat.no.200228,stratagene)中，并且在300ml的lb培养基中在37℃和220rpm下培养1小时。然后，用150μl的羧苄青霉素和300μl的四环素处理所得物质，并且将其在37℃和220rpm下摇动培养1小时。用4.5ml vcs m13辅助噬菌体(10
11
pfu)处理所得物质，并且将其在37℃和220rpm下摇动培养1小时，并且用300μl的卡那霉素和300μl的羧苄青霉素处理，并且在37℃和220rpm下培养过夜。第二天，将培养的细胞在4000rpm下离心20分钟，并且将上清液转移到新管中。为了沉淀噬菌体，使用5x peg/nacl以将1x peg/nacl添加到上清液中，并且允许获得的产物在冰上静置超过30分钟。将沉淀物噬菌体在8000rpm下离心30分钟。弃置上清液并且用10ml的pbs重悬沉淀的噬菌体。为了除去细胞碎片，将溶解在10ml的pbs中的噬菌体在14,000rpm下离心10分钟以分离上清液，并且保存在4℃。通过1小时的转化之后取100μl的培养液，以系列稀释方式将培养液铺在含有羧苄青霉素的lb板(cat.no.ln004ca,naraebiotech)上，在37℃下培养12小时或更长，并且对菌落计数，来确认文库大小。
[0142]3‑
3：重链可变区文库的构建
[0143]
为了将突变引入文库，首先，将重链可变区分成3部分，并且对其进行片段pcr。1号重链可变区片段使用抗间皮素ms502克隆的重链可变区基因序列作为模板，并且向其中加入正向引物(表10：seq id no:99)和反向引物(表10：seq id no:100)，并且2号重链可变区片段使用抗间皮素ms502克隆的重链可变区基因序列作为模板，并且向其中加入正向引物(表10：seq id no:101)和反向引物(表10：seq id no:102)，并且3号重链可变区片段使用
抗间皮素ms502克隆的重链可变区基因序列作为模板，并且向其中加入正向引物(表10：seq id no:103)和反向引物(表10：seq id no:104)，然后，使用primestar polymerase premix(takara)对每个片段进行pcr。通过重复暴露于98℃持续2分钟，然后30次的暴露于98℃持续10秒、60℃持续15秒和72℃持续20秒，并且在72℃反应持续10分钟，进行pcr。在扩增的基因中，在1％琼脂糖凝胶上确认具有期望大小的dna条带，并且分别使用凝胶提取试剂盒分离dna条带。将摩尔比率为1:1:1的获得的重链可变区片段1、2和3用作模板，并且向其中加入正向引物(表10：seq id no:99)和反向引物(表10：seq id no:106)，并且使用primestar polymerase premix对每个片段进行pcr。通过重复暴露于98℃持续2分钟，然后30次的暴露于98℃持续20秒、60℃持续30秒和72℃持续60秒，并且在72℃反应持续10分钟，进行pcr。在扩增的基因中，在1％琼脂糖凝胶上确认具有期望大小的dna条带，并且使用凝胶提取试剂盒分离dna条带，以收获重链可变区亲和性成熟基因。使收获的基因与xhoi和apai(neb)限制性内切酶在37℃下反应4小时。再次在1％琼脂糖凝胶上分离与限制性内切酶反应的基因。通过使用t4 dna连接酶(cat.no.m0203s,neb)将分离的基因插入含有ms502轻链可变
‑
恒定区的线性pcomb3x载体的xhoi、apai位点。将连接反应物质转化到xl1
‑
blue细菌(电穿孔感受性细胞；cat.no.200228,stratagene)中，并且在300ml的lb培养基中在37℃和220rpm下培养1小时。然后，用150μl的羧苄青霉素和300μl的四环素处理所得物质，并且将其在37℃和220rpm下悬浮培养1小时。用4.5ml vcs m13辅助噬菌体(10
11
pfu)处理所得物质，并且将其在37℃和220rpm下摇动培养1小时，并且用300μl的卡那霉素和300μl的羧苄青霉素处理，并且在37℃和220rpm下培养过夜。第二天，将培养的细胞在4000rpm下离心20分钟，并且将上清液转移到新管中。为了沉淀噬菌体，使用5x peg/nacl以将1x peg/nacl添加到上清液中，并且允许获得的产物在冰上静置超过30分钟。将沉淀的噬菌体在8000rpm下离心30分钟。弃置上清液并且用10ml的pbs重悬沉淀的噬菌体。为了除去细胞碎片，将溶解在10ml的pbs中的噬菌体在14,000rpm下离心10分钟以分离上清液，并且保存在4℃。通过1小时的转化之后取100μl的培养液，以系列稀释方式将培养液铺在含有羧苄青霉素的lb板(cat.no.ln004ca,naraebiotech)上，在37℃下培养12小时或更长，并且对菌落计数，来确认文库大小。
[0144]
【表10】
[0145][0146]
在表10中，x密码子是退化密码子，其中每个acgt被控制在特定比率，并且能够控制待翻译的氨基酸的比率。作为示例，对于seq id no:102的nx1x2，x1以10％的a，10％的c，
70％的g和10％的t编码，并且x2以10％的a，70％的c，10％的g和10％的t编码。这被设计为用于反向引物，并且因此，如果其被转变为正向方向，其是x2x1n密码子，其中x2以10％的a，70％的c，10％的g和10％的t编码，并且x1以10％的a,10％的c,70％的g和10％的t编码。因此，重链可变区cdr1的kabat第31号被翻译成氨基酸tyr 7％、ser 8％、gly 1％、his 7％、asp 7％、phe 1％、thr 7％、asn 49％、ala 1％、val 1％、leu 1％、ile 7％、pro 1％、cys 1％。
[0147]3‑
4：轻链可变区突变抗体的选择
[0148]
将1ml的浓度为1μg/ml的重组人蛋白msln放到固相聚苯乙烯管(cat.no.444202,nunc)中，用5ml的0.05％pbst洗涤在4℃下包被12小时或更长的管3次。将5ml的1％bsa/pbs放到msln包被的免疫管中，随后在室温下阻断2小时。从免疫管中除去阻断缓冲液，然后在管中处理轻链可变区噬菌体文库并且在室温下反应2小时。然后，将获得的产物用5ml的pbst洗涤四次。用1ml的甘氨酸(ph 2.0)洗脱缓冲液处理免疫管，并且在室温下反应10分钟，以获得上清液。洗脱后，将100μl的1.5m tris
‑
cl(ph 8.8)添加至噬菌体，并中和。用中和的噬菌体处理10ml的培养约2小时(od
600
＝0.8
‑
1.0)的xl1
‑
blue细菌(电穿孔感受性细胞；cat.no.200228,stratagene)。在室温下感染30分钟后，将10ml的sb、20μl的四环素(50mg/ml)和10μl的羧苄青霉素(100mg/ml)添加到10ml的感染的xl1
‑
blue细菌(电穿孔感受性细胞；cat.no.200228,stratagene)，并且在37℃下摇动(200rpm)培养1小时。用1ml的vcsm13辅助噬菌体(>10
11
pfu/ml)处理细菌，并且在37℃下摇动培养1小时。1小时孵育之后，用80ml的sb、100μl的卡那霉素和100μl的羧苄青霉素(100mg/ml)处理细菌，并且在37℃下培养(200rpm)过夜。将过夜培养的文库在4000rmp下离心15分钟以仅分离上清液，并且使用5x peg/nacl以将1x peg/nacl添加到上清液中，并且允许获得的产物在冰上静置超过30分钟。通过在8000rpm下离心30分钟除去上清液，并且用2ml的1％bsa/pbs重悬片状沉淀物，并且在12000rpm下离心10分钟。然后仅取上清液，并且将其用于以下顺序淘选中。重复该过程4次。
[0149]3‑
5：重链可变区突变抗体的选择
[0150]
用50μl的链霉亲和素微珠(miltenyl biotec 130
‑
048
‑
101)除去上清液，并且向其中加入1ml的pbs以进行洗涤3次。将1ml的含有1％bsa的pbs添加至珠，并且在室温下将珠旋转2小时，随后阻断。将50nm msln放到500μl的pbs中，并且将其与500μl的ms502 vh合理的文库噬菌体混合，并且在室温下旋转反应1小时。将阻断缓冲液从珠中除去，并且用含有msln和噬菌体的溶液处理珠，并且在室温下反应15分钟。然后，将获得的产物用1ml的pbst洗涤六次。用1ml的甘氨酸(ph 2.0)洗脱缓冲液处理珠，并且在室温下反应10分钟以获得上清液。洗脱后，将100μl的1.5m tris
‑
cl(ph 8.8)添加至噬菌体，并中和。用中和的噬菌体处理10ml的培养约2至2.5小时(od
600
＝0.8
‑
1.0)的xl1
‑
blue细菌(电穿孔感受性细胞；cat.no.200228,stratagene)。在室温下感染30分钟后，将10ml的sb、20μl的四环素(50mg/ml)和10μl的羧苄青霉素(100mg/ml)添加到10ml的感染的xl1
‑
blue细菌(电穿孔感受性细胞；cat.no.200228,stratagene)，并且在37℃下摇动(200rpm)培养1小时。用1ml的vcsm13辅助噬菌体(>10
11
pfu/ml)处理细菌，并且在37℃下悬浮培养(200rpm)1小时。1小时孵育之后，用80ml的sb、100μl的卡那霉素和100μl的羧苄青霉素(100mg/ml)处理细菌，并且在37℃下培养(200rpm)过夜。将过夜培养的文库在4000rmp下离心15分钟以仅分离上清液，并且使
用5x peg/nacl以将1x peg/nacl添加到上清液中，并且允许获得的产物在冰上静置超过30分钟。通过在8000rpm下离心30分钟除去上清液，并且用2ml的1％bsa/pbs重悬片状沉淀物，并且在12000rpm下离心10分钟。然后仅取上清液，并且将其用于以下顺序淘选中。通过使用ms502v
h
合理的文库噬菌体进行总共第一、第二和第三针对msln的珠淘选。作为第二和第三淘选的结果，确认输出滴度增加，这表明抗msln的抗体被扩增。
[0151]3‑
6：根据elisa的个体克隆的收获
[0152]
收集轻链/重链可变区的每个文库的最终扩增的群体的单菌落，并且在37℃和220rpm下用1.5ml的sb/羧苄青霉素培养直至od 600为0.8至1.0，然后在30℃和200rpm下用1mm iptg培养12小时或更长。将反应物质在5500rpm下离心5分钟，并且仅将每个上清液添加至含有下层msln抗原的elisa板，并且在室温下反应2小时。然后，将所得物质用pbst(1xpbs,0.05％吐温20)洗涤4次，并且向其中加入用1％bsa/1xpbs稀释5000倍的hrp/anti
‑
hfab
‑
hrp缀合物，并且在室温下反应1小时，用pbst(1xpbs,0.05％吐温20)洗涤4次。然后，加入tmb溶液并且允许其静置5至10分钟，并向其中加入tmb终止溶液。接下来，使用tecan sunrise在450nm的测量波长下测量o.d值，并获得具有高o.d.值的克隆作为个体克隆。
[0153]
因此，如表11中所示，能够选择到与人msln特异性结合的克隆，并且鉴定了其氨基酸序列。
[0154]
表12示出了依据kabat编号，表11的克隆抗体的cdr氨基酸序列。
[0155]
【表11】
[0156]
[0157]
[0158][0159]
【表12】
[0160]
[0161][0162]3‑
7：使用spr进行个体克隆的结合力的相对比较和选择
[0163]
为了比较和测量从根据在实施例3
‑
3中执行的elisa的个体克隆的确认结果获得的个体克隆的培养液的结合力(in order to compare and measure the binding force with culture fluid of individual clones secured from confirmation of the individual clones according to elisa method conducted in example 3
‑
3)，首先，将在biacore系列s cm5芯片(ge healthcare)上的人msln溶解在ph 4.0的乙酸盐缓冲液中至1μg/ml，并且允许其以10μl/min的流速流动，并且将其固定至1000ru。通过使用ph 7.4的hbs
‑
ep缓冲液将实施例3
‑
6中表达的fab上清液稀释10倍，并且允许其以30μl/min的流速流动用于进行120秒的缔合和180秒的解离，以执行结合分析。使用10mm的甘氨酸
‑
hcl ph1.5缓冲液进行再生(regeneration)持续30秒。比较elisa和spr结合数据并且分析以选择轻链可变区和重链可变区的最终克隆。
[0164]
因此，如图2和3中所示，相对比较了轻链可变区突变和重链可变区突变的结合力，并且选择了c2g1、c2g4和c3c8用于轻链可变区的最终克隆，以及选择了56、2
‑
30、2
‑
58、2
‑
73和2
‑
78用于重链可变区的最终克隆。
[0165]3‑
8：克隆ms502轻链可变区突变抗体的igg基因克隆
[0166]
通过使用primestar hs dna聚合酶(cat.no.r010b；takara)和含有noti的正向引物(表6：seq id no:86)和反向引物(表6：seq id no:87)对作为模板的获得的轻链可变区c2g1、c2g4和c3c8基因中的每个进行pcr。此外，对人抗体κ轻链恒定区进行使用正向引物(表6：seq id no:88)和反向引物(表6：seq id no:89)的pcr。通过重复暴露于94℃持续10分钟，然后30次的暴露于94℃持续15秒、56℃持续30秒和72℃持续90秒，并且在72℃反应持续10分钟，进行pcr。在扩增的基因中，在1％琼脂糖凝胶上确认具有期望大小的dna条带，并且分别使用凝胶提取试剂盒分离dna条带。然后，将各自的轻链可变区和轻链恒定区混合，随后进行重叠pcr，使得克隆表达轻链区的基因。通过重复暴露于94℃持续10分钟，然后30
次的暴露于94℃持续15秒、56℃持续30秒和72℃持续90秒，并且在72℃反应持续10分钟，进行pcr。在扩增的基因中，在1％琼脂糖凝胶上确认具有期望大小的dna条带，并且分别使用凝胶提取试剂盒分离dna条带。然后，使分离的基因与noti、hind iii限制性内切酶在37℃反应12小时或更长，并且再次在1％琼脂糖凝胶上分离与限制性内切酶反应的基因。还通过以上相同方法切割pciw质粒载体，并且在琼脂糖凝胶上将其分离。通过使用t4 dna连接酶(cat.no.m0203s,new england biolabs(neb))将分离的c2g1、c2g4和c3c8轻链区基因插入线性pciw载体的noti、hindiii位点。将连接反应物质转化到xl1
‑
blue细菌(电穿孔感受性细胞；cat.no.200228,stratagene)中，将其铺到含有羧苄青霉素的lb平板(cat.no.ln004ca,naraebiotech)上，并且在37℃培养12小时或更长。然后选择并培养单菌落，并且通过使用质粒小试剂盒(cat.no.27405,qiagen)分离质粒，并且通过dna测序确认。
[0167]3‑
9：克隆ms502重链可变区突变抗体的igg基因克隆
[0168]
通过使用primestar hs dna聚合酶(cat.no.r010b；takara)和含有noti的正向引物(表6：seq id no:90)和含有apai的反向引物(表6：seq id no:91)对作为模板的重链可变区56、2
‑
30、2
‑
58、2
‑
73和2
‑
78基因中的每个进行pcr。通过重复暴露于98℃持续2分钟，然后30次的暴露于98℃持续10秒、58℃持续10秒和72℃持续30秒，并且在72℃反应持续5分钟，进行pcr。在扩增的基因中，在1％琼脂糖凝胶上确认具有期望大小的dna条带，并且分别使用凝胶提取试剂盒分离dna条带。然后，使三种分离的基因与kpni和apai限制性内切酶在37℃下反应4小时。再次在1％琼脂糖凝胶上分离与限制性内切酶反应的基因。还通过以上相同方法切割pciw质粒载体，并且在琼脂糖凝胶上将其分离。通过使用t4 dna连接酶将分离的基因插入含有人重链恒定区的线性pciw载体的noti、apai位点。将连接反应物质转化到xl1
‑
blue细菌(电穿孔感受性细胞；cat.no.200228,stratagene)中，将其铺到含有羧苄青霉素的lb平板(cat.no.ln004ca,naraebiotech)上，并且在37℃培养12小时或更长。然后选择并培养单菌落，并且通过使用质粒小试剂盒(cat.no.27405,qiagen)分离质粒，并且通过dna测序确认。
[0169]3‑
10：克隆ms502轻链可变区突变抗体的igg的产生和纯化
[0170]
为了产生和纯化轻链可变区突变抗体c2g1、c2g4和c3c8，在转染前一天以2.5x106个细胞/ml的浓度孵育expi293f
tm
细胞。孵育(37℃,8％co2,125rpm)24小时后，添加expi293
tm
表达培养基(cat.no.a1435101,gibco)，以制备具有2.5x106个细胞/ml浓度的30ml的产物(存活率＝95％)。将30μg的dna(pciw
‑
ms502重链可变区：15μg，pciw
‑
抗
‑
msln轻链可变区突变体：15μg)稀释在optipro
tm sem培养基(cat.no.12309019,gibco)中，以得到1.5ml的总体积，并且在室温下反应5分钟。将1.5ml的optipro
tm sem培养基(cat.no.12309019,gibco)与80μl的expifectamine
tm 293试剂(cat.no.a14524,gibco)混合，使得总体积为1.5ml，并且在室温下反应5分钟。反应5分钟后，将1.5ml的稀释的dna与1.5ml的稀释的expifectamine
tm 293试剂彼此很好地混合，并且在室温下反应20至30分钟。在expi293f
tm
细胞中处理3ml的dna和expifectamine
tm 293试剂的混合物。悬浮培养(37℃,8％co2,125rpm)16至18小时后，向其中添加150μl的expifectamine
tm 293增强剂1(cat.no.a14524,gibco)和1.5ml的expifectamine
tm 293增强剂2(cat.no.a14524,gibco)，随后悬浮培养5天。培养后，通过在4000rpm下离心20分钟去除细胞碎片，并且使上清液穿过0.22μm过滤器以被制备。制备100μl的蛋白质a树脂mabselect xtra(cat.no.17
‑
5269
‑
02,
ge healthcare)用于每30ml的培养液，随后在1000rpm下离心2分钟以除去存储溶液，并且将获得的产物用400μl的蛋白质a结合缓冲液(cat.no.21007,pierce)洗涤3次。将蛋白质a树脂添加到制备的培养液中，并且在室温下旋转反应30分钟。将培养液与树脂的混合物放到pierce spin column snap
‑
cap(cat.no.69725,thermo)中，然后，使用qiavac 24plus(cat.no.19413,qiagen)真空歧管仅将树脂留在柱中。添加5ml的蛋白质a结合缓冲液以洗涤树脂，并且向其中加入200μl的蛋白质a洗脱缓冲液(cat.no.21009,pierce)。通过在室温下重悬2分钟使所得的物质反应，并且在1000rpm下离心1分钟，并且洗脱。通过添加2.5μl的1.5m tris
‑
hcl(ph 9.0)来中和每个洗脱液。进行4至6次洗脱，并且通过使用nanodrop 200c(thermo scientific)对每个级分定量。收集其中检测出蛋白质的级分，并且使用zeba spin desalting columns,7k mwco,5ml(cat.no.0089892,pierce)与pbs(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液进行交换。然后，在还原和非还原条件下进行蛋白质电泳(sds
‑
page)，以最终核实浓度定量和抗体状态，并且将抗体保持在4℃。
[0171]3‑
11：ms502轻链可变区突变抗体对于msln抗原的定量结合力的测量
[0172]
通过使用biacore t
‑
200(ge healthcare,美国)生物传感器测量纯化的抗msln抗体即ms502克隆轻链可变区突变抗体c2g1、c2g4和c3c8对于重组人间皮素(msln)的定量结合力(亲和性)。通过使用胺
‑
羧基反应将从hek293细胞纯化的msln(cat.no.3265
‑
ms,r&d systems，美国)固定到cm5芯片(ge healthcare,cat.no.br
‑
1005
‑
30)上，以满足200rmax。然后，允许用hbs
‑
ep缓冲液(10mm hepes,ph7.4,150mm nacl,3mm edta,0.005％表面活性剂p20)系列稀释的克隆c2g1抗体、克隆c2g4抗体或克隆c3c8抗体以0.078nm至5nm的浓度范围和30μl/min的流速流动，用于进行120秒的缔合和1800秒的解离。通过使10mm甘氨酸
‑
hcl ph 1.5以30μl/min的流速流动30秒，诱导与msln结合的抗体的解离(表13)。通过使用biacore t
‑
200评估软件获得作为运动速度常数(k
on
和k
off
)和平衡解离常数(k
d
)的亲和性(表14)。
[0173]
【表13】
[0174]
sprbiacore t200芯片cm5运行缓冲液hbs
‑
ep ph7.4流速30μl/min缔合/解离时间120sec/600secigg浓度0.078～5nm,1/2系列稀释再生10mm甘氨酸
‑
hcl ph1.5,30sec
[0175]
【表14】
[0176] k
on
k
off
k
d
c2g17.20x1076.76x10
‑39.39x10
‑
11
c2g41.40x1086.05x10
‑34.32x10
‑
11
c3c85.84x1077.11x10
‑31.22x10
‑
10
[0177]3‑
12：克隆ms502重链可变区突变抗体的igg的产生和纯化
[0178]
为了产生和纯化重链可变区突变抗体56、2
‑
30、2
‑
58、2
‑
73、2
‑
78，在转染前一天以2.5x106个细胞/ml的浓度孵育expi293f
tm
细胞。孵育(37℃,8％co2,125rpm)24小时后，添加
expi293
tm
表达培养基(cat.no.a1435101,gibco)，以制备具有2.5x106个细胞/ml浓度的30ml的产物(存活率＝95％)。将30μg的dna(pciw
‑
ms502重链可变区突变：15μg，pciw
‑
ms502轻链可变区：15μg)稀释在optipro
tm sem培养基(cat.no.12309019,gibco)中，以得到1.5ml的总体积，并且在室温下反应5分钟。将1.5ml的optipro
tm sem培养基(cat.no.12309019,gibco)与80μl的expifectamine
tm 293试剂(cat.no.a14524,gibco)混合，使得总体积为1.5ml，并且在室温下反应5分钟。反应5分钟后，将1.5ml的稀释的dna与1.5ml的稀释的expifectamine
tm 293试剂彼此很好地混合，并且在室温下反应20至30分钟。在expi293f
tm
细胞中处理3ml的dna和expifectamine
tm 293试剂的混合物。悬浮培养(37℃,8％co2,125rpm)16至18小时后，向其中添加150μl的expifectamine
tm 293增强剂1(cat.no.a14524,gibco)和1.5ml的expifectamine
tm 293增强剂2(cat.no.a14524,gibco)，随后悬浮培养5天。培养后，通过在4000rpm下离心20分钟去除细胞碎片，并且使上清液穿过0.22μm过滤器以被制备。制备100μl的蛋白质a树脂mabselect xtra(cat.no.17
‑
5269
‑
02,ge healthcare)用于每30ml的培养液，随后在1000rpm下离心2分钟以除去存储溶液，并且将获得的产物用400μl的蛋白质a结合缓冲液(cat.no.21007,pierce)洗涤3次。将蛋白质a树脂添加到制备的培养液中，并且在室温下旋转反应30分钟。将培养液与树脂的混合物放到pierce spin column snap
‑
cap(cat.no.69725,thermo)中，然后，使用qiavac 24plus(cat.no.19413,qiagen)真空歧管仅将树脂留在柱中。添加5ml的蛋白质a结合缓冲液以洗涤树脂，向其中加入200μl的蛋白质a洗脱缓冲液(cat.no.21009,pierce)。通过在室温下重悬2分钟使所得的物质反应，并且在1000rpm下离心1分钟，并且洗脱。通过添加2.5μl的1.5m tris
‑
hcl(ph 9.0)来中和每个洗脱液。进行4至6次洗脱，并且通过使用nanodrop 200c(thermo scientific)对每个级分定量。收集其中检测出蛋白质的级分，并且使用zeba spin desalting columns,7k mwco,5ml(cat.no.0089892,pierce)与pbs(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液进行交换。然后，在还原和非还原条件下进行蛋白质电泳(sds
‑
page)，以最终核实浓度定量和抗体状态，并且将抗体保持在4℃。
[0179]3‑
13：与克隆ms502的最终轻链可变区突变c2g4克隆结合的重链可变区突变抗体的igg的产生和纯化
[0180]
选择在轻链可变区突变中具有最佳亲和性测量值的c2g4，并且将其固定为轻链可变区的最终克隆。然后，为了结合、产生和纯化重链可变区突变抗体56、2
‑
30、2
‑
58、2
‑
73和2
‑
78，在转染前一天以2.5x106个细胞/ml的浓度孵育expi293f
tm
细胞。孵育(37℃,8％co2,125rpm)24小时后，添加expi293
tm
表达培养基(cat.no.a1435101,gibco)，以制备具有2.5x106个细胞/ml浓度的30ml的产物(存活率＝95％)。将30μg的dna(pciw
‑
ms502重链可变区突变抗体：15μg，pciw
‑
轻链可变区突变c2g4：15μg)稀释在optipro
tm sem培养基(cat.no.12309019,gibco)中，以得到1.5ml的总体积，并且在室温下反应5分钟。将1.5ml的optipro
tm sem培养基(cat.no.12309019,gibco)与80μl的expifectamine
tm 293试剂(cat.no.a14524,gibco)混合，使得总体积为1.5ml，并且在室温下反应5分钟。反应5分钟后，将1.5ml的稀释的dna与1.5ml的稀释的expifectamine
tm 293试剂彼此很好地混合，并且在室温下反应20至30分钟。在expi293f
tm
细胞中处理3ml的dna和expifectamine
tm 293试剂的混合物。悬浮培养(37℃,8％co2,125rpm)16至18小时后，向其中添加150μl的expifectamine
tm 293增强剂1(cat.no.a14524,gibco)和1.5ml的expifectamine
tm 293增
强剂2(cat.no.a14524,gibco)，随后悬浮培养5天。培养后，通过在4000rpm下离心20分钟去除细胞碎片，并且使上清液穿过0.22μm过滤器以被制备。制备100μl的蛋白质a树脂mabselect xtra(cat.no.17
‑
5269
‑
02,ge healthcare)用于每30ml的培养液，随后在1000rpm下离心2分钟以除去存储溶液，并且将获得的产物用400μl的蛋白质a结合缓冲液(cat.no.21007,pierce)洗涤3次。将蛋白质a树脂添加到制备的培养液中，并且在室温下旋转反应30分钟。将培养液与树脂的混合物放到pierce spin column snap
‑
cap(cat.no.69725,thermo)中，然后，使用qiavac 24plus(cat.no.19413,qiagen)真空歧管仅将树脂留在柱中。添加5ml的蛋白质a结合缓冲液以洗涤树脂，向其中加入200μl的蛋白质a洗脱缓冲液(cat.no.21009,pierce)。通过在室温下重悬2分钟使所得的物质反应，并且在1000rpm下离心1分钟，并且洗脱。通过添加2.5μl的1.5m tris
‑
hcl(ph 9.0)来中和每个洗脱液。进行4至6次洗脱，并且通过使用nanodrop 200c(thermo scientific)对每个级分定量。收集其中检测出蛋白质的级分，并且使用zeba spin desalting columns,7k mwco,5ml(cat.no.0089892,pierce)与pbs(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液进行交换。然后，在还原和非还原条件下进行蛋白质电泳(sds
‑
page)，以最终核实浓度定量和抗体状态，并且将抗体保持在4℃。
[0181]
【表15】
[0182][0183]
【表16】
[0184][0185]3‑
14：ms502重链可变区突变抗体以及c2g4与重链可变区突变抗体的结合对于msln抗原的定量结合力的测量
[0186]
通过使用biacore t
‑
200(ge healthcare,美国)生物传感器测量纯化的抗msln抗体即ms502克隆重链可变区突变抗体56、2
‑
30、2
‑
73、2
‑
78以及的c2g4轻链可变区与重链可变区突变抗体的结合抗体(包括56
‑
c2g4、2
‑
30
‑
c2g4、2
‑
73
‑
c2g4、2
‑
78
‑
c2g4)中的每个对于重组人间皮素(msln)的定量结合力(亲和性)。通过使用胺
‑
羧基反应将从hek293细胞纯化的msln(cat.no.3265
‑
ms,r&d systems，美国)固定到cm5芯片(ge healthcare,cat.no.br
‑
1005
‑
30)上，以满足200rmax。然后，允许用hbs
‑
ep缓冲液(10mm hepes,ph7.4,150mm nacl,3mm edta,0.005％表面活性剂p20)系列稀释的克隆56抗体、克隆2
‑
30抗体、克隆2
‑
73抗体、克隆2
‑
78、克隆56
‑
c2g4抗体、克隆2
‑
30
‑
c2g4抗体、克隆2
‑
73
‑
c2g4抗体和克隆2
‑
78
‑
c2g4抗体以0.078 nm至5 nm的浓度范围和30μl/min的流速流动，用于进行120秒的缔合和1800秒的解离。通过使10 mm甘氨酸
‑
hcl ph 1.5以30μl/min的流速流动30秒，诱导与msln结合的抗体的解离(表17)。通过使用biacore t
‑
200评估软件获得作为运动速度常数(k
on
和k
off
)和平衡解离常数(k
d
)的亲和性(表18)。
[0187]
【表17】
[0188]
sprbiacore t200芯片cm5运行缓冲液hbs
‑
ep ph7.4流速30μl/min缔合/解离时间120 sec/600 secigg浓度0.078～5nm,1/2系列稀释再生10mm甘氨酸
‑
hcl ph1.5,30 sec
[0189]
【表18】
[0190] konkoffkd561.26x1071.57x10
‑
31.25x10
‑
102
‑
301.92x1083.19x10
‑
21.66x10
‑
102
‑
781.50x1082.44x10
‑
31.63x10
‑
1156
‑
c2g46.61x1071.08x10
‑
21.63x10
‑
102
‑
30
‑
c2g41.15x1082.70x10
‑
22.34x10
‑
102
‑
73
‑
c2g48.98x1071.48x10
‑
21.65x10
‑
102
‑
78
‑
c2g42.10x1087.82x10
‑
33.72x10
‑
11
[0191]
实施例4：抗msln抗体结合至表达msln的癌细胞的facs分析
[0192]
为了评价源自免疫和合成文库的抗msln抗体是否与表达msln的细胞选择性地结合，在癌细胞系中测量msln的表达量，并且通过facs试验确认结合每个细胞的抗体。
[0193]4‑
1：表达msln的细胞系的构建
[0194]
通过使用jetpei(聚乙烯亚胺)转染系统(polyplus,101
‑
40)，将含有表达msln的单元和潮霉素抗性基因的质粒(pcmv/msln)递送到被证实为msln阴性细胞系的miapaca
‑
2胰腺癌细胞中(图4)。48小时后，用含有潮霉素b(200μg/ml)的培养液替换细胞培养液。每3天替换培养液时，获得了具有针对潮霉素的抗性的10个菌落，以通过蛋白质印迹法确认每个msln表达量。对于四种类型的胰腺癌细胞系(miapaca
‑
2、bxpc
‑
3、capan
‑
1、aspc
‑
1)和两种类型的间皮瘤细胞系(h28、h2452)，通过蛋白质印迹法通过使用抗msln抗体(#133489,abcam)确认细胞中的msln表达量。通过添加tryple express溶液分离培养细胞，并且将其保存在15ml管中，随后在2000rpm和室温下离心3分钟以轻轻倒出培养液，并且将获得的产物用100μl 1xsds
‑
page样品缓冲液(50mm tris(ph6.8),2％sds,100mm dtt(二硫苏糖醇),0.1％bpb(溴酚蓝),10％甘油)悬浮，并加热5分钟。将获得的产物离心以收集上清液，随后在4
‑
12％sds
‑
page中以20ma电泳约2小时，并且使用转移单元将分离的蛋白质转移至pvdf膜，然后，使用tris
‑
甘氨酸缓冲液(39mm甘氨酸,48mm tris,0.037％sds,20％甲醇)以300ma进行电泳约90分钟。通过使用tbs阻断溶液在室温下对蛋白质转移到其中的pvdf膜进行阻断1小时。用5％脱脂牛奶/1xtbst缓冲液将作为第一抗体的抗msln抗体(#133489,abcam)稀释2,000倍，并且在室温下反应约1小时，并且用1xtbst缓冲液每5分钟洗涤6次。用5％脱脂牛奶/1xtbst缓冲液将作为第二抗体的抗小鼠hrp(kpl,ma,美国)稀释20,000倍，并且反应30分钟，并且用1xtbst缓冲液每5分钟洗涤6次。然后通过显色反应溶液(ecl,amersham,uk)核实msln蛋白质条带。
[0195]
因此，如图5中所示，通过测量是否存在来自每个癌细胞系的具有70kda前体形式和具有40至50kda成熟形式的msln，证实了h28、miapaca
‑
2、bxpc
‑
3、capan
‑
1细胞系是msln阴性的，并且h226、h2452(h2052)、aspc
‑
1是msln阳性的。
[0196]4‑
2：表达msln的细胞系和表达msln的肿瘤细胞系中msln表达量的分析
[0197]
对于其中人工表达msln的细胞系miapaca
‑
msln，进行存在于细胞表面的msln的facs试验。通过添加tryple express溶液分离在培养皿中培养的待分析的细胞，并且将其保存在50ml管中，随后在2000rpm和室温下离心3分钟以轻轻倒出培养液，并且将获得的产物用pbs洗涤一次。将细胞用facs缓冲液悬浮，并且转移到圆底管，并且在2000rpm和室温下离心3分钟。弃置上清液，并且用facs缓冲液很好地使细胞松散，以具有4x105/ml的细胞密度。然后，在4℃下向其中加入1μg的候选抗体。1小时后，用facs缓冲液洗涤所得物质两次，并且对于每个样品添加1μl的量的山羊来源的抗人igg抗体(fitc junction)，以在4℃下结合30分钟。通过在2000rpm下离心3分钟收集细胞，并且添加500μl的固定缓冲液以重悬细胞，通过facs caiibur测量细胞(图6)。
[0198]4‑
3：抗msln抗体对于表达msln的细胞系的选择性结合的分析
[0199]
进行facs试验以评价抗msln抗体是否与过表达msln的细胞系(miapaca
‑
msln#2)选择性结合。通过以上实施例4
‑
2中所述的方法标记抗msln候选抗体，并且通过facs caiibur测量细胞(图7)
[0200]
进行facs试验以评价具有卓越的结合力的mi323、mi329、mi403和ms502候选抗体是否甚至与间质瘤(h226，h2052)和胰腺癌(aspc
‑
1)的细胞系msln很好地结合，并且将结果与mfi值比较。
[0201]
【表19】
[0202]
msln abmiapaca2h226aspc
‑
1h2052msln test
‑
ms502
‑
mi403
‑
mi323
‑
m1329
‑
morab
‑
bay94
‑
9343
‑

[0203]
因此，如图8和表19中所示，所有mi323、mi329、mi403和ms502候选抗体对于间皮瘤和胰腺癌细胞系的msln具有显著的结合力，虽然在结合程度上存在细微差异。特别是，mi323候选抗体具有卓越的结合方状况。
[0204]
此外，在过表达msln的miapaca
‑
msln#2细胞和不过表达msln的miapaca
‑
2中，评价了具有卓越的对于msln的结合状况的mi323候选抗体、具有biacore k
d
(koff/kon)值的不同图案的ms502候选抗体以及从ms502候选抗体产生的重链可变区突变2
‑
78
‑
c2g4候选抗体是否与表达msln的肿瘤细胞选择性结合。
[0205]
因此，如图9中所示，与miapaca
‑
2相比，mi323、ms502和2
‑
78
‑
c2g4候选抗体在过表达msln的miapaca
‑
msln#2细胞中具有卓越的结合状况。
[0206]
工业实用性
[0207]
根据本发明的与间皮素特异性结合的抗体具有对抗原的高亲和性和特异性，使得可有效用于癌症或肿瘤疾病的治疗和诊断。
[0208]
已经基于其具体特征详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些具体的技术只是优选的实施方案，因此本发明的范围不限于实施方案。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求和其等同物来定义。
[0209]
序列表文本文件
[0210]
所附电子文件。
[0211]
综上所述，本技术包括但不限于以下各项：
[0212]
1.一种与间皮素结合的抗体，所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含重链cdr，所述重链cdr包含：
[0213]
包含seq id no:9、15、21、27或59的氨基酸序列的重链cdr1；
[0214]
包含seq id no:10、16、22、28、60、65、71、75、80、84、121、122、123或125的氨基酸序列的重链cdr2；和
[0215]
包含seq id no:11、17、23、29、61、66、72、76、81、85、124或126的氨基酸序列的重链cdr3。
[0216]
2.一种与间皮素结合的抗体，所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含轻链cdr，所述轻链cdr包含：
[0217]
包含seq id no:12、18、24、30、62、67、70、77、86或117的氨基酸序列的轻链cdr1；
[0218]
包含seq id no:13、19、25、63、68、73、78或82的氨基酸序列的轻链cdr2；和
[0219]
包含seq id no:14、20、26、64、69、74、79、83、87、118、119或120的氨基酸序列的轻链cdr3。
[0220]
3.项1的抗体，其中所述重链可变区包含seq id no:1、3、5、7、46、48、51、53、55、57、112、113、114、115或116的氨基酸序列或者与其具有至少80％序列同源性的氨基酸序列。
[0221]
4.项1的抗体，其中所述轻链可变区包含seq id no:2、4、6、8、47、49、50、52、54、56、58、109、110或111的氨基酸序列或者与其具有至少80％序列同源性的氨基酸序列。
[0222]
5.一种与间皮素结合的抗体，所述抗体包含：
[0223]
包含seq id no:1、3、5、7、46、48、51、53、55、57、112、113、114、115或116的氨基酸序列的重链可变区；和
[0224]
包含seq id no:2、4、6、8、47、49、50、52、54、56、58、109、110或111的氨基酸序列的轻链可变区。
[0225]
6.一种编码根据项1至5中任一项的抗体的核酸。
[0226]
7.一种包含根据项6的核酸的载体。
[0227]
8.一种包含根据项7的载体的宿主细胞。
[0228]
9.一种制备根据项1至5中任一项的抗体的方法，所述方法包括通过培养根据项8的宿主细胞表达所述抗体。
[0229]
10.一种用于治疗癌症或肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含根据项1至5中任一项的抗体作为活性成分。